Summary
Покадровый микроскопия позволяет визуализировать процессы развития. Рост или дрейф образцов во время получения изображения снижает способность точно следовать и измерения движения клетки в процессе разработки. Мы описываем использование программного обеспечения для обработки изображений с открытым исходным кодом для коррекции трехмерной образца дрейфа во времени.
Abstract
Поколение четырехмерных (4D) конфокальной данных; , состоящий из последовательностей изображений 3D в течение долгого времени; обеспечивает отличную методику, чтобы захватить клеточные поведения, связанные с процессами развития. Возможность отслеживать и следовать клеточные движения ограничена образцов движений, которые происходят из-за дрейфа образца или, в некоторых случаях, рост в течение получения изображений. Отслеживание клетки в наборах данных, пострадавших от дрейфа и / или роста будет включать эти движения в любом анализе положения клеток. Это может привести к видимым движением статических структур в образце. Поэтому до отслеживания клеток, любой образец дрейф должно быть исправлено. Использование с открытым исходным кодом Фиджи распределение 1 из ImageJ 2,3 и включены локусов инструменты 4, мы разработали правильный 3D дрейфа плагин для удаления ошибочной движение образца в конфокальной данных. Этот протокол эффективно компенсирует перевода образца или изменением фокусного роsition, используя корреляцию фаз для регистрации каждого тайм-точку четырехмерного конфокальной наборов данных, сохраняя при этом способность визуализировать и измерять движения клетки в течение длительного экспериментов покадровой.
Introduction
Конфокальной визуализации широко используется в клеточной и эволюционной биологии следовать клеточные движения и изменения в морфологии. Захват серию оптических срезов на разных фокальных плоскостях позволяет генерировать трехмерной (3D) модели образца, который затем может быть продлен на четыре измерениях (4D) путем создания покадровой серию 3D данных. Поколение 4D наборов данных позволяет детальное измерение движений и поведения клеток. В долгосрочных покадровой экспериментов он является общим для наблюдения движения образца. Это может быть вызвано небольшими неточностями в контролирующей стадии аппаратной и координационных позиций. В то время как в других случаях, дрейф является результатом движений, вызванных ростом образца или гибкости в образце монтажной СМИ. Существуют методы, чтобы компенсировать или ограничивать эти движения, включая усовершенствование системы фокусировки аппаратных и повышенной жесткости монтажной среды. Однако эти подходы не могут быть применены во многих случаях из-за формирования изображения сдр. до обязаны предоставлять благоприятные условия для поддержания и роста образцов. Программного обеспечения с открытым исходным кодом решения существуют для коррекции движения в 2D с течением времени, через использование StackReg и TurboReg (http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/) 5 плагинов в ImageJ или Фиджи, но они не могут применяться к 4D данных.
Для коррекции образца дрейфа мы разработали плагин (Правильное 3D дрейф), чтобы использовать с открытым исходным кодом визуализации обработки платформу, Фиджи 1. Наш плагин способен выполнять фазовой корреляции регистрацию исправить движение, которое происходит в результате выборки дрейфа в трехмерных экспериментов покадровой. Фаза корреляция 6 является вычислительная эффективный метод, чтобы определить различия между изображениями. Плагин описано здесь использует фаза-корреляции библиотеку, разработанную Preibisch др.. 7. В экспериментах многоканальных, плагин использует один канал, чтобы детерпе требуется коррекция. Эта поправка затем применяется к любым дополнительным каналам в результате чего регистрации набора данных 4D.
В данио модели системы можно осуществлять покадровой обработки изображений в течение многих часов или даже нескольких дней 8. Распространенным методом для монтажа данио является внедрение анестезированной живой эмбрион в низкой температурой плавления агарозы (0,8-1,5%), ограничивая свое движение 9-11. В то время как движение ограничено рост образца все еще имеет место, в результате чего клеток в поле зрения меняющихся положение. Для того чтобы проследить движение клеток в эмбрионе, необходимо сначала коррекции движения всей выборки. Этот протокол был разработан с данио образцов, и были использованы в разработке изображение сомитов 12, но может быть применен к любой 4D конфокальной данных.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. 4D Покадровый Визуализация Эксперименты
Используемые для получения изображений настройки будут отличаться в зависимости от используемого оборудования. Способность конфокальной микроскопии в оптически секции образца зависит от ряда факторов: длина волны возбуждения, отверстие размера, числовой апертурой объектива, показателя преломления образца и среды, в которой образец встроенной. Размер конфокальной точечным выбранной будет определять толщину оптической части собраны. Меньшее отверстие будет производить более тонкую секцию оптического увеличения разрешения Z-оси, но уменьшая количество света, захваченное. Большее отверстие будет увеличивать толщину оптической части, уменьшая разрешение Z-оси, но растет количество света, захваченное.
