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Biology

Dissezione dei Published: March 4, 2014 doi: 10.3791/51118
Automatic Translation
1,2,3,4, 1,2,3,4
1Institut Curie, Centre Universitaire, 2Université Paris Sud, Centre Universitaire, 3CNRS UMR 3347, Centre Universitaire, 4INSERM U1021, Centre Universitaire

Summary

Questo protocollo descrive come sezionare premigratory cresta neurale cranica (NC) da Xenopus laevis neurulas. Tali espianti possono essere placcati in fibronectina e coltivate in vitro, o innestate di nuovo in embrioni di accoglienza. Questa tecnica consente di studiare i meccanismi di NC epitelio a mesenchima transizione, migrazione e differenziazione.

Abstract

La cresta neurale (NC) è una popolazione cellulare dorsale tubo neurale transitoria che subisce una transizione epitelio-to-mesenchima (EMT) alla fine di neurulazione, migra verso estesamente vari organi, e si differenzia in molti tipi di derivati ​​(neuroni, glia, cartilagine e osso, le cellule pigmentate ed endocrine). In questo protocollo, si descrive come sezionare il premigratory cranica NC da Xenopus laevis embrioni, al fine di studiare lo sviluppo NC in vivo e in vitro. Il modello di rana offre molti vantaggi per studiare lo sviluppo precoce; lotti abbondanti sono disponibili, gli embrioni si sviluppano rapidamente, il guadagno in vivo e la perdita di strategie funzionali consentono la manipolazione dell'espressione genica prima di NC dissezione del donatore e / o embrioni di accoglienza. Gli espianti NC possono essere piastrate su fibronectina e utilizzati per studi in vitro. Essi possono essere coltivate per diversi giorni in un mezzo definito privo di siero. Abbiamo anche descritto come innestare espianti NC indietroin embrioni di accoglienza per lo studio della migrazione NC e la differenziazione in vivo.

Introduction

La cresta neurale (NC) è una popolazione di cellule embrionali transitoria che emerge dal tubo neurale a fine neurulazione negli embrioni dei vertebrati. Gli eventi di segnalazione e genetici che controllano specifiche NC iniziano già nel gastrulazione. La NC è specificato al confine tra la neurale e ectoderma neurale non da segnali dai tessuti dorsali circostanti. Alla fine del neurulazione, celle NC subiscono una transizione epitelio-to-mesenchima (EMT) e migrano ampiamente nell'embrione seguendo percorsi stereotipati rispondendo al circostante spunti guida. Una volta che hanno raggiunto la loro destinazione finale, si differenziano in una vasta gamma di derivati, ad esempio, i neuroni, glia, ossa, cartilagine e cellule pigmentate 1-5. A causa del loro contributo a molti tipi di cellule e tessuti embrionali, difetti in ogni fase di sviluppo celle NC, dalla induzione alla differenziazione finale, può causare sindromi congenite denominate neurocristopathies 6. Emanipolazione Xperimental del CN ​​sviluppare in fasi diverse - specifica, EMT, migrazione e differenziamento - permetterà di migliorare la nostra comprensione di neurocristopathies e permettere la progettazione di potenziali strategie terapeutiche.

L'embrione laevis Xenopus è un modello di scelta per studiare lo sviluppo NC. Un gran numero di embrioni sono facili da ottenere, e la fecondazione esterna dà accesso alle prime fasi di sviluppo. Molti strumenti sono a disposizione per manipolare sperimentalmente X. laevis sviluppo embrionale. Gene guadagno-di-funzione e atterramento sono facili da eseguire da microinjecting singole cellule dei primi blastulas. Tessuti embrionali possono essere tagliati per riassociazione in vitro 7-11 o saggi di back-innesto 12,13.

In questo protocollo, si descrive come sezionare fuori premigratory cranica NC in X. laevis neurulas fine, prima della migrazione. Tali espianti possono essere coltivate su fibronectina-coated piastre per studiare la migrazione e la differenziazione in vitro controllati in condizioni sperimentali. Espianti NC possono anche essere innestati in normali o manipolato gli embrioni di accoglienza per studiare la loro migrazione e differenziamento in vivo.

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Protocol

Gli esperimenti sono conformi alla normativa nazionale ed europea sulla protezione degli animali utilizzati a fini scientifici e con i principi sanciti a livello internazionale di sostituzione, riduzione e perfezionamento.

