Summary
Bacteriën kunnen tijdens hun leven schadelijke of gunstige mutaties ophopen. In een populatie van cellen kunnen individuen die gunstige mutaties hebben geaccumuleerd, snel hun medemens overtreffen. Hier presenteren we een eenvoudige procedure om intraspecies-concurrentie in een bacteriële celpopulatie in de loop van de tijd te visualiseren met behulp van fluorescerend gelabelde individuen.
Abstract
Veel micro-organismen zoals bacteriën verspreiden zich extreem snel en de populaties kunnen hoge celdichtheden bereiken. Kleine fracties van cellen in een populatie hebben altijd geaccumuleerde mutaties die schadelijk of gunstig zijn voor de cel. Als het fitnesseffect van een mutatie de subpopulatie een sterk selectief groeivoordeel biedt, kunnen de individuen van deze subpopulatie snel overcompeteren en zelfs hun directe medemensen volledig elimineren. Kleine genetische veranderingen en selectiegestuurde accumulatie van cellen die gunstige mutaties hebben verworven, kunnen dus leiden tot een volledige verschuiving van het genotype van een celpopulatie. Hier presenteren we een procedure om de snelle klaonale expansie en eliminatie van respectievelijk gunstige en schadelijke mutaties in een bacteriecelpopulatie in de loop van de tijd te monitoren door cocultivatie van fluorescerend gelabelde individuen van de Gram-positieve modelbacterie Bacillus subtilis. De methode is gemakkelijk uit te voeren en zeer illustratief om intraspecies concurrentie weer te geven tussen de individuen in een bacteriële celpopulatie.
Introduction
Bodembacteriën zijn meestal begiftigd met flexibele regulerende netwerken en brede metabolische capaciteiten. Beide functies stellen de cellen in staat om hun katabole en anabole paden aan te passen om te concurreren met hun collega's en andere micro-organismen voor de voedingsstoffen, die beschikbaar zijn in een bepaalde ecologische niche1. Als de bacteriën zich echter niet kunnen aanpassen aan hun omgeving, kunnen andere mechanismen het voortbestaan van een soort verklaren. Inderdaad, omdat veel bacteriën zich snel verspreiden en de populaties hoge celdichtheden kunnen bereiken, kunnen subpopulaties spontaan gunstige mutaties hebben geaccumuleerd die de cellen een selectief groeivoordeel bieden en daarom hun conditie verhogen. Bovendien kunnen mutatiehotspots en stress-geïnduceerde adaptieve mutagenese de evolutie van een maladapted bacterie2,3vergemakkelijken. Accumulatie van mutaties en groei onder continue selectie is dus de oorsprong voor de enorme microbiële diversiteit, zelfs binnen hetzelfde geslacht4,5. Net als in de natuur komt het vormen van bacteriële genomen ook voor in het laboratorium als gevolg van continue teelt onder selectie. Dit wordt geïllustreerd door de domesticatie van de Gram-positieve bacterie B. subtilis, die wereldwijd wordt gebruikt in fundamenteel onderzoek en in de industrie. In de jaren 1940 werd B. subtilis behandeld met DNA-schadelijke röntgenfoto's gevolgd door teelt onder een specifieke groeitoestand6. De mutaties die zich tijdens hun domesticatie in de bacteriën hebben opgehoopt, zijn verantwoordelijk voor het verlies van veel groeikenmerken, d.w.z. de B. subtilis laboratoriumstam 168 verloor het vermogen om complexe kolonies te vormen7,8.
Tegenwoordig is voor de best bestudeerde modelbacteriën Escherichia coli en B. subtiliseen verscheidenheid aan krachtige hulpmiddelen beschikbaar om hun genomen genetisch te manipuleren om specifieke wetenschappelijke vragen te beantwoorden. Soms veroorzaakt de inactivatie van een interessant gen een ernstig groeidefect, dat dan duidelijk zichtbaar is op standaard groeimedium9. Mutaties die daarentegen een zwak groeidefect veroorzaken en dus slechts een geringe invloed hebben op de conditie van de stam, worden vaak genegeerd. In beide gevallen resulteren langdurige incubatie en passaging van de mutante stammen gedurende meerdere generaties echter meestal in de accumulatie van suppressor mutanten die het fenotype van de ouderstam hebben hersteld2,9. De karakterisering van suppressor mutanten en de identificatie van de mutaties die het groeidefect van de parent mutant stam hebben hersteld is een zeer nuttige benadering die opheldering van belangrijke en vaak nieuwe cellulaire processen mogelijk maakt10,11.
