Summary
बैक्टीरिया अपने जीवनकाल के दौरान या तो हानिकारक या फायदेमंद उत्परिवर्तन जमा कर सकते हैं। कोशिकाओं की आबादी में उन व्यक्तियों की आबादी जो लाभकारी उत्परिवर्तन जमा करते हैं, तेजी से अपने साथियों को मात खा सकते हैं। यहां हम फ्लोरोसेंटली लेबल वाले व्यक्तियों का उपयोग करके समय के साथ बैक्टीरियल सेल आबादी में इंट्राप्रजातियों की प्रतिस्पर्धा की कल्पना करने के लिए एक सरल प्रक्रिया प्रस्तुत करते हैं।
Abstract
बैक्टीरिया जैसे कई सूक्ष्मजीव बहुत तेजी से पैदा होते हैं और आबादी उच्च कोशिका घनत्व तक पहुंच सकती है। जनसंख्या में कोशिकाओं के छोटे अंशों में हमेशा जमा उत्परिवर्तन होते हैं जो या तो हानिकारक होते हैं या कोशिका के लिए फायदेमंद होते हैं। यदि उत्परिवर्तन का फिटनेस प्रभाव एक मजबूत चयनात्मक विकास लाभ के साथ उपआबादी प्रदान करता है, तो इस उपजनसंख्या के व्यक्ति तेजी से प्रतिस्पर्धा कर सकते हैं और यहां तक कि अपने तत्काल साथियों को पूरी तरह से खत्म कर सकते हैं। इस प्रकार, छोटे आनुवंशिक परिवर्तन और कोशिकाओं के चयन संचालित संचय है कि लाभकारी उत्परिवर्तन हासिल कर लिया है एक सेल आबादी के जीनोटाइप का एक पूरा बदलाव करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं । यहां हम ग्राम-सकारात्मक मॉडल जीवाणु जीवाणु उपतिलिसके व्यक्तियों को फ्लोरोसेंटली लेबल किए गए फ्लोरोसेंटली लेबल के अनुकूल द्वारा समय के साथ बैक्टीरियल सेल आबादी में क्रमशः लाभकारी और हानिकारक उत्परिवर्तनों के तेजी से क्लोनल विस्तार और उन्मूलन की निगरानी करने के लिए एक प्रक्रिया प्रस्तुत करते हैं। विधि एक जीवाणु कोशिका आबादी में व्यक्तियों के बीच इंट्राप्रजाति प्रतिस्पर्धा प्रदर्शित करने के लिए प्रदर्शन करना आसान और बहुत उदाहरण है।
Introduction
मृदा बैक्टीरिया आमतौर पर लचीले नियामक नेटवर्क और व्यापक चयापचय क्षमताओं से संपन्न होते हैं। दोनों विशेषताएं कोशिकाओं को पोषक तत्वों के लिए अपने साथियों और अन्य सूक्ष्मजीवों के साथ प्रतिस्पर्धा करने के लिए अपने कैटाबोलिक और एनाबोलिक रास्तों को समायोजित करने में सक्षम करती हैं, जो किसी दिए गए पारिस्थितिक आला1में उपलब्ध हैं। हालांकि, अगर बैक्टीरिया अपने पर्यावरण के लिए अनुकूल करने में असमर्थ हैं अन्य तंत्र एक प्रजाति के अस्तित्व के लिए खाते में हो सकता है। दरअसल, के रूप में कई बैक्टीरिया तेजी से पैदा होता है और आबादी उच्च सेल घनत्व उपआबादी तक पहुंच सकते है अनायास लाभप्रद उत्परिवर्तन है कि एक चयनात्मक विकास लाभ के साथ कोशिकाओं को प्रदान करते है और इसलिए उनकी फिटनेस में वृद्धि जमा हो सकता है । इसके अलावा, उत्परिवर्तनीय हॉटस्पॉट और तनाव-प्रेरित अनुकूली म्यूटेनेसिस एक मैलाडैप्टेड जीवाणु2,3के विकास की सुविधा प्रदान कर सकता है। इस प्रकार, निरंतर चयन के तहत उत्परिवर्तन और विकास का संचय विशाल माइक्रोबियल विविधता के लिए मूल है, यहां तक कि एक ही जीनस4,5के भीतर भी। प्रकृति के रूप में, चयन के तहत निरंतर खेती के कारण प्रयोगशाला में जीवाणु जीनोम को आकार देना भी होता है। इसका उदाहरण ग्राम-सकारात्मक जीवाणु बी उपटिलि के पालतू जानवरों द्वारा किया जाता है, जिसका उपयोग दुनिया भर में बुनियादी अनुसंधान और उद्योग में किया जाता है। 