1. Preparazione di piatti fibronectina rivestite 14

  1. Pipettare 500 ml di 10 mg / ml grado fibronectina cultura diluito in 1x tampone fosfato (PBS) in un piatto di plastica standard di Petri (Ø 40 x 11 mm). Incubare a 37 ° C per 1 ora. Nota: se si utilizza piatti di vetro o vetrini per l'imaging successiva, utilizzare un / soluzione fibronectina ml 100 mg.
  2. Lavare tre volte con PBS 1x.
  3. Sostituire PBS con 500 ml di 1x PBS/0.1% di sieroalbumina bovina (BSA). Incubare a 37 ° C per 30 min.
  4. Lavare tre volte con PBS 1x.
  5. Riempire con 1x PBS e conservare a 4 ° C fino all'uso (di solito per 24-48 ore).

2. La dissezione degli espianti NC

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  • Preparare 3/4 Normale Anfibio Medium (NAM) (110 mM NaCl, 2 mM KCl, 1 mM Ca (NO3) 2, 1 MgSO mm 4, 0.1 mM EDTA, 1 NaHCO mm 3, 0.2x PBS, 50 mg / ml gentamicina 10,15). Non tenere più di 1 settimana per la dissezione, conservare a 4 ° C. NAM Older può essere utilizzato per la preparazione di piatti dissezione agarosio rivestite (in basso).
  • Preparare 60 millimetri piastre Petri per la dissezione, rivestiti con 10 ml di 2% agarosio in 3/4 NAM.
  • Raccolte strumenti di dissezione: pipette Pasteur in plastica, un perno insetto migliore montato su supporto del perno (vedi tabella materiali per riferimento), un "coltello sopracciglio" (fatta con capelli sopracciglio inclusi in paraffina sulla punta di una pipetta Pasteur di vetro 16), due belle Pinza per dissezione, P1000 pipetta e suggerimenti, uno stereoscopio binocolo con ingrandimento 8-40X a 50, una sorgente di luce brillante con fibre ottiche e guide. Tutti gli strumenti di dissezione devono essere tenuti puliti, dopo ogni esperimento, sciacquare due volte con acqua distillata, una volta with 100% di etanolo e lasciare asciugare. Conservare lontano dalla polvere.
  • Compila il piatto dissezione con NAM fresco quasi al top.
  • Ottenere X. laevis embrioni secondo procedure standard 10 e li invecchiare fino a raggiungere neurula fase 16 (vedere Nieuwkoop e Faber tabella di sviluppo 17).
  • Posizionare fase 16 embrioni nel piatto dissezione con il pipetta Pasteur di plastica.
  • Eseguire tutti i passaggi successivi sotto l'ambito binoculare. Rimuovere la membrana vitellina con due coppie di pinze. Fare attenzione a non danneggiare la parte dorsale degli embrioni.
  • Attendere fino a quando gli embrioni hanno raggiunto la fase 17 per iniziare la dissezione. Fase 17 è corretto poiché la cresta neurale è chiaramente distingue dal tubo neurale, in contrasto con le fasi precedenti. Dopo la tappa 17, NC inizia la migrazione e mescolanza con mesenchima circostante.
  • Scavare un piccolo foro nel agarosio con una pinza per fare una nicchia per gli embrioni per mantenereloro durante la dissezione. Posizionare un embrione dorsale verso l'alto. Nota: modellare l'argilla può essere utilizzato per mantenere gli embrioni invece scavando un buco nel agarosio.
  • Fare un'incisione nella parte laterale della piega neurale anteriore con il coltello sopracciglio e il perno insetti. Fare attenzione a non andare troppo in profondità l'embrione: lo scopo di tagliare 2-3 strati di cellule (mai raggiungere il profondo come il archenteron!). Durante l'intero processo di dissezione, non permettono ai tessuti dissezionati di entrare in contatto con l'interfaccia aria-liquido dal X. tessuti embrionali laevis sono lisate mediante tensione superficiale.
  • Fare una seconda incisione parallela nella parte più dorsale della piega neurale con gli stessi strumenti.
  • Se necessario, ruotare il piatto di circa 90 °. Effettuare una terza incisione perpendicolare con il coltello sopracciglio e il perno insetto, sul lato posteriore delle prime due incisioni. La NC è una massa densa di cellule sotto lo strato esterno pigmentato della ectoderma, lateraleal tubo neurale.
  • Utilizzare la punta del coltello sopracciglio per staccare lo strato pigmentato ectoderm dal sottostante, NC, a partire dal terzo bordo incisione.
  • Utilizzare il lato del coltello sopracciglio per staccare il tessuto NC partire dal terzo incisione. Il tessuto NC è piuttosto grigiastro, mentre il mesoderma cefalico sottostante è bianco. Separare con attenzione il NC dal mesoderma.
  • Staccare il tessuto NC anteriormente dalla vescicola ottica, e tagliare a questo livello per liberare l'espianto. Come controllo per i primi esperimenti, controllando l'espressione snail2 (un marcatore canonico NC) in alcuni espianti l'ibridazione in situ è raccomandato.