Wij zijn geïnteresseerd in de bestrijding van glutamaat homeostase in B. subtilis12. Net als E. colireageert B. subtilis op verstoring van glutamaathomeostase (d.w.z.blok in glutamaatdegradatie2) door de accumulatie van suppressormutanten. De genomische veranderingen in deze suppressor mutanten die werden verkregen door spontane mutatie bleken glutamaat homeostase snel te herstellen9,13. Daarom is het niet verwonderlijk dat aanpassing van B. subtilis aan een specifieke groeitoestand tijdens domesticatie van de bacterie wordt weerspiegeld in enzymsynthese en in de geëvolueerde enzymatische activiteiten, die betrokken zijn bij glutamaatmetabolisme12. Er is gesuggereerd dat het gebrek aan exogene glutamaat in het groeimedium tijdens het domesticatieproces de drijvende kracht was voor het ontstaan en fixeren van het cryptische glutamaatdehydrogenase (GDH) gudBCR-gen in de laboratoriumstam 1682,14. Deze hypothese wordt ondersteund door onze observatie dat de verminderde hoeveelheid GDH-activiteit in de laboratoriumstam de bacteriën een selectief groeivoordeel biedt wanneer exogene glutamaat schaars is2. Bovendien resulteert de teelt van een B. subtilis stam, het synthetiseren van de GDH GudB, bij afwezigheid van exogene glutamaat in de accumulatie van suppressor mutanten die het gudB gen2hebben geactiveerd . Het is duidelijk dat de aanwezigheid van een katabolisch actieve GDH nadelig is voor de cel omdat endogene glutamaat dat anders voor anabolisme zou kunnen worden gebruikt, wordt afgebroken tot ammonium en 2-oxoglutaraat (figuur 1). Wanneer glutamaat daarentegen door het medium wordt geleverd, heeft een B. subtilis-stam die is uitgerust met GDH-activiteit op hoog niveau een selectief groeivoordeel ten opzichte van een soort die slechts één functionele GDH synthetiseert. Het is redelijk om aan te nemen dat GDH-activiteit op hoog niveau de bacteriën in staat stelt glutamaat als tweede koolstofbron te gebruiken naast andere koolstofbronnen die door het medium2 worden geleverd (zie figuur 1). GDH-activiteit heeft dus een sterke invloed op de geschiktheid van bacteriën, afhankelijk van de beschikbaarheid van exogene glutamaat.
Hier presenteren we een zeer illustratieve methode om de intraspecies-competitie tussen twee B. subtilisstammen die verschillen in een enkele locus op het chromosoom te monitoren en te visualiseren (Figuur 2). De twee stammen werden gelabeld met de yfp- en cfp-genen die coderen voor de fluoroforen YFP en GVB, en gecocultiveerd onder verschillende voedingsomstandigheden. Door na verloop van tijd te bemonsteren en door geschikte verdunningen op agarplaten te plateren, konden de overlevenden in elk van de culturen gemakkelijk worden gecontroleerd met behulp van een gemeenschappelijke stereofluorescentiemicroscoop. De procedure die in dit artikel wordt beschreven, is eenvoudig uit te voeren en geschikt om de snelle klaonale expansie en eliminatie van respectievelijk gunstige en schadelijke mutaties in een celpopulatie in de loop van de tijd te visualiseren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Voorbereiding van Agar-platen, cultuurmedia, cryostocks en preculturen
- Bereid groeimedia en benodigde reagentia voor (zie tabel met materialen en reagentia).
- Streep de B. subtilis stammen (b.v. BP40 (rocG+ gudBCR amyE::PgudB-yfp) en BP52 (rocG+ gudB+ amyE::PgudB-cfp) die respectievelijk één en twee actieve GDH's uitdrukken)2 die zullen worden gebruikt in het concurrentie-experiment op SP medium agar platen om enkele kolonies te krijgen. Incubeer de platen 's nachts bij 37 °C.
- Neem enkele kolonies en inenteer steriele kweekbuizen met een vloeibaar medium van 4 ml LB. Kweek de bacteriën 's nachts bij 28 °C en 220 tpm.
- Kweek 's nachts culturen bij 28 °C om te voorkomen dat de cellen lyseren of sporuleren.
- Meet de optische dichtheid van de culturen op een golflengte van 600 nm (OD600) met behulp van een standaard spectrofotometer.
- Als de culturen een OD600 van 2,0 hebben bereikt, meng dan 0,75 ml van de culturen met 0,75 ml steriele 50% glyceroloplossing in reactiebuizen van 1,5 ml. De uiteindelijke OD600 moet 1,0 zijn om cryostocks te verkrijgen die ongeveer 108 cellen/ml bevatten.
- Bewaar de buizen bij -80 °C.
- Maak drie preculturen van elke soort gelabeld met de cfp en yfp die coderen voor fluorofoorgenen. Ent de preculturen (steriele kweekbuizen met 4 ml LB vloeibaar medium) in met 1 μl cellen uit -80 °C cryostocks. Incubeer de culturen 's nachts bij 28 °C en 220 tpm.
2. Cocultivatie van bacteriën, monsterverzameling en monsteropslag
- Bereid vers 100 ml C-Glc en CE-Glc minimaal medium (zie tabel met reagentia en materialen) en breng 20 ml van elk medium over in steriele shakekolven van 100 ml.
- Neem 0,1 ml van de preculturen die 's nachts zijn gekweekt, verdun ze met 0,9 ml LB medium in een cuvette van 1,5 ml en bepaal de OD600.
- Neem voor het concurrentie-experiment die preculturen van de verschillende soorten met een vergelijkbare OD600 tussen 1,0-1,5.
- Om gemengde celpopulaties te verkrijgen, verdun de cellen van de preculturen met de juiste OD600 tot een OD600 van 0,05 in 20 ml C-Glc en CE-Glc minimaal medium aangevuld met 100 ml shakekolven. Voor het concurrentie-experiment moeten de twee stammen worden gemengd in een verhouding van 1:1.