1940 के दशक में बी सबटिलिस डीएनए हानिकारक एक्स-रे के साथ इलाज किया गया था और एक विशिष्ट विकास की स्थिति6के तहत खेती के बाद । कई विकास विशेषताओं के नुकसान के लिए उनके पालतू खाते के दौरान बैक्टीरिया में जमा हुए उत्परिवर्तन, यानी बी सबटिलिस प्रयोगशाला तनाव 168 ने जटिल उपनिवेशों को7,8बनाने की क्षमता खो दी।
आजकल, सबसे अच्छा अध्ययन मॉडल बैक्टीरिया Escherichia कोलाई और बी उपटिलिके लिए, शक्तिशाली उपकरणों की एक किस्म आनुवंशिक रूप से अपने जीनोम में हेरफेर करने के लिए विशिष्ट वैज्ञानिक सवालों को संबोधित करने के लिए उपलब्ध है । कभी-कभी ब्याज के जीन की निष्क्रियता एक गंभीर विकास दोष का कारण बनती है, जो तब मानक विकास माध्यम9पर स्पष्ट रूप से दिखाई देती है। इसके विपरीत, उत्परिवर्तन जो कमजोर विकास दोष का कारण बनते हैं और इस प्रकार केवल थोड़ा तनाव की फिटनेस को प्रभावित करते हैं, अक्सर नजरअंदाज कर दिए जाते हैं। हालांकि, दोनों ही मामलों में कई पीढ़ियों के लिए उत्परिवर्ती उपभेदों के लंबे समय तक इनक्यूबेशन और पासिंग के परिणामस्वरूप आमतौर पर दमनक म्यूटेंट का संचय होता है जिसने माता-पिता के तनाव2,9के फेनोटाइप को बहाल कर दिया है। दमनक म्यूटेंट का लक्षण वर्णन और उत्परिवर्तनों की पहचान जिसने मूल उत्परिवर्ती तनाव के विकास दोष को बहाल किया है, एक बहुत ही उपयोगी दृष्टिकोण है जो महत्वपूर्ण और अक्सर उपन्यास सेलुलर प्रक्रियाओं को स्पष्ट करने की अनुमति देता है10,11।
हम बी सबटिलिस12में ग्लूटामेट होयोस्टेसिस के नियंत्रण में रुचि रखते हैं । ई कोलाईके समान, बी सबटिलिस ग्लूटामेट हो्योस्टेसिस(यानीग्लूटामेट रक्षित क्षरण2में ब्लॉक) के संवर्तन का जवाब देता है। सहज उत्परिवर्तन द्वारा प्राप्त किए गए इन दमनरोधी म्यूटेंट में जीनोमिक परिवर्तन ों को ग्लूटामेट होमोस्टेसिस9,13को तेजी से बहाल करने के लिए दिखाया गया था। इसलिए, यह आश्चर्य की बात नहीं है कि जीवाणु के पालतू के दौरान एक विशिष्ट विकास स्थिति में बी उपटिलि का अनुकूलन एंजाइम संश्लेषण में और विकसित एंजाइमेटिक गतिविधियों में प्रतिबिंबित होता है, जो ग्लूटामेट मेटाबोलिज्म12में शामिल हैं। यह सुझाव दिया गया है कि पालतू बनाने की प्रक्रिया के दौरान विकास माध्यम में बहिर्जात ग्लूटामेट की कमी प्रयोगशाला तनाव 1682,14में गुप्त ग्लूटामेट डेहाइड्रोजनेज (जीडीएच) गुड्बसीआर जीन के उद्भव और निर्धारण के लिए प्रेरक शक्ति थी। इस परिकल्पना को