Summary
Microscopia time-lapse consente la visualizzazione dei processi di sviluppo. Crescita o deriva dei campioni durante l'acquisizione dell'immagine riduce la capacità di seguire con precisione e misurare i movimenti delle cellule durante lo sviluppo. Descriviamo l'uso di software di elaborazione di immagini open source per correggere tridimensionale deriva campione nel tempo.
Abstract
La generazione di quattro dimensioni (4D) dataset confocale; costituito da sequenze di immagini 3D nel tempo; fornisce un'eccellente metodologia per catturare comportamenti cellulari coinvolti nei processi di sviluppo. La possibilità di monitorare e seguire i movimenti delle cellule è limitata dai movimenti di esempio che si verificano a causa di deriva del campione o, in alcuni casi, la crescita durante l'acquisizione dell'immagine. Inseguimento cellule in dataset colpite da drift e / o la crescita sarà integrare questi movimenti in una qualsiasi analisi della posizione della cella. Ciò può provocare il movimento apparente strutture statiche all'interno del campione. Quindi prima di tracciamento delle cellule, la sua deriva campione deve essere corretto. Uso open source Fiji distribuzione 1 di ImageJ 2,3 e gli strumenti LOCI incorporati 4, abbiamo sviluppato il corretto 3D deriva plug-in per rimuovere movimento campione erronea in dataset confocale. Questo protocollo compensa in modo efficace per la traduzione campione o alterazioni po focalezione utilizzando fase correlazione registrare ogni time-point di una quadridimensionali dataset confocale, pur mantenendo la capacità di visualizzare e misurare i movimenti delle cellule nel corso prolungati esperimenti di time-lapse.
Introduction
Confocale è ampiamente usato in biologia cellulare e dello sviluppo di seguire i movimenti delle cellule e dei cambiamenti nella morfologia. Acquisizione di una serie di sezioni ottiche a diversi piani focali consente la generazione di un tridimensionale (3D) modello di un campione, che può essere esteso in quattro dimensioni (4D) creando una serie tempo-intervallo di set di dati 3D. La generazione di set di dati 4D permette la misurazione dettagliata dei movimenti delle cellule e dei comportamenti. In esperimenti di time-lapse a lungo termine è comune osservare il movimento del campione. Ciò può essere causato da lievi imprecisioni in fase di controllo hardware e le posizioni focali. Mentre in altri casi, la deriva è il risultato di movimenti indotti dalla crescita campione o flessibilità all'interno del mezzo di montaggio del campione. I metodi esistono per compensare o limitare questi movimenti compresi i miglioramenti ai sistemi di messa a fuoco hardware e una maggiore rigidità del mezzo di montaggio. Tuttavia, questi approcci non possono essere applicati in molti casi a causa del l'imaging set fino tenuta a fornire le condizioni adatte per il mantenimento e la crescita dei campioni. Esistono soluzioni software open source per la correzione del movimento in 2D nel corso del tempo, attraverso l'utilizzo delle StackReg e TurboReg (http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/) 5 plugins in ImageJ o Fiji, ma questi non possono essere applicate ai dataset 4D.
Per correggere la deriva del campione abbiamo sviluppato un plug-in (Correct deriva 3D) per utilizzare la piattaforma di imaging di elaborazione open-source, Fiji 1. Il nostro plug-in è in grado di eseguire fase di registrazione correlazione per correggere movimento che si verifica a causa di deriva campione tridimensionali esperimenti temporizzati. Correlazione di fase 6 è un metodo efficiente di calcolo per determinare traduzione tra immagini. Il plug-in qui descritto utilizza la libreria di fase-correlazione sviluppato da Preibisch et al. 7. In esperimenti multi-canale, il plug-in utilizza un canale di determinazionene la correzione richiesta. Questa correzione viene quindi applicata a tutti i canali supplementari conseguente registrazione del set di dati 4D.