- Neem 10 ml monsters uit de kolven, breng ze over in plastic buizen van 15 ml, oogst de cellen door centrifugeren gedurende 10 minuten bij 4.000 x g in een standaard tafelcentrifuge en gooi het supernatant weg.
- Resuspend de cellen in 0,5 ml vers LB-medium en breng de cellen over in een steriele reactiebeker van 1,5 ml. Voeg 0,5 ml 50% steriele glycerol toe, meng de suspensie door rigoureuze vortexing en bewaar de monsters in een vriezer van -80 °C tot verdere behandeling.
- Incubeer de cellen die in de schudkolven zitten tot 24 uur bij 37 °C en 220 tpm. Houd de schudkolven in het donker om te voorkomen dat de fluoroforen op de foto worden gebleekt.
- Neem verdere monsters van 0,1 ml na 7 uur en 24 uur groei. Meet en noteer de OD600 van 1:10 verdunningen (in C-Glc of CE-Glc minimaal medium) van de monsters.
- Neem de juiste hoeveelheid cellen uit elke kweek om cryostocks te maken met een OD600 van 1,0. Bewaar de monsters bij -80 °C tot verdere behandeling.
3. Monsterbehandeling, plating en incubatie voor kwantitatieve analyses
- Ontdooi na het verzamelen van alle monsters de cryostocks en verdun de cellen in een zoutoplossing van 0,9% (zie tabel met reagentia en materialen) tot 10-3.
- Plaat 0,1 ml van de 10-3 verdunningen op SP medium agar platen en verdeel de cellen met steriele glazen pipetten.
- Incubeer de platen 's nachts bij 37 °C in het donker totdat er enkele kolonies zijn verschenen.
4. Het tellen van de overlevenden door stereofluorescentiemicroscopie voor kwantitatieve analyse
- Verdeel de onderkant van de agarplaat met een zwarte pen in vier delen voor een betere oriëntatie terwijl u de overlevenden onder de stereofluorescentiemicroscoop telt.
- Plaats de plaat ondersteboven onder de microscoop en breng de kolonies scherp met behulp van de koude lichtbron.
- Zodra de kolonies scherp zijn, schakelt u over naar de juiste filterset voor GVB om de overlevende cellen van de stam met het CFP-labelte visualiseren. Tel de overlevenden van deze stam door de kolonies te labelen met een pen en noteer het nummer.
- Verwijder de etiketten met ethanol en schakel over naar de YFP-filterset om de overlevende cellen van de yfp-gelabeldestam te visualiseren. Tel de overlevenden opnieuw door de kolonies met een pen te labelen en noteer het nummer.
5. Monsterbehandeling en microscopie voor semiquantitatieve analyses
- Voor illustratieve cijfers, spot 10 μl van de 10-4 verdunning (ongeveer 100 cellen) vanaf stap 3.1 op een SP-agarplaat (zie figuur 3).
- Incubeer de platen 's nachts bij 37 °C in het donker totdat er enkele kolonies zijn verschenen.
- Plaats de Petrischaal zonder deksel onder de microscoop en breng de plek scherp met behulp van de koude lichtbron.
- Maak foto's van de plekken voor illustratieve figuren. Kies een geschikte belichtingstijd voor het maken van de foto's van de kolonies met de koude lichtbron.
- Zonder de plaat te verplaatsen, gaat u over op de CFP-filterset, past u de belichtingstijd aan en maakt u een foto. Doe hetzelfde met de YFP-filterset en sla de foto's op voor verdere analyses.
6. Gegevensanalyse
- Gebruik software zoals Excel voor de kwantitatieve data-analyses. Bereken op basis van de getelde kolonies het percentage gele en blauwe kolonies met betrekking tot het hele aantal kolonies, dat is ingesteld op 100%.
- Gebruik de berekende getallen om een gestapeld staafdiagram te maken (zie figuur 4 en figuur 5). Gebruik een beeldverwerkingsprogramma zoals Adobe Photoshop om samengevoegde foto's te maken van de foto's die vanaf de verschillende plekken zijn gemaakt. Als alternatief kan de vrij beschikbare software ImageJ, te downloaden van http://rsbweb.nih.gov/ij/ worden gebruikt voor beeldverwerking.
- Open de foto's vanaf één plek die zijn gemaakt met de GVB-filterset en de YFP-filterset. Optimaliseer het contrast en de helderheid om eventuele achtergrondfluorescentie van de media te verminderen.
- Ga naar een van de foto's en selecteer alles. Kopieer de afbeelding en plak deze op de andere afbeelding.
- Gebruik de functie "color dodge" om de foto's samen te voegen of leg de fluorescerende foto's over elkaar met behulp van het tabblad kanalen. Samengevoegde foto's van de kolonies uit verschillende media en verschillende tijdspunten vertegenwoordigen de groei van de verschillende stammen binnen de vloeibare cultuur.