हमारे इस अवलोकन द्वारा समर्थन दिया जाता है कि प्रयोगशाला तनाव में जीडीएच गतिविधि की कम मात्रा बैक्टीरिया को एक चयनात्मक विकास लाभ प्रदान करती है जब बहिर्जात ग्लूटामेट दुर्लभ होता है2. इसके अलावा, बी सबटिलिस स्ट्रेन की खेती, जीडीएच गुड्ब को संश्लेषित करते हुए, बहिर्जात ग्लूटामेट के अभाव में दमनक म्यूटेंट के संचय में परिणाम होता है जिसने गुड्ब जीन2को निष्क्रिय कर दिया है। जाहिर है, कैटाबोलिक रूप से सक्रिय GDH की उपस्थिति कोशिका के लिए हानिकारक है क्योंकि अंतर्जात रूप से निर्मित ग्लूटामेट जिसका उपयोग अन्यथा एनाबोलिज्म के लिए किया जा सकता है, अमोनियम और 2-ऑक्सोग्लूटारेट(चित्रा 1)के लिए अपमानित किया जाता है। इसके विपरीत, जब ग्लूटामेट माध्यम द्वारा प्रदान किया जाता है, तो उच्च स्तरीय GDH गतिविधि से लैस बी सबटिलिस तनाव में एक तनाव पर चयनात्मक विकास लाभ होता है जो केवल एक कार्यात्मक GDH को संश्लेषित करता है। यह मानना उचित है कि उच्च स्तरीय GDH गतिविधि बैक्टीरिया को मध्यम2 द्वारा प्रदान किए गए अन्य कार्बन स्रोतों के अलावा दूसरे कार्बन स्रोत के रूप में ग्लूटामेट का उपयोग करने की अनुमति देती है (चित्र 1 देखें)। इस प्रकार, जीडीएच गतिविधि एक्सोजेनस ग्लूटामेट की उपलब्धता के आधार पर बैक्टीरिया की फिटनेस को दृढ़ता से प्रभावित करती है।
यहां हम दो बी सबटिलिस उपभेदों के बीच इंट्राप्रजाति प्रतिस्पर्धा की निगरानी और कल्पना करने के लिए एक बहुत ही उदाहरण विधि प्रस्तुत करते हैं जो गुणसूत्र(चित्रा 2)पर एक ही लोकस में भिन्न होते हैं। दो उपभेदों को वाईएफपी और सीएफपी जीन के साथ फ्लोरोफोरस वाईएफपी और सीएफपी को एन्कोडिंग और विभिन्न पोषण स्थितियों के तहत cocultivated के साथ लेबल किया गया था । समय के साथ नमूना लेने और आगर प्लेटों पर उचित कमजोर पड़ने चढ़ाना द्वारा संस्कृतियों में से प्रत्येक में बचे आसानी से एक आम स्टीरियो फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप का उपयोग कर निगरानी की जा सकती है । इस पेपर में वर्णित प्रक्रिया समय के साथ सेल आबादी में क्रमशः लाभकारी और हानिकारक उत्परिवर्तनों के तेजी से क्लोनल विस्तार और उन्मूलन की कल्पना करने के लिए प्रदर्शन करना आसान और उपयुक्त है।
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Protocol
1. आगर प्लेट्स, कल्चर मीडिया, क्रायोस्टॉक्स और प्रीकल्चर की तैयारी
- विकास मीडिया और आवश्यक अभिकर् ता तैयार करें (सामग्रियों और अभिकर् कों की तालिका देखें)।
- बी सबटिलिस उपभेदों को लकीर(उदाहरण के लिए। BP40(rocG+ gudBसीआर amyE: :P gudB-yfp)और BP52(rocG+ gudB+ amyE: :PgudB-cfp)क्रमशः एक और दो सक्रिय GDHs व्यक्त)2 कि सपा मध्यम आगर प्लेटों पर प्रतियोगिता प्रयोग में इस्तेमाल किया जाएगा एकल कालोनियों मिलता है । प्लेटों को रात भर 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
