Summary
חיידקים עשויים לצבור מוטציות מזיקות או מועילות במהלך חייהם. באוכלוסייה של תאים אנשים שצברו מוטציות מועילות עשויים במהירות עולים על חבריהם. כאן אנו מציגים הליך פשוט כדי לדמיין תחרות intraspecies באוכלוסיית תאים חיידקיים לאורך זמן באמצעות אנשים בעלי תווית פלואורסצנטית.
Abstract
מיקרואורגניזמים רבים כגון חיידקים מתרבים מהר מאוד והאוכלוסיות עשויות להגיע לצפיפויות תאים גבוהות. שברים קטנים של תאים באוכלוסייה תמיד צברו מוטציות מזיקות או מועילות לתא. אם אפקט הכושר של מוטציה מספק תת-אוכלוסין עם יתרון צמיחה סלקטיבי חזק, האנשים של תת-אוכלוסיות זו עשויים במהירות outcompete ואפילו לחסל לחלוטין את חבריהם המיידיים. לכן, שינויים גנטיים קטנים הצטברות מונחה בחירה של תאים שרכשו מוטציות מועילות עלול להוביל לשינוי מוחלט של הגנוטיפ של אוכלוסיית התא. כאן אנו מציגים הליך כדי לפקח על התפשטות שיבוט מהירה וחיסול של מוטציות מועילות ומזיקות, בהתאמה, באוכלוסיית תאים חיידקיים לאורך זמן על ידי cocultivation של אנשים שכותרתו פלואורסצנטית של חיידק מודל גרם חיובי Bacillus subtilis. השיטה קלה לביצוע וממחישה מאוד כדי להציג תחרות intraspecies בקרב אנשים באוכלוסיית תאים חיידקיים.
Introduction
חיידקי קרקע ניחנים בדרך כלל ברשתות רגולטוריות גמישות ויכולות מטבוליות רחבות. שתי התכונות מאפשרות לתאים להתאים את המסלולים הקטבוליים והאנאבוליים שלהם כדי להתחרות עם חבריהם ומיקרואורגניזמים אחרים עבור החומרים המזינים, הזמינים בנישה אקולוגית נתונה1. עם זאת, אם החיידקים אינם מסוגלים להסתגל לסביבתם מנגנונים אחרים עשויים להסביר את הישרדותו של מין. ואכן, כמו חיידקים רבים להתרבות מהר ואת האוכלוסיות יכול להגיע צפיפות תאים גבוהה תת-אוכלוסיות אולי צברו באופן ספונטני מוטציות מועילות המספקות לתאים יתרון גדילה סלקטיבי ולכן להגדיל את הכושר שלהם. יתר על כן, נקודות חמות מוטציה ו mutagenesis הסתגלות הנגרמת על ידי מתח יכול להקל על האבולוציה של חיידק לא מזוהה2,3. לכן, הצטברות של מוטציות וצמיחה תחת בחירה רציפה היא המקור למגוון המיקרוביאלי העצום, אפילו בתוך אותו סוג4,5. כמו בטבע, עיצוב של גנומים חיידקיים מתרחש גם במעבדה עקב טיפוח מתמשך תחת בחירה. הדבר בא לידי ביטוי בביות של החיידק גראם חיובי B. subtilis, אשר משמש ברחבי העולם במחקר בסיסי ובתעשייה. בשנות ה-40 של ה-40 טופלה סובטיליס בצילומי רנטגן מזיקים לדנ"א ולאחר מכן בטיפוח בתנאי צמיחה מסוימים6. המוטציות שהצטברו בחיידקים במהלך הביות שלהם מסבירות את אובדן מאפייני הגדילה הרבים, כלומר זן מעבדת B. subtilis 168 איבד את היכולת ליצור מושבות מורכבות7,8.
כיום, עבור חיידקי המודל הנחקרים ביותר Escherichia coli ו- B. subtilis, מגוון כלים רבי עוצמה זמינים לתפעל גנטית את הגנום שלהם כדי לענות על שאלות מדעיות ספציפיות. לפעמים חוסר ההשבתה של גן עניין גורם פגם צמיחה חמור, אשר לאחר מכן גלוי בבירור על מדיום צמיחה סטנדרטי9. לעומת זאת, לעתים קרובות מתעלמים ממוטציות הגורמות לפגם צמיחה חלש ובכך משפיעות רק במעט על כושר הזן. עם זאת, בשני המקרים דגירה ממושכת והעברת זנים מוטנטים במשך כמה דורות בדרך כלל לגרום הצטברות של מוטנטים מדכאים כי החזירו את הפנוטיפ של זן האב2,9. האפיון של מוטנטים מדכאים וזיהוי המוטציות שהחזירו את פגם הצמיחה של זן מוטנט האב היא גישה מועילה מאוד המאפשרת הבהרה של תהליכים תאיים חשובים ולעתים קרובות חדשניים10,11.