Nel sistema modello zebrafish è possibile effettuare time-lapse imaging in un periodo di molte ore o anche diversi giorni 8. Un metodo comune per il montaggio del zebrafish è di incorporare l'embrione vivo anestetizzato in bassa agarosio punto di fusione (0,8-1,5%), limitando il suo movimento 9-11. Mentre il movimento è limitato crescita del campione si verifica ancora, con conseguente cellule all'interno del campo visivo posizione spostamento. Al fine di seguire il movimento delle cellule all'interno dell'embrione è necessario correggere prima per il movimento dell'intero campione. Questo protocollo è stato sviluppato con i campioni di zebrafish, ed è stato utilizzato per lo sviluppo di immagini somite 12, ma può essere applicato a qualsiasi confocale dataset 4D.
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Protocol
1. 4D Time-lapse esperimenti di imaging
Le impostazioni utilizzate per l'acquisizione di immagini variano a seconda del materiale utilizzato. La capacità di microscopia confocale a sezione otticamente un campione dipende da una serie di fattori: la lunghezza d'onda di eccitazione, dimensioni pinhole, apertura numerica dell'obiettivo, l'indice di rifrazione del campione e del mezzo in cui è incorporato il campione. La dimensione del foro stenopeico confocale selezionato determinerà lo spessore della sezione ottica raccolto. Un foro più piccolo produrrà una sezione ottica sottile aumentando la risoluzione asse z ma riducendo la quantità di luce catturata. Un foro più grande aumenta lo spessore della sezione ottica, riducendo la risoluzione asse z ma aumentando la quantità di luce catturata.
Altri fattori da considerare durante la raccolta dei dati 4D prima correzione includono:
- Ottimizzare la velocità di scansione per rimuovere, o limite, deriva durante la cattura di un singolo punto temporale. Pertanto il tempo impiegato per la raccolta di immagini dovrebbe essere una piccola frazione dell'intervallo tra punti temporali.
- Strutture perfettamente ripetitive, o griglie, non sono adatti come strutture per la registrazione in quanto non è possibile determinare la correzione richiesta. Perline casualmente distribuiti o strutture irregolari permetterà la registrazione univoca.
- Se si prevede di deriva, aumentare l'area di scansione e limiti fuoco superiore e inferiore per assicurare l'area di interesse rimane all'interno della serie di immagini.
- Oltre a garantire l'opportuno risoluzione spaziale per risolvere le strutture di interesse, impostare la frequenza di campionamento per fornire la risoluzione temporale per gli eventi dinamici in fase di studio.
Nota: Il tempo tra immagine punti temporali dovrebbe quindi essere almeno la metà del tempo-intervallo tra eventi che si ripetono regolarmente e diminuire per eventi irregolari.
2. Apertura del confocale Dataset
Il pacchetto open source Fiji è una distribuzione del programma ImageJ, che contiene i plug-in pre-installati per eseguire numerosi processi sui dati raccolti dagli esperimenti di microscopia. Il software fornisce facile plug-in aggiornamento architettura e include una copia del corretto 3D deriva plug-in utilizzato per questo protocollo. Il software supporta l'importazione di una vasta gamma di formati proprietari di immagine al microscopio attraverso l'utilizzo di Bio-formati di importazione plug-in di Open Microscopia Ambiente.
- Installare il programma Fiji (http://fiji.sc/Downloads).
- Caricare il set di dati acquisiti tramite il plugin Importatore LOCI Bio-formati.
- Se il dataset è maggiore rispetto alla memoria assegnata al programma, selezionare l'opzione "Utilizza l'opzione stack virtuale" all'interno della sezione gestione della memoria.
3. Correzione Drift di un oggetto 3D in Post Processing
Nel corso di un prolungato tempo-lapseesperimento di un campione può muoversi anche quando incorporato. Per correggere qualsiasi movimento e consentire gli eventi di migrazione impressi da analizzare, post-elaborazione delle immagini può essere effettuata. Tutta l'elaborazione dell'immagine postale deve essere chiaramente descritta nella metodologia di qualsiasi analisi derivata da questo lavoro.