- एकल उपनिवेशों को लें और 4 मिलीलीटर एलबी तरल माध्यम वाली बाँझ संस्कृति ट्यूबों को टीका करें। बैक्टीरिया को रात भर 28 डिग्री सेल्सियस और 220 आरपीएम पर उगाएं।
- 28 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात संस्कृतियों को बढ़ने से बचने के लिए कि कोशिकाओं को lyse या स्पोरेट।
- एक मानक स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग करके 600 एनएम (ओडी600)की तरंगदैर्ध्य पर संस्कृतियों के ऑप्टिकल घनत्व को मापें।
- यदि संस्कृतियां2.0 के ओडी 600 तक पहुंच गई हैं, तो 1.5 मिलीलीटर प्रतिक्रिया ट्यूबों में बाँझ 50% ग्लाइसरोल समाधान के 0.75 मिलीलीटर के साथ संस्कृतियों के 0.75 मिलीलीटर मिलाएं। अंतिम ओडी600 1.0 होना चाहिए जिसमें क्रायोस्टॉक्स प्राप्त हो सके जिसमें लगभग 108 कोशिकाएं/एमएल हों।
- ट्यूबों को -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
- सीएफपी और वाईएफपी एन्कोडिंग फ्लोरोफोर जीन के साथ लेबल किए गए प्रत्येक तनाव की तीन प्रीकल्चर बनाएं। -80 डिग्री सेल्सियस क्रायोस्टॉक्स से 1 माइक्रोन कोशिकाओं के साथ प्रीकल्चर (बाँझ संस्कृति ट्यूब जिसमें 4 मिलीलीटर एलबी तरल माध्यम होते हैं) टीका लगाते हैं। संस्कृतियों को रात भर 28 डिग्री सेल्सियस और 220 आरपीएम पर इनक्यूबेट करें।
2. बैक्टीरिया, नमूना संग्रह, और नमूना भंडारण के Cocultivation
- हौसले से तैयार 100 मिली सी-जीएलसी और सीई-जीएलसी न्यूनतम माध्यम (अभिकर्मकों और सामग्रियों की तालिका देखें), और प्रत्येक माध्यम के 20 मिलीलीटर बाँझ 100 मिलीलीटर शेक फ्लास्क में स्थानांतरित करें।
- रातोंरात उगाए गए प्रीकल्चर के 0.1 मिलीलीटर लें, उन्हें 1.5 मिलीलीटर क्यूवेट में 0.9 मिलीलीटर एलबी माध्यम के साथ पतला करें, और ओडी600निर्धारित करें।
- प्रतियोगिता प्रयोग के लिए, विभिन्न उपभेदों के उन प्रीकल्चर लें जिनके पास1.0-1.5 के बीच समान ओडी 600 है।
- मिश्रित कोशिकाआबादी प्राप्त करने के लिए, प्रीकल्चर की कोशिकाओं को पतला करें जिसमें 20 मिलीलीटर सी-जीएलसी और सीई-जीएलसी न्यूनतम माध्यम में0.05 के ओडी 600 के लिए उपयुक्त ओडी 600 था। प्रतियोगिता प्रयोग के लिए दो उपभेदों को 1:1 अनुपात में मिलाया जाना चाहिए।
- फ्लास्क से 10 मिलीलीटर नमूने लें, उन्हें 15 मिलीलीटर प्लास्टिक ट्यूबों में स्थानांतरित करें, कोशिकाओं को एक मानक तालिका शीर्ष अपकेंद्रित्र में 4,000 x ग्राम पर 10 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र द्वारा फसल करें, और सुपरनैंट को त्यागें।
- कोशिकाओं को 0.5 मिलीलीटर ताजा एलबी माध्यम में फिर से रखें, और कोशिकाओं को बाँझ 1.5 मिलीलीटर प्रतिक्रिया कप में स्थानांतरित करें। 50% बाँझ ग्लिसरोल के 0.5 मिलीलीटर जोड़ें, कठोर भंवर द्वारा निलंबन मिश्रण, और आगे के उपचार तक एक -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में नमूनों की दुकान।