אנו מעוניינים בשליטה של הומאוסטזיס גלוטמט ב B. subtilis12. בדומה ל- E. coli, B. subtilis מגיב להטרדה של הומאוסטזיס גלוטמט (כלומרלחסום השפלה גלוטמט2) על ידי הצטברות של מוטנטים מדכאים. השינויים הגנומיים במוטנטים מדכאים אלה שנרכשו על ידי מוטציה ספונטנית הוכחו כמשקמים במהירות הומאוסטזיס גלוטמט9,13. לכן, אין זה מפתיע כי הסתגלות של B. subtilis למצב צמיחה ספציפי במהלך ביות של החיידק משתקף סינתזת אנזים ובפעילויות אנזימטיות התפתחו, אשר מעורבים בחילוף החומרים גלוטמט12. הוצע כי חוסר גלוטמט אקסוגני במדיום הצמיחה במהלך תהליך הביות היה הכוח המניע להופעת קיבעון של גלוטמט מסתורי דהידרוגנאז (GDH) gudBCR גן בזן המעבדה 1682,14. השערה זו נתמכת על ידי התצפית שלנו כי הכמות המופחתת של פעילות GDH בזן המעבדה מספקת לחיידקים יתרון גדילה סלקטיבי כאשר גלוטמט אקסוגני הוא נדיר2. יתר על כן, טיפוח של זן B. subtilis, סינתזה של GDH GudB, בהיעדר תוצאות גלוטמט אקסוגני הצטברות של מוטנטים מדכאים שהשביתו את הגן gudB 2. ברור, הנוכחות של GDH פעיל קטבולי הוא נחות עבור התא כי גלוטמט המיוצר באנדוגניות כי אחרת יכול לשמש אנבוליזם הוא מושפל אמוניום ו 2-oxoglutarate (איור 1). לעומת זאת, כאשר גלוטמט מסופק על ידי המדיום, זן B. subtilis מצויד בפעילות GDH ברמה גבוהה יש יתרון צמיחה סלקטיבית על פני זן כי מסנתז רק GDH פונקציונלי אחד. סביר להניח שפעילות GDH ברמה גבוהה מאפשרת לחיידקים להשתמש בגלוטמט כמקור פחמן שני בנוסף למקורות פחמן אחרים המסופקים על ידי המדיום2 (ראו איור 1). לכן, פעילות GDH משפיעה מאוד על כושר של חיידקים, בהתאם לזמינות של גלוטמט אקסוגני.
כאן אנו מציגים שיטה מאוד להמחשה כדי לנטר ולהמחיש תחרות תוך-מינית בין שני זנים של B. subtilis השונים במקום אחד על הכרומוזום (איור 2). שני הזנים סומנו עם הגנים yfp ו- cfp המקודדים את YFP ו- CFP פלואורופורים, ו cocultivated בתנאים תזונתיים שונים. על ידי דגימה לאורך זמן ועל ידי ציפוי דילול מתאים על צלחות אגר הניצולים בכל אחת מהתרבויות ניתן לפקח בקלות באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי סטריאו נפוץ. ההליך המתואר במאמר זה קל לביצוע ומתאים לדמיין את ההתפשטות המהירה של שיבוט וחיסול מוטציות מועילות ומזיקות, בהתאמה, באוכלוסיית תאים לאורך זמן.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. הכנת צלחות אגר, מדיה תרבותית, קריוסטוקים וקדם-תרבויות
- הכן מדיית צמיחה ריאגנטים נדרשים (ראה טבלה של חומרים ריאגנטים).
- פס הזנים B. subtilis (למשל. BP40 (rocG+ gudBCR amyE::PgudB-yfp)ו- BP52 (rocG+ gudB+ amyE::PgudB-cfp) המבטאים GDHs פעיל אחד ושתיים, בהתאמה)2 שישמשו בניסוי התחרות על לוחות אגר בינוני SP כדי לקבל מושבות בודדות. דגירה הצלחות לילה ב 37 מעלות צלזיוס.
- קח מושבות בודדות לחסן צינורות תרבות סטריליים המכילים 4 מיליליטר LB נוזלי בינוני. לגדל את החיידקים לילה ב 28 °C (69 °F) ו 220 סל"ד.
- לגדול תרבויות לילה ב 28 °C (69 °F) כדי למנוע כי התאים lyse או לקעקע.
- למדוד את הצפיפות האופטית של התרבויות באורך גל של 600 ננומטר (OD600)באמצעות ספקטרופוטומטר סטנדרטי.
- אם התרבויות הגיעו OD600 של 2.0, לערבב 0.75 מ"ל של התרבויות עם 0.75 מיליליטר של פתרון גליצרול סטרילי 50% ב 1.5 מיליליטר צינורות תגובה. ODהסופי 600 צריך להיות 1.0 כדי להשיג cryostocks המכיל כ 108 תאים / מיליליטר.
- לאחסן את הצינורות ב -80 מעלות צלזיוס.
- הפוך שלוש precultures של כל זן שכותרתו עם cfp ו yfp קידוד גנים פלואורופור. לחסן את precultures (צינורות תרבות סטרילית המכילה 4 מיליליטר LB נוזלי בינוני) עם 1 תאים μl מ -80 מעלות צלזיוס cryostocks. דגירה את התרבויות לילה ב 28 °C (69 °F) ו 220 סל"ד.
2. Cocultivation של חיידקים, איסוף מדגם, ואחסון מדגם
- מכינים טריים 100 מ"ל C-Glc ו- CE-Glc בינוני מינימלי (ראה טבלה של ריאגנטים וחומרים), ומעבירים 20 מ"ל של כל מדיום לתוך צלושי טלטול סטריליים 100 מ"ל.
- קח 0.1 מ"ל של precultures שגדלו בן לילה, לדלל אותם עם 0.9 מיליליטר LB בינוני ב 1.5 מיליליטר cuvette, ולקבוע את OD600.