Дополнительные факторы, которые следует учитывать при сборе 4D данных до коррекции включают в себя:
- Оптимизация скорости сканирования для удаления или предел, дрейф ðо время захвата одного момента времени. Поэтому время, необходимое для сбора изображений должна быть небольшая часть интервала между временных точках.
- Прекрасно повторяющиеся структуры, или решетки, не пригодны в качестве структур для регистрации, как это не представляется возможным определить требуемую коррекцию. Случайно распределенных шарики или неровные структуры позволит однозначно регистрацию.
- Если дрейф ожидается, увеличить площадь сканирования и верхний и нижний пределы фокус в целях обеспечения сферой интересов остается в стеке изображения.
- В дополнение к обеспечению этом есть соответствующая пространственное разрешение, чтобы решить эти структуры интересов, установить частоту дискретизации, чтобы обеспечить временное разрешение для динамических событий изучаются.
Примечание: В связи с этим время между изображением временных точках должно быть не менее половины времени интервал между регулярными повторяющихся событий и уменьшить для нерегулярных событий.
2. Открытие конфокальной Dataset
С открытым исходным кодом пакет Фиджи является распределение программы ImageJ, который содержит предварительно установленные плагины для выполнения многочисленных процессов на данных, собранных от микроскопических экспериментов. Программное обеспечение обеспечивает более легкий архитектуру обновления плагина и включает в себя копию правильном 3D дрейфа плагина, используемого для этого протокола. Программное обеспечение поддерживает импорт широкий спектр собственных форматов микроскопии изображения за счет использования био-форматы импорта плагина в открытом Микроскопия среды.
- Установите программу Фиджи (http://fiji.sc/Downloads).
- Загрузите приобретенный набор данных с помощью плагина Импортер LOCI Био-форматы.
- Если набор данных больше, чем памяти, выделенной для программы, выберите "Использовать опцию виртуального стека" в секции управления памяти.
3. Коррекция Drift 3D-объекта в Постобработка
В ходе длительного покадровойэкспериментировать образец может двигаться даже при его внедрении. Чтобы исправить любое движение и позволить миграционные события распечатанных быть проанализированы, после обработки изображений может быть выполнена. Вся обработка сообщение Изображение должно быть четко описаны в методологии любого анализа, полученных от этой работы.
- После того, как набор данных загружается, запустите Правильное 3D плагин дрейфа.
- При наличии нескольких каналов изображения, выберите канал, который будет использоваться для регистрации изображения. Это в идеале должны представлять статическую структуру в образце, а не каких-либо миграционных или подвижных элементов. Однако, если это невозможно канал с наименьшим движения должны быть выбраны.
- Если свободной оперативной памяти в системе, используемой для анализа меньше в два раза больше первоначального набора данных, выберите опцию использовать виртуальные стека. Это будет хранить зарегистрированный HyperStack в виде последовательности изображений, а не сохранять файл в ОЗУ.
- Выберите папку для плагина для вывода человека исправлены ИМАGES файлы. Отдельный файл изображения будет создан для каждого канала в каждой позиции г.