7. Specifieke tips: Dye Switch Experiment en cocultivatie van isogene stammen gelabeld met cfp en yfp
De expressie van een van de twee fluorofoor-coderende genen in B. subtilis kan de conditie en dus de groeisnelheid van de bacteriën beïnvloeden. Daarom wordt aanbevolen om de volgende experimenten uit te voeren om uit te sluiten dat de eliminatie van één concurrente stam uit de celpopulatie tijdens de teelt eenvoudigweg te wijten is aan een negatief effect van de fluorofoor:
- Herhaal het hele experiment en cocultiveer omgekeerd gelabelde stammen (bijv. de eerdere cfp-gelabeldestam is nu gelabeld met het yfp-gen en vice versa). Hoewel omgekeerd, moeten de verkregen resultaten vergelijkbaar zijn met de eerdere observatie dat de ene stam een selectief groeivoordeel heeft ten opzichte van de andere stam.
- Herhaal het hele experiment en cocultiveer isogene stammen gelabeld met yfp en cfp (bijv. BP40 (rocG+ gudBCR amyE::PgudB-yfp) en BP41 (rocG+ gudBCR amyE::PgudB-cfp)). Schat het negatieve effect van een van de twee fluoroforen op de geschiktheid van de bacteriën door de samenstelling van de celpopulatie in de loop van de tijd te volgen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De hier beschreven methode werd met succes toegepast om de intraspecies-concurrentie te visualiseren in een celpopulatie bestaande uit B. subtilis-stammen die werden gelabeld met de cfp- en yfp-genen die coderen voor respectievelijk de fluoroforen GVB en YFP. Zoals weergegeven in figuur 3, kan de methode worden gebruikt om intraspecies-concurrentie op een zeer illustratieve manier te visualiseren. Door de monsters op kleine gebieden te spotten, werd de klonale samenstelling van de celpopulatie in één oogopslag zichtbaar gemaakt. Hoewel deze benadering niet geschikt is voor kwantitatieve analyses, is zij nuttig om het effect van verschillende groeiparameters (d.w.z.stikstofbron ) op de ontwikkeling van een celpopulatie die aanvankelijk beide stammen in gelijke hoeveelheden bevatte , ruwweg te schatten (figuur 3). Bovendien kan in een kleinschalige aanpak de geschiktheid van verschillende B. subtilis stammen die onder dezelfde groeiconditie werden gekweekt, worden getest met behulp van een enkele agarplaat. Voor kwantitatieve analyses wordt aanbevolen de monsters over het gehele oppervlak van een agarplaat te vermeerderen. Dit voorkomt overlay van de kolonies en maakt zo de duidelijke identificatie en telling van kolonies mogelijk die uit afzonderlijke cellen zijn voortgekomen. Door geschikte verdunningen op agarplaten te plateren, kan de klonale samenstelling van een celpopulatie in de loop van de tijd nauwkeurig worden bepaald door simpelweg de gele en blauwe fluorescerende kolonies te tellen (zie figuur 4). Zoals we eerder hebben gemeld, heeft GDH-activiteit een sterke invloed op de geschiktheid van B. subtilis, afhankelijk van de beschikbaarheid van exogene glutamaat2. Het is duidelijk dat bij afwezigheid van exogene glutamaat op hoog niveau GDH-activiteit nadelig is voor de bacteriën, omdat de enzymen RocG en GudB glutamaat afbreken dat nodig is in anabolisme (zie figuur 1 en figuur 4A). Daarentegen kan glutamaat, indien verstrekt aan de bacteriën, dienen als een aminogroepdonor bij transaminatiereacties. Bovendien kan glutamaat worden ingevoerd in het koolstofmetabolisme en worden gebruikt als energiebron vanwege de aanwezigheid van de katabolisch actieve GDHs RocG en GudB (figuur 1 en figuur 4B). Zoals blijkt uit de figuren 4C en 4D, werden vergelijkbare resultaten verkregen in een kleurstofschakelaarexperiment. Nogmaals, bacteriën uitgerust met hoge GDH-activiteit werden overtreffen door cellen met verminderde GDH-activiteit in groeimedia zonder glutamaat. Bacteriën die slechts één actieve GDH synthetiseren, werden daarentegen uit de cultuur geëlimineerd toen het medium werd aangevuld met glutamaat. Zoals blijkt uit de figuren 5A en 5B, bleef de initiële samenstelling van de gemengde celpopulatie in de loop van de tijd vrijwel constant. In het concurrentie-experiment was de eliminatie van een van de twee stammen die waren uitgerust met verschillende hoeveelheden GDH-activiteit dus niet te wijten aan een groeidefect veroorzaakt door de fluoroforen (zie figuur 4). Samen is het gebruik van fluoroforen een krachtig hulpmiddel voor het monitoren van de intraspecies-concurrentie in een bacteriële celpopulatie.
Figuur 1. Het verband tussen koolstof- en stikstofmetabolisme in B. subtilis. Wanneer glutamaat niet door het medium wordt geleverd, wordt de belangrijkste aminodonor die nodig is voor anabolisme gesynthetiseerd uit ammonium en 2-oxoglutaraat door de gecombineerde werking van het glutaminesynthetase (GS) en het glutamaatsynthase (GOGAT). In aanwezigheid van exogene glutamaat daarentegen kunnen de katabolisch actieve GDH's RocG en/of GudB glutamaat afbreken tot ammonium en 2-oxoglutaraat, dat vervolgens als koolstofbron dient.