- Una volta che il dataset è stato caricato, eseguire il corretto 3D plug deriva.
- Se ci sono canali di immagini multiple, selezionare il canale da utilizzare per registrare le immagini. Questo dovrebbe rappresentare idealmente una struttura statica all'interno del campione piuttosto che elementi migratori o mobili. Tuttavia, se ciò non è possibile il canale di minor movimento dovrebbe essere scelto.
- Se la RAM disponibile sul sistema utilizzato per questa analisi è inferiore a due volte la dimensione di dati originale, selezionare l'opzione stack virtuale uso. Questo memorizzare il HyperStack registrato come una sequenza di immagini, piuttosto che salvare il file RAM.
- Selezionare una cartella per il plug-in per singola uscita corretto imafile Ges. Verrà creato un file di immagine separato per ogni canale in ciascuna posizione z.
- Il plugin sarà quindi condurre un'analisi di correlazione di fase pair-wise tra ogni time-point per determinare la correzione richiesta che viene poi applicata al dataset.
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Representative Results
In zebrafish di sviluppo, le cellule muscolari veloci fondono in fibre multinucleate da 19 ore dopo la fecondazione (20 - fase somite) 13. Per visualizzare il movimento di nuclei e fusione di cellule muscolari noi svolte 4D confocale time-lapse utilizzando un ceppo transgenico che esprime la proteina fluorescente verde (GFP) sotto il controllo del promotore scheletrico α-actina di etichettare tutti del muscolo celle 14 e iniettato RNA codificante la proteina fluorescente rossa mCherry etichettato con una sequenza di localizzazione nucleare, etichettare nuclei. Embrioni transgenici iniettati sono stati montati in basso punto di fusione agarosio e una sequenza di immagini costituito da 71 sezioni ottiche catturati a 2,0 micron intervalli ogni 20 minuti su un periodo di tempo di 2 ore. Esempio di deriva di circa 7 micron è stato osservato nel corso dell'esperimento time-lapse, con conseguente sfocatura delle immagini sovrapposte (Figura 1A) e movimento apparente del NuclEI nel tempo (Figura 1B). Applicazione del plugin può essere visto comportare una sequenza immagine registrata (Figure 1C e 1D).
Figura 1: Il protocollo rettifica movimento campione durante l'acquisizione dell'immagine nello spazio tridimensionale immagine media proiezione di proiezioni di massima di ogni punto temporale del set di dati non corretti mostrando muscolo espressione GFP specifico (A) e sequenza di localizzazione nucleare fusa ad mCherry (B).. La portata di questo movimento si riduce la possibilità di monitorare i nuclei muscolari e fusion, e offuscamento dell'immagine GFP è evidente. Le immagini corrette risultanti sono mostrati in (C) e (D), dimostrando la registrazione del set di dati.
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Discussion
La nostra capacità di utilizzare software di post-elaborazione per correggere la deriva campione di set di dati derivati da estese time-lapse esperimenti di microscopia è limitato da una serie di fattori. La capacità di discernere deriva contro movimento migratorio di un campione dipende marcatori cellulari utilizzati. Marcatori cellulari che sono sia ampiamente espresse all'interno di un campione o non sono coinvolti in eventi migratori durante l'acquisizione dell'immagine garantiscono la migliore fonte per la correzione della deriva. Il plugin utilizza un singolo canale per registrare il movimento tra i punti temporali e poi applica questa registrazione di tutti i canali dell'immagine raccolto. Pertanto, può essere vantaggioso utilizzare due marcatori fluorescenti in campioni di interesse. Un marcatore per le cellule o strutture che vengono registrate ed un secondo marcatore, a strutture di etichette che non si prevede di migrare a parte deriva durante l'esperimento. La registrazione può essere effettuata su serie di dati con un singolo canale, ma in tal caso la maggioranza dei thdati e deve essere ferma nell'immagine con solo una piccola parte dovrebbe muoversi. Se una grande proporzione della immagine si sposta tra punti temporali che il movimento sarà corretto per, in aggiunta a qualsiasi deriva, con una conseguente riduzione del movimento misurato.