    • 3. Espianti placcatura su fibronectina

    1. Inserire nel piatto fibronectina rivestite con Modified Danilchick Medium (MDM, NaCl 53 mM, Na2CO 3 5 mm, K gluconato 4,5 mm, Na gluconato 32 mm, MgSO 4 1 mM, CaCl2 1 mM, BSA 0,1%, regolare il pH a 8,3 con 1 M Bicine
    2. Trasferire gli espianti nel piatto fibronectina rivestite con una pipetta P1000. Non lasciare mai che gli espianti di toccare l'interfaccia aria-liquido. Primo, pipettare po 'di liquido nella punta, poi gli espianti, poi alcuni di nuovo liquido. Non lasciare che l'aria nella punta durante il trasferimento espianti nel piatto fibronectina rivestite. Una volta che la punta è all'interno del liquido del piatto fibronectina rivestite, lasciare che gli espianti lentamente scendono per gravità, o spingere molto delicatamente. Evitare di espellere gli espianti troppo veloce.
    3. Mettere 10-30 espianti nel piatto con il coltello sopracciglio. Evitare i lati del piatto, che non sono adeguate per l'imaging successiva.
    4. Cercate di non spostare la parabola fino a quando gli espianti hanno attaccato la fibronectina (ci vogliono circa 15-30 min). Se necessario, spostare il piatto con molta attenzione.
    5. Porre la capsula in un incubatore refrigerato (tra 15-20 ° C, per la tabella delle temperature vedi 17). Quando posto a 15 ° C, le cellule are di solito la migrazione in modo efficiente e di scattering, dopo 6 ore di incubazione (questa tempistica può variare tra esperimenti).

    4. L'innesto espianti in embrioni Host

    1. Tagliare un bel vetrino di vetro in pezzi molto piccoli che utilizzano pinze grossolani. Le dimensioni dei pezzi dovrebbe essere di circa 1,5 mm 2. Immergere i pezzi in una capsula di Petri contenente tre quarti NAM o PBS usando le pinze.
    2. Preparazione dell'embrione ospitante: sezionare l'ospite NC 3/4 NAM come descritto al punto 3), con particolare attenzione a non danneggiare l'embrione di accoglienza durante la rimozione della membrana vitellina e sviscerare il NC. La tensione del tessuto tende ad aumentare la dimensione dell'ablazione: lasciare l'embrione ospite guar parzialmente mentre sezionare l'embrione donatore.
    3. In un altro piatto agarosio rivestite o in un'altra parte dello stesso piatto, sezionare l'espianto NC dall'embrione donatore come descritto nel protocollo 3. Trasferire l'innesto NC nella capsula contenente l'host con cura, come descritto inProtocollo 3.
    4. Porre immediatamente l'espianto NC sulla zona ablazione host utilizzando una pinza. L'espianto deve allegare parzialmente. Mettere un pezzo di vetro coprioggetto sul embrione innestato a mantenere l'innesto in posizione. Scegliere un pezzo di vetro più grande di embrione per evitare di danneggiarlo. L'embrione sarà un po 'appiattito.
    5. Attendere almeno 15-20 minuti, quindi rimuovere delicatamente il vetrino. Lasciate che l'embrione recuperare per altri 10 minuti e pipettare con cura in un piatto pulito riempito con 3/4 NAM, utilizzando la pipetta Pasteur di plastica.

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    Representative Results

    Quando placcato in fibronectina, gli espianti cresta neurale attaccano rapidamente (15-30 min) e l'espianto si diffonde piatta entro 2 ore (Figura 1A). Dopo 3-6 cellule hr cominciano a disperdersi. A 24 ore a 15 ° C, molte cellule hanno iniziato a migrare dalla espianto (Figure 1B e 1C). Tuorlo rende le cellule molto luminoso in contrasto di fase (Figura 1B). Sporgenze cellulari (filopodes e lamellipodes) sono chiaramente visibili dopo falloidina colorazione del citoscheletro di actina (Figura 1C).