- לניסוי התחרות, לקחת את אלה precultures של זנים שונים שיש להם ODדומה 600 בין 1.0-1.5.
- כדי להשיג אוכלוסיות תאים מעורבות, לדלל את התאים של precultures כי היה המתאים OD600 כדי OD600 של 0.05 ב 20 מיליליטר C-Glc ו CE-Glc בינוני מינימלי בתוספת 100 מ"ל לנער בקבוקונים. לניסוי התחרות יש לערבב בין שני הזנים ביחס של 1:1.
- קח 10 דגימות מיליליטר מן הבקבוקים, להעביר אותם 15 מ"ל צינורות פלסטיק, לקצור את התאים על ידי צנטריפוגה במשך 10 דקות ב 4,000 x g בצנטריפוגה העליון שולחן סטנדרטי, ולהשליך את supernatant.
- לשים מחדש את התאים 0.5 מ"ל טרי LB בינוני, ולהעביר את התאים לתקרה סטרילית 1.5 מ"ל תגובה. מוסיפים 0.5 מ"ל של גליצרול סטרילי 50%, מערבבים את ההשעיה על ידי מערבולת קפדנית ומאחסנים את הדגימות במקפיא של -80 מעלות צלזיוס עד להמשך הטיפול.
- דגירה את התאים שנותרו צלוחי לנער עד 24 שעות ב 37 °C (60 °F) ו 220 סל"ד. שמור את צלושי לנער בחושך כדי למנוע הלבנה תמונה של פלואורופורים.
- קח דגימות נוספות של 0.1 מיליליטר לאחר 7 שעות ו 24 שעות של צמיחה. למדוד ולשים לב OD600 של 1:10 דילול (ב C-Glc או CE-Glc בינוני מינימלי) של הדגימות.
- קח את הכמות המתאימה של תאים מכל תרבות כדי להפוך cryostocks כי יש OD600 של 1.0. לאחסן את הדגימות ב -80 מעלות צלזיוס עד להמשך הטיפול.
3. טיפול מדגמי, ציפוי והדגירה לניתוחים כמותיים
- לאחר איסוף כל הדגימות, להפשיר את cryostocks, לדלל את התאים בתמיסת מלח 0.9% (ראה טבלה של ריאגנטים וחומרים) עד10-3.
- צלחת 0.1 מ"ל של 10-3 דילול על לוחות אגר בינוני SP ולהפיץ את התאים באמצעות פיפטות זכוכית סטרילית.
- דגירה הצלחות לילה ב 37 מעלות צלזיוס בחושך עד מושבות יחיד הופיעו.
4. ספירת הניצולים לפי מיקרוסקופיית פלואורסצנטי סטריאו לניתוח כמותי
- מחלקים את תחתית צלחת האגר בעט שחור בארבעה חלקים לצורך אוריינטציה טובה יותר תוך ספירת הניצולים תחת מיקרוסקופ הפלואורסצנטי של הסטריאו.
- מניחים את הצלחת במהופך מתחת למיקרוסקופ ומביאים את המושבות לפוקוס באמצעות מקור האור הקר.
- לאחר שהמושבות נמצאות במוקד, עבור אל ערכת המסנן המתאימה עבור CFP כדי לדמיין את התאים ששרדו של הזן בעל התווית cfp. לספור את הניצולים של זן זה על ידי תיוג המושבות עם עט ולשים לב למספר.
- הסר את התוויות עם אתנול ולעבור למסנן YFP להגדיר לדמיין את התאים ששרדו של זן yfpשכותרתו. לספור את הניצולים שוב על ידי תיוג המושבות עם עט ולשים לב למספר.
5. טיפול מדגמי ומיקרוסקופיה לניתוחים חצי שוויוניים
- לנתונים הממחישים, ספוט 10 μl של10-4 דילול (כ 100 תאים) משלב 3.1 על צלחת אגר SP (ראה איור 3).
- דגירה הצלחות לילה ב 37 מעלות צלזיוס בחושך עד מושבות יחיד הופיעו.
- מניחים את צלחת פטרי ללא מכסה מתחת למיקרוסקופ ומביאים את המקום לפוקוס באמצעות מקור האור הקר.
- צלם תמונות של המקומות להמחשה של דמויות. בחר זמן חשיפה מתאים לצילום התמונות של המושבות עם מקור האור הקר.
- מבלי להזיז את הלוח, עבור למסנן CFP, התאם את זמן החשיפה וצלם תמונה. בצע את אותו הדבר עם ערכת המסננים של YFP ושמור את התמונות לניתוחים נוספים.
6. ניתוח נתונים
- השתמש בתוכנות כגון Excel עבור ניתוחי הנתונים הכמותיים. בהתבסס על המושבות שנספרו, לחשב את אחוז המושבות הצהובות והכחולות ביחס למספר שלם של מושבות, אשר מוגדרים 100%.
- השתמש במספרים המחושבים כדי ליצור דיאגרמת עמודות מוערמות (ראו איור 4 ואיור 5). השתמשו בתוכנית לעיבוד תמונות כמו Adobe Photoshop לבניית תמונות ממוזגות של התמונות שצולמו מהנקודות השונות. לחלופין, התוכנה הזמינה בחופשיות ImageJ, להורדה http://rsbweb.nih.gov/ij/ יכול לשמש לעיבוד תמונה.
- פתח את התמונות מנקודה אחת שצולמו באמצעות ערכת המסננים CFP והמסנן YFP. מטב את הניגודיות ואת הבהירות כדי להפחית את פלואורסצנטיות הרקע מהמדיה.