Figuur 2. Experimentele workflow. Stam 1 (gelabeld met yfp) en stam 2 (gelabeld met cfp)verschillen in één locus van elkaar. In het hier gepresenteerde voorbeeld hebben we het effect van exogene glutamaat (effector) vergeleken op de genotypische verschuiving van de celpopulatie die aanvankelijk 50% van rocG+ gudB+ (codering van twee actieve GDH's) en 50% van rocG+ gudBCR (codering van één actieve GDH) cellen bevatte. Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken.
Figuur 3. Semiquantitatieve benadering om intraspecies competitie op een beschrijvende manier te visualiseren (zie rubriek 5). Voorafgaand aan cocultivatie (0 uur) en na 7 uur en 24 uur groeiverdunningen (10-4) werden cellen op SP-agarplaten waargenomen. De overlevende cellen die kolonies hebben gevormd na 12 uur incubatie bij 37 °C werden geïdentificeerd door stereofluorescentiemicroscopie. Belichtingstijd, 0,6 sec; schaalbalk, 1 mm. Dit cijfer is gewijzigd van Gunka et al. 20132.
Figuur 4. Kwantificering van de intraspecies-concurrentie. Na monsterverdunning en vermeerdering van de cellen (zie stap 3.1-3.3) op SP-medium werden de platen 's nachts bij 37 °C geïncubeerd. Gele en blauwe kolonies werden gekwantificeerd zoals beschreven in protocollen 4 en 6. De zwarte foutbalken vertegenwoordigen standaardafwijkingen voor ten minste vier onafhankelijk herhaalde experimenten. Elke agarplaat bevatte minstens 100 telbare kolonies. (A) Bij afwezigheid van exogene glutamaat overcompetes de B. subtilis stam BP40 (geel) uitgerust met slechts één functionele GDH overcompetes stam BP54 (blauw), die zowel glutamaat-afbrekende enzymen, RocG en GudB synthetiseert. (B) Daarentegen is de synthese van twee functionele GDH's voordelig voor de bacteriën wanneer exogene glutamaat beschikbaar is, omdat naast glucose glutamaat wordt gebruikt als koolstofbron. Zoals blijkt uit (C) en (D) werden vergelijkbare resultaten verkregen in een kleurstofschakelaarexperiment. Dit cijfer is gewijzigd van Gunka et al. 20132. Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken.
Figuur 5. Controle-experiment om het effect van de fluorofoor-coderende cfp- en yfp-genen op de geschiktheid van de bacteriën te evalueren. Gemengde populaties van de isogene stammen BP40 (rocG+ gudBCR amyE::yfp) en BP41 (rocG+ gudBCR amyE::cfp) of BP52 (rocG+ gudB+ amyE::cfp) en BP156 (rocG+ gudB+ amyE::yfp) werden gekweekt bij afwezigheid (A) en in aanwezigheid (B) van exogene glutamaat. De overlevende cellen werden geteld zoals beschreven in respectievelijk protocollen 1-4 en 6. De balken vertegenwoordigen standaardafwijkingen voor ten minste vier onafhankelijk herhaalde experimenten. Dit cijfer is gewijzigd van Gunka et al. 20132. Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Verschillende methoden zijn ontwikkeld om de competitieve fitheid van bacteriën te analyseren16. In veel gevallen werden de bacteriën gelabeld met verschillende antibioticaresistentiecassettes17. Net als bij onze aanpak maakt het labelen van de cellen met antibioticaresistentiecassettes het mogelijk om de competitieve geschiktheid van de bacteriën tijdens cocultivatie onder gedefinieerde groeiomstandigheden te evalueren. Bovendien kan deze methode worden gebruikt om de competitieve geschiktheid te bepalen van cellen die van elkaar verschillen in een specifieke locus op het chromosoom17. Er zijn echter enkele nadelen aan het gebruik van antibioticaresistentiecassettes om de concurrentiepositie te controleren. Aangezien de expressie van de resistentiegenen meestal wordt gedreven door promotors met ongelijke sterkte, worden de enzymen die resistentie tegen de antibiotica verlenen waarschijnlijk op verschillende niveaus geproduceerd. Daarom zijn zwakke fitnesseffecten mogelijk niet detecteerbaar met deze aanpak. In onze aanpak werden beide fluorofoorgenen geïntegreerd met dezelfde selectiemarker en hun expressie wordt aangedreven door dezelfde promotors2. Een ander nadeel om de concurrentiegeschiktheid met antibioticaresistentiecassettes te controleren, kan zijn dat de aanpak bewerkelijker is omdat twee soorten agarplaten aangevuld met de juiste antibiotica nodig zijn voor het tellen van de kolonie. Als alternatief kan de geschiktheid van bacteriën worden bepaald door simpelweg de groeisnelheid te monitoren en door de berekening van een zogenaamde fitnessindex16. Uiteraard is dit de meest nauwkeurige aanpak omdat de bacteriën individueel worden gekweekt en giftige verbindingen die kunnen worden geproduceerd door een stam met een bepaald genotype geen invloed hebben op de groei van de concurrerende stam. Bovendien is het niet nodig om antibiotica te gebruiken die de groei van de cellen kunnen beïnvloeden. Beide benaderingen zijn echter niet erg illustratief, omdat de cijfers die concurrentiegeschiktheid beschrijven alleen op een nogal neutrale manier kunnen worden gepresenteerd.