Il protocollo stabilito in questo manoscritto presuppone che vi sia alcun movimento tra la prima e l'ultima sezione ottica di ciascun punto temporale. Non è possibile correggere la deriva che possono verificarsi all'interno di un singolo punto temporale senza fare ipotesi circa la forma dell'oggetto da sottoporre a scansione. Idealmente i parametri sperimentali utilizzati per la raccolta di immagini limiterebbero il potenziale per il movimento avvenga entro ogni time-point catturato. Così il tempo impiegato per catturare la sequenza di immagini deve essere il più breve possibile. Il tempo totale di una singola acquisizione time-point dovrebbe essere una piccola frazione dell'intervallo tra punti temporali.
Il metodo di correlazione di fase, checostituisce la base della procedura, determina la definizione necessaria per allineare un punto temporale con il successivo. È importante sottolineare che solo i movimenti traslatori sono corretti e quindi la rotazione attorno ad ogni asse (x, y, z) non saranno corretti. Per molte delle possibili cause di deriva, come deriva focale, variazione della posizione fase, traduzione descriverà perfettamente il movimento. Tuttavia, se il movimento di rotazione esempio include una traduzione non sarà in grado di descrivere la correzione necessaria. La fase di correlazione sarà ancora permettono le posizioni più simili a determinare e utilizzare la migliore traduzione, con conseguente qualche miglioramento nella registrazione, ma se ci fossero significative metodologie di rotazione alternativi che consentono l'utilizzo dei punti di riferimento nell'immagine, sarebbe più adatto.
Il plug-in è stato progettato per funzionare con pile virtuali che consentono la visualizzazione e la registrazione di file di dimensioni superiori alla memoria disponibile. I file sono read dal disco come richiesto per l'analisi e risultati della registrazione memorizzati sul disco fisso come una sequenza di immagini, anziché un singolo file immagine. Questo consente l'utilizzo di un computer con meno RAM rispetto alla dimensione totale del set di dati, la dimensione massima del set di dati, invece di essere limitato dallo spazio disponibile sul disco rigido. Come ogni time-point è allineato con il successivo punto temporale il computer deve disporre di memoria sufficiente per aprire due punti temporali e completare la fase di analisi di correlazione. La possibilità di eseguire la registrazione e analisi avanzate di correzione del campione utilizzando il software liberamente disponibile, su sistemi con risorse limitate, si apre la possibilità di sofisticati post-processing ad un pubblico scientifico molto più ampio.
Abbiamo descritto l'uso del protocollo per correggere la deriva in dataset confocale zebrafish ma l'approccio può essere applicato ai risultati ottenuti utilizzando qualsiasi tipo di campione o sistema di imaging 3D. Di conseguenza in futuro questa tecnica potrebbe anche essere unapplied di set di dati ottenuti con la risonanza magnetica, tomografia ottica di proiezione, x-ray tomografia computerizzata, e microscopia foglio leggero, e altre tecniche di imaging emergenti.
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Disclosures
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.
Acknowledgments
Vorremmo ringraziare Gaby Martins e gli organizzatori del workshop EMBO2010 3D Developmental Imaging dove questo lavoro è iniziato e tutti i collaboratori ai progetti Fiji e ImageJ.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate (Tricaine) | Sigma-Aldrich | A5040 | |
| Low gelling temperature agarose | Sigma-Aldrich | A9414-25G | |
| Dumont #4 Forceps | Electron Microscopy Sciences | 0208-4-PO | |
| Disposable 3 ml graduated | Samco | 212 | |
| Polyethylene transfer pipette | |||
| 9cm bacterial grade Petri dishes | Greiner Bio One | 632180 | |
| Fluorinated ethylene propylene (FEP) tubing | Bola | S1815-04 | |
| Zeiss LSM-710 Confocal microscope | Zeiss | ||
| W Plan-Apochromat 20x/1.0 DIC Objective | Zeiss | 421452-9600-000 |
References
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