- Модуль будет проводить фазовый анализ корреляции парного между каждой временной точке, чтобы определить требуемую коррекцию который затем применяется к набору данных.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
В развивающихся данио, быстрые мышечные клетки сливаются в многоядерных волокон от 19 часов после оплодотворения (20 - сомитов) 13. Для того чтобы визуализировать движение ядер и слияние мышечных клеток мы проведенных 4D конфокальной микроскопии покадровой использованием трансгенного штамма, который выражает зеленый флуоресцентный белок (GFP) под контролем скелетной α-актин промотора маркировать все мышцы клетки 14 и вводят РНК, кодирующей красный флуоресцентный белок mCherry с меткой последовательности ядерной локализации, для обозначения ядра. Введенный трансгенные эмбрионы были установлены в агарозе с низкой точкой плавления и последовательности изображений, состоящей из 71 оптических секций, захваченных с интервалом 2,0 мкм каждые 20 минут в течение 2 часов периода времени. Пример дрейф примерно 7 мкм наблюдалось в течение эксперимента покадровой, в результате размывания перекрывающихся изображений (фиг. 1а) и движению одной нукле течением времени (фиг.1В). Применение плагин можно увидеть, приведет к зарегистрированной последовательности изображений (фиг. 1C и 1D).
Рисунок 1: Протокол выпрямляет движение образца во время получения изображения в трехмерном пространстве Средний проекция изображения максимальных проекций от каждой временной точке без коррекции набора данных, показывая мышц конкретное выражение GFP (А) и последовательность ядерной локализации, слитый с mCherry (B).. Степень этого движения снижает возможность отслеживать ядра мышц и слияние, и размывание GFP изображения очевидна. Полученные исправленные изображения показаны на (С) и (D), что свидетельствует о регистрацию данных.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Наша способность использовать программное обеспечение постобработки исправить образец дрейф наборов данных, полученных из расширенных покадровой экспериментов микроскопии ограничивается рядом факторов. Способность различать дрейф в зависимости от миграционного движения образца зависит от клеточных маркеров, используемых. Сотовые маркеры, которые либо широко выраженные в образце или не участвующие в миграционных событий во время получения изображения обеспечивают лучший источник для коррекции дрейфа. Модуль использует один канал, чтобы зарегистрировать движение между временных точках, а затем применяет эту регистрацию для всех каналов изображения, собранными. Таким образом, может быть предпочтительным использование двух флуоресцентных маркеров в образцах, представляющих интерес. Один маркер для клеток или структур, которые будут отслеживаться и второй маркер, к структурам этикеток, которые не ожидается миграции кроме дрейфа в ходе эксперимента. Регистрация может быть проведена на наборов данных с одного канала, но если это так большинство гое данные должны быть стационарным на изображении с лишь небольшая часть будет меняться. Если большая часть изображения перемещается между временных точках, что движение будет исправлено в течение, в дополнение к любой дрейф, что приводит к снижению в движении измеряется.
Протокол основан в этой рукописи предполагает, что нет никакого движения между первой и последней оптической части каждого отдельного момента времени. Это не возможно для коррекции дрейфа, которые могут возникнуть в пределах одной временной точке, не делая предположений о форме объекта сканирования. В идеале экспериментальные параметры, используемые для сбора изображений будет ограничивать потенциал движение происходит в каждой временной точке захваченного. Таким образом, время, затраченное на захват последовательность изображений должны быть как можно короче. Общее время одного приобретения временной точке должна быть небольшая часть интервала между временных точках.
Корреляция фазовый метод, которыйформирует основу процедуры, определяет перевод, необходимое для приведения один временной точке с другой. Важно только трансляционные движения с поправкой на и поэтому вращение вокруг любой оси (х, у, г) не будут исправлены. Для многих из возможных причин дрейфа, таких как фокусное дрейфа, вариации позиции этап, перевод будет прекрасно описывают движение. Тем не менее, если движение выборка включает вращение перевод не сможет описать необходимую коррекцию. Фаза-корреляция все же позволит наиболее близкие позиции, которые будут определены и использовать лучший перевод, в результате чего на некоторое улучшение регистрации, но если существуют значительные вращения альтернативные методики, позволяющие использование памятников в изображении, будет более подходящим.
Плагин был разработан, чтобы работать с виртуальными стеков позволяет просмотр и регистрация файлов размером более доступной памяти. Файлы REAг с диска по мере необходимости для анализа и результатов регистрации сохранены на диске в виде последовательности изображений, а не одного файла изображения. Это позволяет использовать компьютер с меньшим объемом памяти, чем общий размер набора данных, максимальный размер блока данных, а не ограничиваясь хард доступного дискового пространства. Как каждый раз точка совмещена с последующей временной точке компьютер должен иметь достаточное количество памяти, доступной для открытия двух временных точках и завершить этап корреляционного анализа. Возможность выполнять расширенный учет и анализ коррекции выборки с использованием свободно распространяемого программного обеспечения, на системах с ограниченными ресурсами, открывает возможности сложной постобработки к гораздо более широкой научной аудитории.