- עבור לאחת התמונות ובחר הכל. העתק את התמונה והדבק אותה בתמונה האחרת.
- השתמש בפונקציה "השתמטות צבע" כדי למזג את התמונות או לכסות את התמונות הפלואורסצנטיות באמצעות הכרטיסיה ערוצים. תמונות ממוזגות של המושבות מאמצעי תקשורת שונים ונקודות זמן שונות מייצגות את הצמיחה של הזנים השונים בתרבות הנוזלית.
7. טיפים ספציפיים: ניסוי מתג צבע ו Cocultivation של זנים Isogenic שכותרתו עם cfp ו yfp
הביטוי של אחד משני הגנים המקודדים פלואורופור ב B. subtilis עשוי להשפיע על כושר ובכך את קצב הצמיחה של החיידקים. לכן, מומלץ לבצע את הניסויים הבאים על מנת לשלול כי חיסול של זן מתחרה אחד מאוכלוסיית התא במהלך הטיפוח הוא פשוט בשל השפעה שלילית של הפלואורפור:
- חזור על כל הניסוי ו cocultivate זנים מתויגים הפוך(למשל, הזן הקודם cfpשכותרתו מסומנת כעת עם הגן yfp ולהיפך). למרות ההופכי, התוצאות שהתקבלו צריך להיות דומה התצפית הקודמת כי זן אחד יש יתרון צמיחה סלקטיבית על פני הזן השני.
- חזור על כל הניסוי ו cocultivate זנים isogenic שכותרתו yfp ו CFP (למשל BP40 (rocG+ gudBCR amyE::PgudB-yfp)ו BP41(rocG+ gudBCR amyE::PgudB-cfp)). להעריך את ההשפעה השלילית של אחד משני פלואורופורים על כושר של החיידקים על ידי ביצוע הרכב אוכלוסיית התא לאורך זמן.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
השיטה המתוארת כאן הוחלה בהצלחה כדי לדמיין תחרות תוך-מין באוכלוסיית תאים המורכבת מזני B. subtilis שסומנו בגנים cfp ו- yfp המקודדים את הפלואורופורים CFP ו- YFP, בהתאמה. כפי שמוצג באיור 3, ניתן להשתמש בשיטה כדי לדמיין תחרות תוך-מין באופן הממחיש מאוד. על ידי איתור הדגימות על אזורים קטנים, הרכב השיבוט של אוכלוסיית התאים נעשה גלוי במבט חטוף. למרות שאינה מתאימה לניתוחים כמותיים, גישה זו שימושית להערכת ההשפעה של פרמטרי צמיחה שונים(כלומרמקור חנקן) על התפתחות אוכלוסיית תאים שהכילה בתחילה את שני הזנים בכמויות שוות (איור 3). יתר על כן, בגישה בקנה מידה קטן את הכושר של זנים שונים B. subtilis שטופחו תחת אותו מצב צמיחה ניתן לבדוק באמצעות צלחת אגר אחת. לניתוחים כמותיים מומלץ להפיץ את הדגימות על פני כל פני השטח של צלחת אגר. זה ימנע כיסוי של המושבות ובכך יאפשר זיהוי מובהק ומחוז של מושבות שיצאו מתאים בודדים. על ידי ציפוי דילולים מתאימים על לוחות אגר ניתן לקבוע במדויק את הרכב השיבוטים של אוכלוסיית התאים לאורך זמן פשוט על ידי ספירת המושבות הפלואורסצנטיות הצהובות והכחולות (ראו איור 4). כפי שדיווחנו בעבר, פעילות GDH משפיעה מאוד על הכושר של B. subtilis בהתאם לזמינות של גלוטמט אקסוגני2. ברור, בהיעדר פעילות GDH גלוטמט אקסוגני ברמה גבוהה הוא חסרון עבור החיידקים כמו האנזימים RocG ו GudB להשפיל גלוטמט כי יש צורך אנבוליזם (ראה איור 1 ואיור 4A). לעומת זאת, אם מסופק לחיידקים, גלוטמט יכול לשמש כתורם קבוצת אמינו בתגובות transamination. יתר על כן, גלוטמט יכול להיות מוזן לתוך חילוף החומרים פחמן ומשמש כמקור אנרגיה בשל נוכחותם של פעיל קטבולי GDHs RocG ו GudB (איור 1 ואיור 4B). כפי שמוצג באיורים 4C ו- 4D, תוצאות דומות התקבלו בניסוי מתג צבע. שוב, חיידקים המצוידים בפעילות GDH ברמה גבוהה היו outcompeted על ידי תאים עם פעילות GDH מופחתת במדיה צמיחה חסר גלוטמט. לעומת זאת, חיידקים סינתזה רק GDH פעיל אחד בוטלו מהתרבות כאשר המדיום היה בתוספת גלוטמט. כפי שניתן לראות באיורים 5A ו- 5B, ההרכב הראשוני של אוכלוסיית התאים המעורבים נותר כמעט קבוע לאורך זמן. כך, בניסוי התחרות חיסול אחד משני הזנים שהיו מצוידים בכמויות שונות של פעילות GDH לא נבע מפגם גדילה שנגרם על ידי הפלואורופורים (ראו איור 4). יחד, השימוש בפלואורופורים הוא כלי רב עוצמה לניטור תחרות תוך-מין באוכלוסיית תאי חיידקים.