- शेक फ्लास्क में छोड़ी जाने वाली कोशिकाओं को 37 डिग्री सेल्सियस और 220 आरपीएम पर 24 घंटे तक इनक्यूबेट करें। फ्लोरोफोरस की फोटो ब्लीचिंग को रोकने के लिए शेक फ्लैक्स को अंधेरे में रखें।
- 7 घंटे और 24 घंटे की वृद्धि के बाद 0.1 मिलीलीटर के आगे नमूने लें। नमूनों के1:10 कमजोर पड़ने (सी-जीएलसी या सीई-जीएलसी न्यूनतम माध्यम में) के ओडी 600 को मापें और नोट करें।
- क्रायोस्टॉक्स बनाने के लिए प्रत्येक संस्कृति से कोशिकाओं की उचित मात्रा लें जिसमें 1.0 का ओडी600 होता है। आगे के उपचार तक -80 डिग्री सेल्सियस पर नमूनों को स्टोर करें।
3. मात्रात्मक विश्लेषण के लिए नमूना उपचार, चढ़ाना और इनक्यूबेशन
- सभी नमूनों को इकट्ठा करने के बाद, क्रायोस्टॉक्स को पिघलाएं, और कोशिकाओं को 0.9% नमकीन समाधान (अभिकर् टे और सामग्रियों की तालिका देखें) में10-3तक पतला करें।
- एसपी मीडियम एगर प्लेट्स पर 10 -3 कमजोर पड़ने की प्लेट0.1 मिलीलीटर और बाँझ ग्लास पिपेट का उपयोग करके कोशिकाओं को वितरित करें।
- एक कॉलोनियां दिखाई देने तक अंधेरे में 37 डिग्री सेल्सियस पर रात भर प्लेटों को इनक्यूबेट करें।
4. मात्रात्मक विश्लेषण के लिए स्टीरियो फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी द्वारा जीवित बचे लोगों की गिनती
- स्टीरियो फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप के नीचे बचे लोगों की गिनती करते हुए बेहतर अभिविन्यास के लिए चार भागों में काले पेन के साथ आगर प्लेट के नीचे विभाजित करें।
- प्लेट को माइक्रोस्कोप के नीचे उल्टा रखें और कोल्ड लाइट सोर्स का इस्तेमाल कर कॉलोनियों को फोकस में लाएं ।
- एक बार जब उपनिवेशों पर ध्यान केंद्रित किया जाता है, तो सीएफपी-लेबलतनाव की जीवित कोशिकाओं की कल्पना करने के लिए सीएफपी के लिए उपयुक्त फ़िल्टर सेट पर स्विच करें। कॉलोनियों को पेन से लेबल करके इस तनाव से बचे लोगों की गिनती करें और नंबर नोट करें।
- इथेनॉल के साथ लेबल निकालें और वाईएफपी -लेबल तनाव की जीवित कोशिकाओं की कल्पना करने के लिए सेट वाईएफपीफ़िल्टर पर स्विच करें। कॉलोनियों को पेन से लेबल लगाकर बचे लोगों को फिर से गिनें और नंबर नोट करें।
5. नमूना उपचार और अर्धकांश विश्लेषण के लिए माइक्रोस्कोपी
- उदाहरण के आंकड़ों के लिए, एसपी एगर प्लेट पर चरण 3.1 से 10-4 कमजोर पड़ने (लगभग 100 कोशिकाओं) के 10 माइक्रोन को स्पॉट करें (चित्र 3देखें)।
- एक कॉलोनियां दिखाई देने तक अंधेरे में 37 डिग्री सेल्सियस पर रात भर प्लेटों को इनक्यूबेट करें।
- माइक्रोस्कोप के नीचे ढक्कन के बिना पेट्री डिश रखें और ठंडे प्रकाश स्रोत का उपयोग करके स्थान को ध्यान में लाएं।
- उदाहरण के आंकड़ों के लिए स्पॉट की तस्वीरें लें । ठंड प्रकाश स्रोत के साथ कालोनियों की तस्वीरें लेने के लिए एक उपयुक्त जोखिम समय चुनें।