Het gebruik van fluorofoorcoderingsgenen om de concurrentie tussen soorten te controleren en te kwantificeren heeft verschillende voordelen ten opzichte van andere methoden. Als beide stammen de fluorofoorcoderingsgenen hebben geïntegreerd door dubbele homologe recombinatie in het chromosoom, is het niet nodig om antibiotica te gebruiken in een van de teeltstappen. Daarom kunnen monsters die tijdens de teelt uit de cultuur worden genomen, op hetzelfde groeimedium worden geanalyseerd en kunnen beide stammen groeien. Deze aanpak maakt visualisatie van intraspecies competitie op een zeer illustratieve manier mogelijk. Bovendien kunnen met behulp van deze semiquantitatieve benadering verschillende groeiomstandigheden tegelijkertijd worden getest en kunnen veel verschillende stammen parallel worden vergeleken. Ten slotte is het niet nodig om de monsters op microscoopglaasjes te fixeren, omdat de monsters die tijdens de cocultivatie uit de bacteriekweek zijn genomen, in een vriezer kunnen worden opgeslagen18. Zo kunnen alle monsters en replica's tegelijkertijd worden geanalyseerd.
Twee cruciale stappen in ons protocol moeten worden genoemd. Het is belangrijk op te merken dat de cryostocks gelijke hoeveelheden cellen moeten bevatten in dezelfde groeifase van elke concurrent stam. Een eerste disproportie van de stammen in de cryostocks en bijgevolg in de schudkolven voordat met het experiment wordt begonnen, zal een sterke invloed hebben op de uitkomst van het concurrentie-experiment. Daarom is het verstandig om voorafgaand aan het experiment de samenstelling van de cryostocks te controleren. Bovendien moet een passende hoeveelheid cellen gelijkmatig over de plaat worden vermeerderd. Anders liggen de ontstane kolonies te dicht bij elkaar en wordt een nauwkeurige bepaling van de overlevende cellen moeilijk.
Er zijn ook enkele beperkingen en nadelen van de op fluorofoor gebaseerde aanpak. Cocultivatie in een multi-well plaatlezer en gelijktijdige detectie van de GVB- en YFP-signalen is niet mogelijk omdat de excitatie- en emissiespectra van de fluoroforen te dicht bij elkaar liggen. Dit technische probleem kan echter worden omzeild met behulp van verschillende fluorescerende eiwitten, zoals die welke groen en rood licht uitzenden, optimaal gebaseerd op dezelfde eiwitsteiger. Een ander nadeel van de op fluorofoor gebaseerde aanpak zou kunnen zijn dat sommige mutaties slechts een zwak groeidefect van de bacteriën veroorzaken. Dus als het groeidefect dat kan worden veroorzaakt door een van de fluorofoor-coderende genen sterker is dan het groeidefect veroorzaakt door een bepaalde mutatie, is de op fluorofoor gebaseerde benadering niet geschikt om de concurrentie tussen soorten te analyseren. Daarom wordt aanbevolen om, voordat je een hele reeks soorten maakt, eerst alleen de ouderstam te labelen met beide, cfp en yfp, en de stammen te cocultiveren. De groeiexperimenten zullen onthullen hoe sterk de fluoroforen de geschiktheid van de bacteriën beïnvloeden (zie figuren 5A en 5B).
In de toekomst zal het interessant zijn om te testen of de op fluorofoor gebaseerde benadering om de concurrentie tussen intraspecies te controleren nauwkeuriger en minder arbeidsintensief zal zijn als de overlevende cellen worden geteld met behulp van flowcytometrie. Onlangs is aangetoond dat flowcytometrie een krachtig hulpmiddel is om de samenstelling van B. subtilis biofilms19te analyseren. Bovendien is het misschien beter om zwakke fitnesseffecten te analyseren die de competitieve fitheid van bacteriën beïnvloeden door continue cocultivatie van de fluorofoor-gelabelde bacteriën in een fermentor. In tegenstelling tot schudkolven maakt deze aanpak het mogelijk om de groeiomstandigheden constant te houden en zo de concurrentie tussen soorten gedurende een lange periode te volgen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen hebben.