איור 1. הקשר בין חילוף החומרים של פחמן וחנקן ב B. subtilis. כאשר גלוטמט אינו מסופק על ידי המדיום, תורם האמינו העיקרי הדרוש לאנאבוליזם מסונתז מאמוניום ו -2-אוקסוגלוטארט על ידי הפעולה המשולבת של סינתטאז גלוטמין (GS) והסינתאז גלוטמט (GOGAT). לעומת זאת, בנוכחות גלוטמט אקסוגני GDHs RocG פעיל קטבולית ו / או GudB יכול להשפיל גלוטמט אמוניום ו 2-oxoglutarate, אשר לאחר מכן משמש כמקור פחמן.
איור 2. זרימת עבודה ניסיונית. זן 1 (מסומן עם yfp)וזן 2 (שכותרתו עם cfp) נבדלים אחד מהשני. בדוגמה המוצגת כאן, השווינו את ההשפעה של גלוטמט אקסוגני (משפיע) על השינוי genotypic של אוכלוסיית התא שהכיל בתחילה 50% של rocG+ gudB+ (קידוד שני GDHs פעיל) ו 50% של rocG+ gudBCR (קידוד אחד GDH פעיל) תאים. לחץ כאן כדי להציג תמונה גדולה יותר.
איור 3. גישה חצי-תחרותית להמחשת תחרות תוך-מין באופן תיאורי (ראה סעיף 5). לפני cocultivation (0 שעות), ואחרי 7 שעות ו 24 שעות של דילול צמיחה (10-4)של תאים נצפו על לוחות אגר SP. התאים ששרדו שיצרו מושבות לאחר 12 שעות של דגירה ב 37 מעלות צלזיוס זוהו על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי סטריאו. זמן חשיפה, 0.6 שניות; סרגל קנה מידה, 1 מ"מ. נתון זה שונה מגונקה ואח '. 20132.
איור 4. כימות התחרות התוך-מין. לאחר דילול מדגם והפצה של התאים (ראה שלבים 3.1-3.3) על SP בינוני הלוחות היו דגירה לילה ב 37 °C (69 °F). מושבות צהובות וכחולות כובו כמתואר בפרוטוקולים 4 ו-6. קווי השגיאה השחורים מייצגים סטיות תקן עבור לפחות ארבעה ניסויים חוזרים ונשנים באופן עצמאי. כל לוחית אגר הכילה לפחות 100 מושבות. (A)בהיעדר גלוטמט אקסוגני זן B. subtilis BP40 (צהוב) מצויד רק אחד פונקציונלי GDH outcompetes זן BP54 (כחול), אשר מסנתז הן אנזימים משפיל גלוטמט, RocG ו GudB. (B) לעומת זאת, סינתזה של שני GDHs פונקציונלי הוא יתרון עבור החיידקים כאשר גלוטמט אקסוגני זמין כי בנוסף לגלוקוז, גלוטמט משמש כמקור פחמן. כפי שמוצג ב-( C) ו - (D), תוצאות דומות התקבלו בניסוי מתג צבע. נתון זה שונה מגונקה ואח '. 20132. לחץ כאן כדי להציג תמונה גדולה יותר.
איור 5. ניסוי בקרה כדי להעריך את ההשפעה של גנים cfp קידוד פלואורופור ו yfp על הכושר של החיידקים. אוכלוסיות מעורבות של הזנים isogenic BP40 (rocG+ gudBCR amyE::yfp)ו BP41 (rocG+ gudBCR amyE::cfp) או BP52 (rocG+ gudB+ amyE::cfp) ו- BP156 (rocG+ gudB+ amyE::yfp)גדלו בהיעדרות (A) ובנוכחות (B) של גלוטמט אקסוגני. התאים ששרדו נספרו כמתואר בפרוטוקולים 1-4 ו-6, בהתאמה. מייצגי הפעילויות מייצגים סטיות תקן עבור לפחות ארבעה ניסויים חוזרים ונשנים באופן עצמאי. נתון זה שונה מגונקה ואח '. 20132. לחץ כאן כדי להציג תמונה גדולה יותר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
מספר שיטות פותחו כדי לנתח כושר תחרותי שלחיידקים 16. במקרים רבים החיידקים תויגו עם קלטות עמידות לאנטיביוטיקה שונות17. בדומה לגישה שלנו, תיוג התאים עם קלטות עמידות לאנטיביוטיקה מאפשר הערכה של כושר תחרותי של החיידקים במהלך cocultivation בתנאי גדילה מוגדרים. יתר על כן, שיטה זו יכולה לשמש כדי לקבוע כושר תחרותי של תאים שונים זה מזה בוקוס מסוים על הכרומוזום17. עם זאת, ישנם כמה חסרונות באמצעות קלטות עמידות לאנטיביוטיקה כדי לפקח על כושר תחרותי. כמו הביטוי של הגנים ההתנגדות מונעת בעיקר על ידי מקדמים שיש כוח לא שוויוני האנזימים המעניקים עמידות לאנטיביוטיקה מיוצרים כנראה ברמות שונות. לכן, אפקטי כושר חלשים עשויים להיות לא לזיהוי עם גישה זו. בגישה שלנו, שני הגנים פלואורופור שולבו עם אותו סמן בחירה הביטוי שלהם מונע על ידי אותם מקדמים2. חיסרון נוסף כדי לפקח על כושר תחרותי עם קלטות עמידות לאנטיביוטיקה עשוי להיות כי הגישה היא מייגעת יותר כמו שני סוגים של צלחות אגר בתוספת אנטיביוטיקה המתאימה נדרשים לספירת המושבה. לחלופין, כושר של חיידקים יכול להיקבע פשוט על ידי ניטור קצב הצמיחה ועל ידי חישוב של מדד כושר כביכול16. ברור, זוהי הגישה המדויקת ביותר כי החיידקים מעובדים בנפרד ותרכובות רעילות שעשויות להיות מיוצרות על ידי זן עם גנוטיפ מסוים לא ישפיע על הצמיחה של המתח המתחרה. יתר על כן, אין צורך להשתמש באנטיביוטיקה שעלולה להשפיע על הצמיחה של התאים. עם זאת, שתי הגישות אינן מאוד להמחשה כמו המספרים המתארים כושר תחרותי יכול להיות מוצג רק בצורה ניטרלית למדי.