    Per l'esperimento innesto ortotopico, gli embrioni donatori sono stati iniettati con mRNA GFP per seguire le cellule innestate nell'embrione ospitante non marcato. Il cranica NC è stato asportato da un lato dell'ospite; 30-60 min dopo la chirurgia dell'innesto è guarita, sostituendo l'host ablato cranica NC (Figura 1D, 2 ore dopo il trapianto). Poche ore dopo, hanno migrato le cellule GFP-positivefuori dalla espianto e seguito le rotte migratorie stereotipati di celle NC verso destinazioni cranio-facciali ventrale (Figura 1E). In girini, le strutture cranio-facciali NC-derivati ​​hanno sviluppato (Figura 1G). Quando cranica NC è stato asportato, queste strutture erano mancanti, causando una faccia abbreviato con occhio adiacente alla ghiandola cemento (Figura 1H, frecce rosse). In girini innestate, le cellule NC donatori hanno contribuito alle strutture cranio-facciali, risultando in un normale morfologia del viso (figure 1F e 1I, frecce verdi).

    Figura 1
    Figura 1. In vitro e in vivo di comportamento espiantati cranica NC. AC)   Premigratory NC è stato dissezionatoPartendo da una neurula embrione palco 17 e placcato su un piatto di fibronectina rivestita. A) 2 ore dopo la placcatura, l'espianto ha attaccato e la diffusione. B) 24 ore dopo la placcatura, le cellule hanno migrato in modo efficiente sul fibronectina. C) lamellipodia e filopodia si vede chiaramente nella migrazione delle cellule NC etichettati con falloidina (verde) stage DI) neurula 17 GFP + etichettato premigratory NC è stata presa da un embrione GFP-iniettato e back-innestato in un embrione di accoglienza, da cui cranica NC è stato asportato in fase 17. - 18. D) Due ore dopo l'innesto, l'espianto è guarita. cellule EF) Grafted NC hanno attivamente migrato fuori e popolato il flusso mandibolare, come mostrato nella fase di girino 31 e 41. fase G) Controllo 41 girino. H) ablazione del CN ha portato ad un drammatico fallimento del viso e lo sviluppo degli occhi (H: notare che il Glan cementod sviluppa adiacente all'occhio, a causa della mancanza di celle NC popolano le aree mascella, frecce rosse. . Confronta controllare girino in G) F, I) Al contrario, le cellule NC innestate hanno restaurato l'occhio e lo sviluppo delle strutture cranio-facciale (F, I, frecce verdi) AC, bar scala = 100 mm. DI, Scala bar = 1 mm . D, vista dorsale. EI, viste laterali. Questa cifra è stata modificata da Mileto et al. 12 cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

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    Discussion

    Questo protocollo descrive una tecnica facile da espiantare premigratory cranica NC in X. laevis embrioni. Gli embrioni utilizzati per tali esperimenti devono essere robusti e guarire bene. Eliminare ogni partita di embrioni sani. Inoltre, crescere embrioni a diverse temperature (da 12 a 18-20 ° C), al fine di asportare cresta neurale nella fase 17 e non più tardi. Dopo stadio 17, cresta neurale può essere miscelata con mesoderma cefalico e non può essere rimosso completamente. Tessuti Xenopus guariscono rapidamente e poi perdono la loro adesione ad altri tessuti. È importante lavorare rapidamente, e mettere espianti cresta neurale nell'ospite appena viene escisso dal donatore.

    Per quanto riguarda in esperimenti in vitro, piatti della cultura fibronectina possono ottenere contaminati da batteri o funghi dopo un paio di giorni. Utilizzare materiali e soluzioni antibiotico e pulita o sterile più spesso possibile.

    Questa procedura è ottimizzata fo craniale cresta neurale. Infatti, questa popolazione cellulare è ben definito e localizzato in stadio 17 embrioni di Xenopus. Purtroppo, questo modello non è opportuno eseguire tali esperimenti sul tronco NC. Embrioni di uccelli sono più adatti per coloro che sono interessati a manipolare tale tronco popolazione di cellule NC.