- प्लेट को स्थानांतरित किए बिना, सीएफपी फ़िल्टर सेट पर बदलें, एक्सपोजर समय को समायोजित करें और एक तस्वीर लें। वाईएफपी फिल्टर सेट के साथ भी ऐसा ही करें और आगे के विश्लेषण के लिए चित्रों को सहेजें।
6. डेटा विश्लेषण
- मात्रात्मक डेटा विश्लेषण के लिए एक्सेल जैसे सॉफ्टवेयर का उपयोग करें। गिना हुआ कॉलोनियों के आधार पर, पूरी कॉलोनियों के संबंध में पीले और नीले रंग की कॉलोनियों के प्रतिशत की गणना करें, जो 100% तक सेट हैं।
- एक स्टैक बार आरेख बनाने के लिए गणना की गई संख्याओं का उपयोग करें (चित्र 4 और चित्रा 5देखें)। विभिन्न स्थानों से ली गई तस्वीरों के विलय चित्रों का निर्माण करने के लिए एडोब फोटोशॉप जैसे इमेज-प्रोसेसिंग प्रोग्राम का उपयोग करें। वैकल्पिक रूप से, http://rsbweb.nih.gov/ij/ से डाउनलोड करने योग्य स्वतंत्र रूप से उपलब्ध सॉफ्टवेयर इमेजजे का उपयोग इमेज प्रोसेसिंग के लिए किया जा सकता है।
- सीएफपी फिल्टर सेट और वाईएफपी फिल्टर सेट के साथ लिए गए एक स्थान से चित्र खोलें। मीडिया से किसी भी पृष्ठभूमि फ्लोरेसेंस को कम करने के लिए विपरीत और चमक का अनुकूलन करें।
- चित्रों में से एक के पास जाओ और सभी का चयन करें। तस्वीर को कॉपी करें और इसे दूसरी तस्वीर पर चिपका दें।
- या तो चित्रों को मर्ज करने के लिए फ़ंक्शन "रंग चकमा" का उपयोग करें या चैनल टैब का उपयोग करके फ्लोरोसेंट चित्रों को ओवरले करें। विभिन्न मीडिया और विभिन्न समय बिंदुओं से उपनिवेशों के विलय चित्र तरल संस्कृति के भीतर विभिन्न उपभेदों के विकास का प्रतिनिधित्व करते हैं।
7. विशिष्ट सुझाव: सीएफपी और वाईएफपी के साथ लेबल किए गए आइसोजेनिक उपभेदों का डाई स्विच प्रयोग और कोकृषण
बी सबटिलिस में दो फ्लोरोफोर-एन्कोडिंग जीन में से किसी की अभिव्यक्ति फिटनेस को प्रभावित कर सकती है और इस प्रकार बैक्टीरिया की वृद्धि दर। इसलिए, खेती के दौरान सेल आबादी से एक प्रतियोगी तनाव को समाप्त करने के लिए निम्नलिखित प्रयोगों को करने की सिफारिश की जाती है, बस फ्लोरोफोर के नकारात्मक प्रभाव के कारण होता है:
- पूरे प्रयोग को दोहराएं और विपरीत लेबल वाले उपभेदों को दोहराएं(उदाहरण के लिए पहले सीएफपी-लेबलकिए गए तनाव को अब वाईएफपी जीन और इसके विपरीतके साथ लेबल किया गया है)। हालांकि व्युत्क्रम, प्राप्त परिणाम पिछले अवलोकन के बराबर होना चाहिए कि एक तनाव दूसरे तनाव पर एक चयनात्मक विकास लाभ है ।
- पूरे प्रयोग को दोहराएं और वाईएफपी और सीएफपी (जैसे BP40(आरओजी+ गुडबीसीआर एमी: :Pगुड्ब-वाईएफपी)और BP41(rocG+ gudBCR amyE: :Pगुड्ब-सीएफपी)के साथ लेबल किए गए आइसोजेनिक उपभेदों को दोहराएं । समय के साथ सेल आबादी की संरचना का पालन करके बैक्टीरिया की फिटनेस पर दो फ्लोरोफोरस में से किसी के नकारात्मक प्रभाव का अनुमान लगाएं।