השימוש בגנים קידוד פלואורופור כדי לפקח ולכמת תחרות intraspecies יש מספר יתרונות על פני שיטות אחרות. אם שני הזנים שילבו את הגנים קידוד פלואורופור על ידי רקומבינציה הומולוגית כפולה לתוך הכרומוזום, אין צורך להשתמש באנטיביוטיקה בכל אחד משלבי הטיפוח. לכן, דגימות שנלקחות מהתרבות במהלך הטיפוח ניתן לנתח על אותו מדיום צמיחה ושני הזנים מסוגלים לגדול. גישה זו מאפשרת הדמיה של תחרות תוך-מין בצורה מאוד הממחישה. יתר על כן, באמצעות גישה זו semiquantitative מספר תנאי צמיחה ניתן לבחון בו זמנית זנים רבים ושונים ניתן להשוות במקביל. לבסוף, אין צורך קיבוע של דגימות על שקופיות מיקרוסקופ כי הדגימות שנלקחו מתרבות החיידקים במהלך cocultivation ניתן לאחסן במקפיא18. לכן, ניתן לנתח את כל הדגימות והשכפולים בו-זמנית.
יש לציין שני צעדים קריטיים בפרוטוקול שלנו. חשוב לציין כי cryostocks צריך להכיל כמויות שוות של תאים באותו שלב הצמיחה של כל זן מתחרה. חוסר פרופורציה ראשונית של הזנים בהקפאה וכתוצאה מכך בבקבוקי טלטול לפני תחילת הניסוי תהיה השפעה חזקה על התוצאה של ניסוי התחרות. לכן, זה חכם לבדוק את הרכב cryostocks לפני הניסוי. יתר על כן, כמות מתאימה של תאים צריך להיות מופץ באופן שווה על הצלחת. אחרת המושבות המתעוררות קרובות מדי זו לזו וקביעה מדויקת של התאים ששרדו תהיה קשה.
יש גם כמה מגבלות וחסרונות של הגישה מבוססת פלואורופור. Cocultivation בקורא צלחת רב-באר וזיהוי בו זמנית של אותות CFP ו- YFP אינו אפשרי מכיוון שספקטרום העירור והפליטה של הפלואורופורים קרובים מדי זה לזה. עם זאת, ניתן לעקוף בעיה טכנית זו באמצעות חלבונים פלואורסצנטיים שונים, כגון אלה הפולטים אור ירוק ואדום, המבוססים באופן אופטימלי על אותו פיגום חלבון. חיסרון נוסף של הגישה מבוססת פלואורופור יכול להיות כי מוטציות מסוימות לגרום רק פגם צמיחה חלש של החיידקים. לכן, אם פגם הצמיחה שעלול להיגרם על ידי אחד הגנים קידוד פלואורופור חזק יותר מאשר פגם הצמיחה הנגרמת על ידי מוטציה מסוימת, הגישה מבוססת פלואורופור אינו מתאים לנתח תחרות intraspecies. לכן, לפני יצירת קבוצה שלמה של זנים מומלץ לתייג תחילה רק את זן האב עם שניהם, cfp ו yfp, ולשקול את הזנים. ניסויי הצמיחה יחשפו עד כמה חזקים הפלואורופורים משפיעים על כושרם של החיידקים (ראו איורים 5A ו- 5B).
בעתיד יהיה מעניין לבדוק אם הגישה המבוססת על פלואורופור לניטור תחרות תוך-מין תהיה מדויקת יותר ופחות מייגעת אם התאים ששרדו ייספרו באמצעות ציטומטריית זרימה. לאחרונה, cytometry זרימה הוכח להיות כלי רב עוצמה לנתח את ההרכב של B. subtilis biofilms19. יתר על כן, זה עשוי להיות מתאים יותר לנתח אפקטים כושר חלש המשפיעים על כושר תחרותי של חיידקים על ידי cocultivation מתמשך של חיידקים פלואורופור שכותרתו תסיסה. בניגוד לבקבוקי טלטול, גישה זו מאפשרת לשמור על תנאי הצמיחה קבועים ובכך לפקח על תחרות תוך-מין לאורך תקופה ארוכה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.