    Gli espianti descritti in questo protocollo possono essere utilizzati per studiare vari aspetti del comportamento NC, sia in vivo che in vitro. Il programma di sviluppo molecolare NC è in gran parte conservata nei vertebrati 19. Sviluppo Frog è un potente modello per lo studio dei vertebrati NC EMT, migrazione e differenziamento. X. cellule embrionali laevis contengono abbastanza tuorlo per permettere la loro sopravvivenza in vitro per parecchi giorni senza aggiunta di alcuna sostanza nutritiva esterno. Così, gli studi in vitro possono testare gli effetti di vari fattori di crescita o composti chimici, in un mezzo di coltura semplice e completamente controllato. Tali esperimenti sono statiprogettato per analizzare EMT e migrazione, compresa studiando gli effetti della chemio-esche o chemio-repellenti, di attivare o bloccare le vie di segnalazione, ecc 14,20-24 Questo approccio può anche essere usato per progettare migliori protocolli di differenziazione NC diretti. Nel contesto dello sviluppo di protocolli per la medicina rigenerativa, ottenendo diversi tipi di cellule NC-derivate in vitro potrebbero essere utilizzati per il controllo della droga per la comprensione e il trattamento neurocristopathies 25,26.

    Sviluppo NC è orchestrata da una complessa interazione tra cellule normative autonome e segnali dai tessuti circostanti. Manipolazioni sperimentali di espressione genica, sia nel donatore NC o nell'embrione ospitante, consentono cellule discriminante autonoma dagli aspetti autonomi noncell dello sviluppo NC. Combinando guadagno-di-funzione e knock-down si avvicina a questo protocollo per la cultura in vitro e in vivo innesto è stato utilizzare correttamented 14,21,23,27-36.

    Questa tecnica può essere adattato per innestare altri tessuti in embrioni ospitante e verificare le loro potenzialità migrazione e differenziazione. Ad esempio, abbiamo utilizzato il pluripotenti ectoderma tetto blastocele (il "cap animale") per cercare un interruttore trascrizionale minimo per lo sviluppo NC. Abbiamo studiato l'effetto di due fattori di trascrizione, PAX3 e ZIC1, sull'impegno NC e il successivo sviluppo. Caps animali con PAX3 e ZIC1 guadagno-di-funzione sono stati piastrati su fibronectina in vitro o backgrafted in embrioni di accoglienza. Abbiamo scoperto che le cellule Pax3/Zic1-induced migrano e si differenziano, come in buona fede celle NC, sia in vitro che in embrioni di accoglienza 12.

    Numerosi meccanismi molecolari che governano NC EMT e migrazione sono anche coinvolti nella diffusione metastatica nel cancro 37. Questo protocollo mira a fornire un semplice, economico e efficistrumento ent per i biologi dello sviluppo e di altri ricercatori per esplorare i meccanismi fondamentali di questi comportamenti cellulari fondamentali.

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    Disclosures

    Gli autori non hanno nulla da rivelare.

    Acknowledgments

    Gli autori ringraziano Adeline Dolly per le foto di espianto di fibronectina, Eric Theveneau per utili discussioni e il Fondo Animal dell'Institut Curie. CM è un borsista postdottorato della Regione Ile de France (Domaine d'interet Majeur Stelo Pole), Université Paris Sud (addetto Temporaire d'Enseignement et de Recherche), e Agence Nationale de la Recherche. Questo lavoro è stato finanziato dalla Université Paris Sud (Attractivite 2011), il Centre National de la Recherche Scientifique (Programma d'azione thématique et sur fonti di incentivi), Association pour la Recherche contre le Cancer di Grant SFI20101201882, Ligue contre le Cancer, e Agence Nationale de la Recherche (Agence Nationale de la Recherche programma Blanc).

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Fibronectin from bovine plasma Sigma F4759-1MG
    Bovine Serum Albumin, Fraction V Euromedex 04-100-811-C Lower quality grade may  be suitable for this application
    Stainless Steel Insect Pins, Size 000 FST 26001
    Dumont #5 forceps 0.05 mm x 0.02 mm FST 11252-20

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    References

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    Biologia dello Sviluppo Numero 85 Neural cresta, Embrione dissezione innesto fibronectina
    Dissezione dei<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Cresta neurale per<em&gt; In vitro</em&gt; Espianto Cultura o<em&gt; In vivo</em&gt; Trapianto
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    Milet, C., Monsoro-Burq, A. H.… More

    Milet, C., Monsoro-Burq, A. H. Dissection of Xenopus laevis Neural Crest for in vitro Explant Culture or in vivo Transplantation. J. Vis. Exp. (85), e51118, doi:10.3791/51118 (2014).

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