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Representative Results
यहां वर्णित विधि को सफलतापूर्वक एक कोशिका आबादी में इंट्राप्रजातियों की प्रतिस्पर्धा की कल्पना करने के लिए लागू किया गया था जिसमें बी सबटिलिस उपभेद शामिल थे जिन्हें क्रमशः फ्लोरोफोरस सीएफपी और वाईएफपी को एन्कोडिंग सीएफपी और वाईएफपी जीन के साथ लेबल किया गया था। जैसा कि चित्र 3में दिखाया गया है, विधि का उपयोग बहुत ही उदाहरण के तरीके से इंट्राप्रजाति प्रतिस्पर्धा की कल्पना करने के लिए किया जा सकता है। छोटे क्षेत्रों पर नमूनों खोलना द्वारा, सेल आबादी की क्लोनल संरचना एक नज़र में दिखाई दिया गया था । हालांकि मात्रात्मक विश्लेषण के लिए उपयुक्त नहीं है, यह दृष्टिकोण कोशिका आबादी के विकास पर विभिन्न विकास मापदंडों(यानीनाइट्रोजन स्रोत) के प्रभाव का अनुमान लगाने के लिए उपयोगी है, जिसमें शुरू में दोनों उपभेदों को समान मात्रा में(चित्रा 3)में निहित था । इसके अलावा, एक छोटे पैमाने पर दृष्टिकोण में एक ही विकास की स्थिति के तहत खेती की गई विभिन्न बी सबटिलिस उपभेदों की फिटनेस का परीक्षण किया जा सकता है। मात्रात्मक विश्लेषण के लिए आगर प्लेट की पूरी सतह पर नमूनों का प्रचार करने की सिफारिश की जाती है। यह उपनिवेशों के ओवरले को रोकेगा और इस प्रकार एकल कोशिकाओं से उभरी उपनिवेशों की विशिष्ट पहचान और गिनती की अनुमति देता है। आगर प्लेटों पर उचित कमजोर पड़ने चढ़ाना द्वारा समय के साथ एक सेल आबादी की क्लोनल संरचना ठीक पीले और नीले फ्लोरोसेंट कालोनियों की गिनती से निर्धारित किया जा सकता है (चित्रा 4देखें) । जैसा कि हमने पहले बताया है, GDH गतिविधि बहिर्जात ग्लूटामेट2की उपलब्धता के आधार पर बी सबटिलिस की फिटनेस को दृढ़ता से प्रभावित करती है। जाहिर है, एक्सोजेनस ग्लूटामेट उच्च स्तरीय GDH गतिविधि के अभाव में बैक्टीरिया के लिए हानिकारक है क्योंकि एंजाइम आरओजी और गुडबी नीचा ग्लूटामेट जो एनाबोलिज्म में आवश्यक है (चित्र 1 और चित्रा 4Aदेखें)। इसके विपरीत, यदि बैक्टीरिया को प्रदान किया जाता है, तो ग्लूटामेट ट्रांसमेशन प्रतिक्रियाओं में एक अमीनो समूह दाता के रूप में काम कर सकता है। इसके अलावा, ग्लूटामेट को कार्बन मेटाबोलिज्म में खिलाया जा सकता है और कैटाबोलिक रूप से सक्रिय जीडीएचएस आरओजी और गुड्ब(चित्र 1 और चित्रा 4B)की उपस्थिति के कारण ऊर्जा के स्रोत के रूप में उपयोग किया जा सकता है। जैसा कि आंकड़े 4C और 4Dमें दिखाया गया है, इसी तरह के परिणाम डाई-स्विच प्रयोग में प्राप्त किए गए थे। फिर, उच्च स्तरीय GDH गतिविधि से लैस बैक्टीरिया विकास मीडिया में कम GDH गतिविधि के साथ कोशिकाओं द्वारा ग्लूटामेट की कमी से आगे निकल गए थे । इसके विपरीत, केवल एक सक्रिय GDH संश्लेषण बैक्टीरिया संस्कृति से समाप्त हो गए थे जब माध्यम ग्लूटामेट के साथ पूरक किया गया था । जैसा कि