Acknowledgments
העבודה במעבדת המחברים נתמכה על ידי דויטשה פורסונגסג'מינשפט (http://www.dfg.de; CO 1139/1-1), פונדס דר Chemischen Industrie (http://www.vci.de/fonds), ומרכז גטינגן לביולוגיה מולקולרית (GZMB). המחברים מבקשים להכיר יורג Stülke עבור הערות מועילות וקריאה ביקורתית של כתב היד.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| (NH4)2SO4 | Roth, Germany | 3746 | |
| Agar | Difco, USA | 214010 | |
| Ammonium ferric citrate (CAF) | Sigma-Aldrich, Germany | 9714 | |
| CaCl2 | Roth, Germany | 5239 | |
| Glucose | Applichem, Germany | A3617 | |
| Glycerol | Roth, Germany | 4043 | |
| K2HPO4•3H2O | Roth, Germany | 6878 | |
| KCl | Applichem, Germany | A3582 | |
| KH2PO4 | Roth, Germany | 3904 | |
| KOH | Roth, Germany | 6751 | |
| MgSO4•7H2O | Roth, Germany | P027 | |
| MnCl2 | Roth, Germany | T881 | |
| MnSO4•4H2O | Merck Millipore, Germany | 102786 | |
| NaCl | Roth, Germany | 9265 | |
| Nutrient broth | Roth, Germany | X929 | |
| Potassium glutamate | Applichem, Germany | A3712 | |
| Tryptone | Roth, Germany | 8952 | |
| Tryptophan | Applichem, Germany | A3445 | |
| Yeast extract | Roth, Germany | 2363 | |
| 1.5 ml Reaction tubes | Sarstedt, Germany | 72,690,001 | |
| 2.0 ml Reaction tubes | Sarstedt, Germany | 72,691 | |
| 15 ml Plastic tubes with screw cap | Sarstedt, Germany | 62,554,001 | |
| Petri dishes | Sarstedt, Germany | 82.1473 | |
| 1.5 ml Polystyrene cuvettes | Sarstedt, Germany | 67,742 | |
| 15 ml Glass culture tubes | Brand, Germany | 7790 22 | |
| 100 ml Shake flasks with aluminium caps | Brand, Germany | 928 24 | |
| Sterile 10 ml glass pipettes | Brand, Germany | 278 23 | |
| Incubator (28 and 37 °C) | New Brunswick | M1282-0012 | |
| Standard pipette set (2-20 μl, 10-100 μl, 100-1,000 μl) | Eppendorf, Germany | 4910 000.034, 4910 000.042, | |
| Table top centrifuge for 1.5 and 2 ml reaction tubes | Thermo Scientific, Heraeus Fresco 21, Germany | 75002425 | |
| Table top centrifuge for 15 ml plastic tubes | Heraeus Biofuge Primo R, Germany | 75005440 | |
| Standard spectrophotometer | Amersham Biosciences Ultrospec 2100 pro, Germany | 80-2112-21 | |
| Stereofluorescence microscope | Zeiss SteREO Lumar V12, Germany | 495008-0009-000 | |
| Freezer (-20 and -80 °C) | - | - | |
| Fridge (4 °C) | - | - | |
| Autoclave | Zirbus, LTA 2x3x4, Germany | - | |
| pH meter | pH-meter 766, Calimatic, Knick, Germany | 766 | |
| Vortex | Vortex 3, IKA, Germany | 3340000 | |
| Balance | CP2202S, Sartorius, Germany | replaced by | |
| Black pen (permanent marker) | Staedler, Germany | 317-9 | |
| Powerpoint program | Microsoft, USA | - | |
| Office Excel program | Microsoft, USA | - | Program for data processing |
| Adobe Photoshop CS5 | Adobe, USA | replaced by CS6, download | Computer program for image processing |
| Computer | PC or Mac | - | |
| ZEN pro 2011 software for the stereofluorescence microscope | Zeiss, Germany | 410135 1002 110 | AxioCam MRc Rev. Obtained through Zeiss |
| Specific solution recipes | |||
| SP Medium | |||
| 8 g Nutrient broth | |||
| 0.25 mg MgSO4•7H2O | |||
| 1 g KCl | |||
| 15 g agar for solid SP medium | if required | ||
| add 1 L with H2O | autoclave for 20 min at 121 °C | ||
| 1 ml CaCl2 (0.5 M), sterilized by filtration | |||
| 1 ml MnCl2 (10 mM), sterilized by filtration | |||
| 2 ml ammonium ferric citrate (CAF, 2.2 mg/ml), sterilized by filtration | |||
| LB Medium | |||
| 10 g Tryptone | |||
| 5 g Yeast extract | |||
| 10 g NaCl | |||
| 15 g agar for solid LB medium | if required | ||
| add 1 L with H2O | autoclave for 20 min at 121 °C | ||
| C-Glc Minimal Medium | |||
| 200 ml 5 x C salts | |||
| 10 ml L-Tryptophan (5 mg/ml), sterilized by filtration | |||
| 10 ml ammonium ferric citrate (CAF, 2.2 mg/ml), sterilized by filtration | |||
| 10 ml III’ salts | |||
| 25 ml Glucose (20%) | autoclaved for 20 min at 121 °C | ||
| add 1 L with sterile H2O | |||
| CE-Glc Minimal Medium | |||
| 200 ml 5 x C salts | |||
| 10 ml L-Tryptophan (5 mg/ml), sterilized by filtration | |||
| 10 ml ammonium ferric citrate (CAF, 2.2 mg/ml), sterilized by filtration | |||
| 10 ml III’ salts | |||
| 20 ml Glutamate (40%) | |||
| 25 ml Glucose (20%), autoclaved for 20 min at 121 °C | |||
| add 1 L with sterile H2O | |||
| 5 x C salts | |||
| 20 g KH2PO4 | |||
| 80 g K2HPO4•3H2O | |||
| 16.5 g (NH4)2SO4 | |||
| add 1 L with sterile H2O | autoclave for 20 min at 121 °C | ||
| III’ salts | |||