Acknowledgments
Het werk in het laboratorium van de auteurs werd ondersteund door de Deutsche Forschungsgemeinschaft (http://www.dfg.de; CO 1139/1-1), het Fonds der Chemischen Industrie (http://www.vci.de/fonds) en het Göttingen Centre for Molecular Biology (GZMB). De auteurs willen Jörg Stülke erkennen voor nuttige opmerkingen en kritische lezing van het manuscript.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| (NH4)2SO4 | Roth, Germany | 3746 | |
| Agar | Difco, USA | 214010 | |
| Ammonium ferric citrate (CAF) | Sigma-Aldrich, Germany | 9714 | |
| CaCl2 | Roth, Germany | 5239 | |
| Glucose | Applichem, Germany | A3617 | |
| Glycerol | Roth, Germany | 4043 | |
| K2HPO4•3H2O | Roth, Germany | 6878 | |
| KCl | Applichem, Germany | A3582 | |
| KH2PO4 | Roth, Germany | 3904 | |
| KOH | Roth, Germany | 6751 | |
| MgSO4•7H2O | Roth, Germany | P027 | |
| MnCl2 | Roth, Germany | T881 | |
| MnSO4•4H2O | Merck Millipore, Germany | 102786 | |
| NaCl | Roth, Germany | 9265 | |
| Nutrient broth | Roth, Germany | X929 | |
| Potassium glutamate | Applichem, Germany | A3712 | |
| Tryptone | Roth, Germany | 8952 | |
| Tryptophan | Applichem, Germany | A3445 | |
| Yeast extract | Roth, Germany | 2363 | |
| 1.5 ml Reaction tubes | Sarstedt, Germany | 72,690,001 | |
| 2.0 ml Reaction tubes | Sarstedt, Germany | 72,691 | |
| 15 ml Plastic tubes with screw cap | Sarstedt, Germany | 62,554,001 | |
| Petri dishes | Sarstedt, Germany | 82.1473 | |
| 1.5 ml Polystyrene cuvettes | Sarstedt, Germany | 67,742 | |
| 15 ml Glass culture tubes | Brand, Germany | 7790 22 | |
| 100 ml Shake flasks with aluminium caps | Brand, Germany | 928 24 | |
| Sterile 10 ml glass pipettes | Brand, Germany | 278 23 | |
| Incubator (28 and 37 °C) | New Brunswick | M1282-0012 | |
| Standard pipette set (2-20 μl, 10-100 μl, 100-1,000 μl) | Eppendorf, Germany | 4910 000.034, 4910 000.042, | |
| Table top centrifuge for 1.5 and 2 ml reaction tubes | Thermo Scientific, Heraeus Fresco 21, Germany | 75002425 | |
| Table top centrifuge for 15 ml plastic tubes | Heraeus Biofuge Primo R, Germany | 75005440 | |
| Standard spectrophotometer | Amersham Biosciences Ultrospec 2100 pro, Germany | 80-2112-21 | |
| Stereofluorescence microscope | Zeiss SteREO Lumar V12, Germany | 495008-0009-000 | |
| Freezer (-20 and -80 °C) | - | - | |
| Fridge (4 °C) | - | - | |
| Autoclave | Zirbus, LTA 2x3x4, Germany | - | |
| pH meter | pH-meter 766, Calimatic, Knick, Germany | 766 | |
| Vortex | Vortex 3, IKA, Germany | 3340000 | |
| Balance | CP2202S, Sartorius, Germany | replaced by | |
| Black pen (permanent marker) | Staedler, Germany | 317-9 | |
| Powerpoint program | Microsoft, USA | - | |
| Office Excel program | Microsoft, USA | - | Program for data processing |
| Adobe Photoshop CS5 | Adobe, USA | replaced by CS6, download | Computer program for image processing |
| Computer | PC or Mac | - | |
| ZEN pro 2011 software for the stereofluorescence microscope | Zeiss, Germany | 410135 1002 110 | AxioCam MRc Rev. Obtained through Zeiss |
| Specific solution recipes | |||
| SP Medium | |||
| 8 g Nutrient broth | |||
| 0.25 mg MgSO4•7H2O | |||
| 1 g KCl | |||
| 15 g agar for solid SP medium | if required | ||
| add 1 L with H2O | autoclave for 20 min at 121 °C | ||
| 1 ml CaCl2 (0.5 M), sterilized by filtration | |||
| 1 ml MnCl2 (10 mM), sterilized by filtration | |||
| 2 ml ammonium ferric citrate (CAF, 2.2 mg/ml), sterilized by filtration | |||
| LB Medium | |||
| 10 g Tryptone | |||
| 5 g Yeast extract | |||
| 10 g NaCl | |||
| 15 g agar for solid LB medium | if required | ||
| add 1 L with H2O | autoclave for 20 min at 121 °C | ||
| C-Glc Minimal Medium | |||
| 200 ml 5 x C salts | |||
| 10 ml L-Tryptophan (5 mg/ml), sterilized by filtration | |||
| 10 ml ammonium ferric citrate (CAF, 2.2 mg/ml), sterilized by filtration | |||
| 10 ml III’ salts | |||
| 25 ml Glucose (20%) | autoclaved for 20 min at 121 °C | ||
| add 1 L with sterile H2O | |||
| CE-Glc Minimal Medium | |||
| 200 ml 5 x C salts | |||
| 10 ml L-Tryptophan (5 mg/ml), sterilized by filtration | |||
| 10 ml ammonium ferric citrate (CAF, 2.2 mg/ml), sterilized by filtration | |||
| 10 ml III’ salts | |||
| 20 ml Glutamate (40%) | |||
| 25 ml Glucose (20%), autoclaved for 20 min at 121 °C | |||
| add 1 L with sterile H2O | |||
| 5 x C salts | |||
| 20 g KH2PO4 | |||
| 80 g K2HPO4•3H2O | |||
| 16.5 g (NH4)2SO4 | |||
| add 1 L with sterile H2O | autoclave for 20 min at 121 °C | ||
| III’ salts | |||
| 0.232 g MnSO4•4H2O | |||
| 12.3 g MgSO4•7H2O | |||
| add 1 L with sterile H2O, autoclave for 20 min at 121 °C | |||
| 40% Glutamate solution | |||
| 200 g L-Glutamic acid | |||
| adjust the pH to 7.0 by adding approximately 80 g KOH | |||
| add 0.5 L with sterile H2O | autoclave for 20 min at 121 °C | ||
| 0.9% Saline (NaCl) Solution | |||
| add 1 L with sterile H2O | autoclave for 20 min at 121 °C | ||
| 50% Glycerol solution | |||
| 295 ml Glycerol (87%) | |||
| add 0.5 L with sterile H2O | autoclave for 20 min at 121 °C | ||
| Bacteria (All strains are based on the Bacillus subtilis strain 168) | |||
| Bacillus subtilis BP40 (rocG+ gudBCR amyE::PgudB-yfp) | Laboratory strain collection | ||
| Bacillus subtilis BP41 (rocG+ gudBCR amyE::PgudB-cfp) | |||
| Bacillus subtilis BP52 (rocG+ gudB+ amyE::PgudB-cfp) | |||
| Bacillus subtilis BP156 (rocG+ gudB+ amyE::PgudB-yfp) | |||
References
- Buescher, F. I., et al. Global network reorganization during dynamic adaptations of Bacillus subtilis metabolism. Science. 335, 1099-1103 (2012).