Мы описали использование протокола исправить дрейф в данио конфокальной наборов данных, но этот подход может быть применен к результатам, полученным с помощью любого типа образца или системы визуализации 3D. В результате в будущем этот метод может быть такжеpplied для наборов данных, полученных с помощью магнитно-резонансной томографии, оптической проекционной томографии, рентгеновской компьютерной томографии и света листового микроскопии и других развивающихся методов визуализации.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют, что они не имеют конкурирующие финансовые интересы.
Acknowledgments
Мы хотели бы поблагодарить Gaby Мартинс и организаторов семинара EMBO2010 3D Развивающие изображениями, где началась эта работа и все из авторов проектов Фиджи и ImageJ.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate (Tricaine) | Sigma-Aldrich | A5040 | |
| Low gelling temperature agarose | Sigma-Aldrich | A9414-25G | |
| Dumont #4 Forceps | Electron Microscopy Sciences | 0208-4-PO | |
| Disposable 3 ml graduated | Samco | 212 | |
| Polyethylene transfer pipette | |||
| 9cm bacterial grade Petri dishes | Greiner Bio One | 632180 | |
| Fluorinated ethylene propylene (FEP) tubing | Bola | S1815-04 | |
| Zeiss LSM-710 Confocal microscope | Zeiss | ||
| W Plan-Apochromat 20x/1.0 DIC Objective | Zeiss | 421452-9600-000 |
References
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Abramoff, M. D., Magalhaes, P. J., Ram, S. J. Image Processing with ImageJ. Biophotonics International. 11 (7), 42-42 (2004).
- Collins, T. J. ImageJ for Microscopy. BioTechniques. 43 (S1), 25-30 (2007).
- Linkert, M., et al. Metadata matters: access to image data in the real world. The Journal of Cell Biology. 189 (5), 777-782 (2010).
- Thévenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. A pyramid approach to subpixel registration based on intensity. IEEE transactions on image processing : a publication of the IEEE Signal Processing Society. 7 (1), 27-41 (1998).
- Kuglin, C. D., Hines, D. C. The phase correlation image alignment method. Proceedings of the IEEE, International Conference on Cybernetics and Society. , 163-165 (1975).
- Preibisch, S., Saalfeld, S., Tomancak, P. Globally optimal stitching of tiled 3D microscopic image acquisitions. Bioinformatics. 25 (11), Oxford, England. 1463-1465 (2009).
- Kaufmann, A., Mickoleit, M., Weber, M., Huisken, J. Multilayer mounting enables long-term imaging of zebrafish development in a light sheet microscope. Development. 139 (17), Cambridge, England. 3242-3247 (2012).
- Andersen, E., Asuri, N., Clay, M., Halloran, M. Live imaging of cell motility and actin cytoskeleton of individual neurons and neural crest cells in zebrafish embryos. J VIs. Exp. (36), (2010).
- Eisenhoffer, G. T., Rosenblatt, J. Live imaging of cell extrusion from the epidermis of developing zebrafish. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (52), (2011).
- Benard, E. L., vander Sar, A. M., Ellett, F., Lieschke, G. J., Spaink, H. P., Meijer, A. H. Infection of zebrafish embryos with intracellular bacterial pathogens. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (61), (2012).
- Nguyen-Chi, M. E., et al. Morphogenesis and Cell Fate Determination within the Adaxial Cell Equivalence Group of the Zebrafish Myotome. PLoS Genetics. 8 (10), (2012).
- Moore, C. A., Parkin, C. A., Bidet, Y., Ingham, P. W. A role for the Myoblast city homologues Dock1 and Dock5 and the adaptor proteins Crk and Crk-like in zebrafish myoblast fusion. Development. 134 (17), Cambridge, England. 3145-3153 (2007).
- Higashijima, S., Okamoto, H., Ueno, N., Hotta, Y., Eguchi, G. High-frequency generation of transgenic zebrafish which reliably express GFP in whole muscles or the whole body by using promoters of zebrafish origin. Developmental Biology. 192 (2), 289-299 (1997).