| 0.232 g MnSO4•4H2O | |||
| 12.3 g MgSO4•7H2O | |||
| add 1 L with sterile H2O, autoclave for 20 min at 121 °C | |||
| 40% Glutamate solution | |||
| 200 g L-Glutamic acid | |||
| adjust the pH to 7.0 by adding approximately 80 g KOH | |||
| add 0.5 L with sterile H2O | autoclave for 20 min at 121 °C | ||
| 0.9% Saline (NaCl) Solution | |||
| add 1 L with sterile H2O | autoclave for 20 min at 121 °C | ||
| 50% Glycerol solution | |||
| 295 ml Glycerol (87%) | |||
| add 0.5 L with sterile H2O | autoclave for 20 min at 121 °C | ||
| Bacteria (All strains are based on the Bacillus subtilis strain 168) | |||
| Bacillus subtilis BP40 (rocG+ gudBCR amyE::PgudB-yfp) | Laboratory strain collection | ||
| Bacillus subtilis BP41 (rocG+ gudBCR amyE::PgudB-cfp) | |||
| Bacillus subtilis BP52 (rocG+ gudB+ amyE::PgudB-cfp) | |||
| Bacillus subtilis BP156 (rocG+ gudB+ amyE::PgudB-yfp) | |||
References
- Buescher, F. I., et al. Global network reorganization during dynamic adaptations of Bacillus subtilis metabolism. Science. 335, 1099-1103 (2012).
- Gunka, K., Stannek, L., Care, R. A., Commichau, F. M. Selection-driven accumulation of suppressor mutants in Bacillus subtilis: the apparent high mutation frequency of the cryptic gudB gene and the rapid clonal expansion of gudB+ suppressors are due to growth under selection. PLoS One. 8, (2013).
- Al Mamum, A. A. M., et al. Identity and function of a large gene network underlying mutagenic repair of DNA breaks. Science. 338, 1344-1348 (2012).
- Koeppel, A. F., Wertheim, J. O., Barone, L., Gentile, N., Krizanc, D., Cohan, F. M. Speedy speciation in a bacterial microcosm: new species can arise as frequently as adaptations within a species. ISME J. 7, 1080-1091 (2013).
- Maughan, H., Nicholson, W. L. Increased fitness and alteration of metabolic pathways during Bacillus subtilis evolution in the laboratory. Appl. Environ. Microbiol. 77, 4105-4118 (2011).
- Burkholder, P. R., Giles, N. H. Induced biochemical mutations in Bacillus subtilis. Am. J. Bot. 34, 345-348 (1947).
- McLoon, A. L., Guttenplan, S. B., Kearns, D. B., Kolter, R., Losick, R. Tracing the domestication of a biofilm-forming bacterium. J. Bacteriol. 193, 2027-2034 (2011).
- Zeigler, D. R., et al. The origins of 168, W23, and other Bacillus subtilis legacy strains. J. Bacteriol. 190, 6983-6995 (2008).
- Gunka, K., Tholen, S., Gerwig, J., Herzberg, C., Stülke, J., Commichau, F. M. A high-frequency mutation in Bacillus subtilis: requirements for the decryptification of the gudB glutamate dehydrogenase. 194, 1036-1044 (2012).
- Commichau, F. M., et al. Characterization of Bacillus subtilis mutants with carbon source-independent glutamate biosynthesis. J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 12, 106-113 (2007).
- Beckwith, J. Genetic suppressors and recovery of repressed biochemical memory. J. Biol. Chem. 284, 12585-12592 (2009).
- Gunka, K., Commichau, F. M. Control of glutamate homeostasis in Bacillus subtilis: a complex interplay between ammonium assimilation, glutamate biosynthesis and degradation. Mol. Microbiol. 85, 213-224 (2012).
- Yan, D. Protection of the glutamate pool concentrations in enteric bacteria. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 9475-9480 (2007).
- Belitsky, B. R., Sonenshein, A. L. Role and regulation of Bacillus subtilis glutamate dehydrogenase genes. J. Bacteriol. 180, 6298-6305 (1998).
- Commichau, F. M., Herzberg, C., Tripal, P., Valerius, O., Stülke, J. A regulatory protein-protein interaction governs glutamate biosynthesis in Bacillus subtilis: the glutamate dehydrogenase RocG moonlights in controlling the transcription factor GltC. Mol. Microbiol. 65, 642-654 (2007).
- Gordo, I., Perfeito, L., Sousa, A. Fitness effects of mutations in bacteria. J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 21, 20-35 (2011).
- Rabatinová, A., et al. The δ subunit of RNA polymerase is required for rapid changes in gene expression and competitive fitness of the cell. J. Bacteriol. 195, 2603-2611 (2013).
- Capra, E. J., Perchuk, B. S., Skerker, J. M., Laub, M. T. Adaptive mutations that prevent crosstalk enable the expansion of paralogous signalling protein families. Cell. 150, 222-232 (2012).
- García-Betancur, J. C., Yepes, A., Schneider, J., Lopez, D. Single-cell analysis of Bacillus subtilis biofilms using fluorescence microscopy and flow cytometry. J. Vis. Exp. (15), (2012).