- Gunka, K., Stannek, L., Care, R. A., Commichau, F. M. Selection-driven accumulation of suppressor mutants in Bacillus subtilis: the apparent high mutation frequency of the cryptic gudB gene and the rapid clonal expansion of gudB+ suppressors are due to growth under selection. PLoS One. 8, (2013).
- Al Mamum, A. A. M., et al. Identity and function of a large gene network underlying mutagenic repair of DNA breaks. Science. 338, 1344-1348 (2012).
- Koeppel, A. F., Wertheim, J. O., Barone, L., Gentile, N., Krizanc, D., Cohan, F. M. Speedy speciation in a bacterial microcosm: new species can arise as frequently as adaptations within a species. ISME J. 7, 1080-1091 (2013).
- Maughan, H., Nicholson, W. L. Increased fitness and alteration of metabolic pathways during Bacillus subtilis evolution in the laboratory. Appl. Environ. Microbiol. 77, 4105-4118 (2011).
- Burkholder, P. R., Giles, N. H. Induced biochemical mutations in Bacillus subtilis. Am. J. Bot. 34, 345-348 (1947).
- McLoon, A. L., Guttenplan, S. B., Kearns, D. B., Kolter, R., Losick, R. Tracing the domestication of a biofilm-forming bacterium. J. Bacteriol. 193, 2027-2034 (2011).
- Zeigler, D. R., et al. The origins of 168, W23, and other Bacillus subtilis legacy strains. J. Bacteriol. 190, 6983-6995 (2008).
- Gunka, K., Tholen, S., Gerwig, J., Herzberg, C., Stülke, J., Commichau, F. M. A high-frequency mutation in Bacillus subtilis: requirements for the decryptification of the gudB glutamate dehydrogenase. 194, 1036-1044 (2012).
- Commichau, F. M., et al. Characterization of Bacillus subtilis mutants with carbon source-independent glutamate biosynthesis. J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 12, 106-113 (2007).
- Beckwith, J. Genetic suppressors and recovery of repressed biochemical memory. J. Biol. Chem. 284, 12585-12592 (2009).
- Gunka, K., Commichau, F. M. Control of glutamate homeostasis in Bacillus subtilis: a complex interplay between ammonium assimilation, glutamate biosynthesis and degradation. Mol. Microbiol. 85, 213-224 (2012).
- Yan, D. Protection of the glutamate pool concentrations in enteric bacteria. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 9475-9480 (2007).
- Belitsky, B. R., Sonenshein, A. L. Role and regulation of Bacillus subtilis glutamate dehydrogenase genes. J. Bacteriol. 180, 6298-6305 (1998).
- Commichau, F. M., Herzberg, C., Tripal, P., Valerius, O., Stülke, J. A regulatory protein-protein interaction governs glutamate biosynthesis in Bacillus subtilis: the glutamate dehydrogenase RocG moonlights in controlling the transcription factor GltC. Mol. Microbiol. 65, 642-654 (2007).
- Gordo, I., Perfeito, L., Sousa, A. Fitness effects of mutations in bacteria. J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 21, 20-35 (2011).
- Rabatinová, A., et al. The δ subunit of RNA polymerase is required for rapid changes in gene expression and competitive fitness of the cell. J. Bacteriol. 195, 2603-2611 (2013).
- Capra, E. J., Perchuk, B. S., Skerker, J. M., Laub, M. T. Adaptive mutations that prevent crosstalk enable the expansion of paralogous signalling protein families. Cell. 150, 222-232 (2012).
- García-Betancur, J. C., Yepes, A., Schneider, J., Lopez, D. Single-cell analysis of Bacillus subtilis biofilms using fluorescence microscopy and flow cytometry. J. Vis. Exp. (15), (2012).