आंकड़े 5A और 5Bमें दिखाया गया है, मिश्रित सेल आबादी की प्रारंभिक संरचना समय के साथ लगभग स्थिर रही। इस प्रकार, प्रतिस्पर्धा प्रयोग में जीडीएच गतिविधि की विभिन्न मात्रा से सुसज्जित दो उपभेदों में से किसी एक का उन्मूलन फ्लोरोफोरेस (चित्र 4देखें) के कारण वृद्धि दोष के कारण नहीं था। एक साथ लिया, फ्लोरोफोरस का उपयोग एक जीवाणु कोशिका आबादी में इंट्राप्रजाति प्रतिस्पर्धा की निगरानी के लिए एक शक्तिशाली उपकरण है।
चित्रा 1. बी सबटिलिसमें कार्बन और नाइट्रोजन मेटाबोलिज्म के बीच की कड़ी । जब ग्लूटामेट माध्यम द्वारा प्रदान नहीं किया जाता है, तो एनाबोलिज्म के लिए आवश्यक प्रमुख अमीनो दाता को ग्लूटामीन संश्लेषण (जीएस) और ग्लूटामेट सिंथेसेस (गोगाट) की संयुक्त कार्रवाई द्वारा अमोनियम और 2-ऑक्सोग्लूटे से संश्लेषित किया जाता है। इसके विपरीत, बहिर्जात ग्लूटामेट की उपस्थिति में कैटाबोलिक रूप से सक्रिय जीडीएचएस आरओजी और/या गुड्ब ग्लूटामेट को अमोनियम और 2-ऑक्सोग्लूटेट में नीचा दिखा सकते हैं, जो तब कार्बन स्रोत के रूप में कार्य करता है ।
चित्रा 2। प्रायोगिक कार्यप्रवाह। तनाव 1 (yfpके साथ लेबल) और तनाव 2 (cfpके साथ लेबल) एक दूसरे से एक लोकस में अलग है । यहां प्रस्तुत उदाहरण में, हमने सेल आबादी के जीनोटिक बदलाव पर एक्सोजेनस ग्लूटामेट (प्रभावक) के प्रभाव की तुलना की है जिसमें शुरू में 50% आरओजी+ गुडबी+ (दो सक्रिय जीडीएचएस एन्कोडिंग) और 50% आरओजी+ गुडबीसीआर (एन्कोडिंग वन एक्टिव जीडीएच) कोशिकाएं शामिल थीं। बड़ी छवि देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्र 3। एक वर्णनात्मक तरीके से इंट्राप्रपीज़ प्रतियोगिता की कल्पना करने के लिए अर्धकांवात्मक दृष्टिकोण (धारा 5 देखें)। cocultivation (0 घंटा) से पहले, और 7 घंटे और 24 घंटे के विकास के बाद कमजोर पड़ने (10-4)कोशिकाओं को एसपी एगर प्लेटों पर देखा गया था। 37 डिग्री सेल्सियस पर 12 घंटे इनक्यूबेशन के बाद कॉलोनियों का गठन करने वाली जीवित कोशिकाओं की पहचान स्टीरियो फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी द्वारा की गई थी। एक्सपोजर समय, 0.6 सेकंड; स्केल बार, 1 मिमी। इस आंकड़े को गुंका एट अलसे संशोधित किया गया था । 20132.
चित्र 4. इंट्रास्पेस प्रतियोगिता का परिमाणीकरण। नमूना कमजोर पड़ने और कोशिकाओं का प्रचार करने के बाद (एसपी माध्यम पर चरण 3.1-3.3 देखें) प्लेटों को 37 डिग्री सेल्सियस पर रात भर इनक्यूबेटेड किया गया था। प्रोटोकॉल 4 और 6 में वर्णित पीले और नीले रंग की कॉलोनियों की मात्रा निर्धारित की गई थी। काले त्रुटि सलाखों के कम से कम चार स्वतंत्र रूप से दोहराया प्रयोगों के लिए मानक विचलन का प्रतिनिधित्व करते हैं। प्रत्येक आगर प्लेट में कम से कम 100 गिनती कालोनियों निहित थे। (क)बहिर्जात ग्लूटामेट के अभाव में बी सबटिलिस स्ट्रेन BP40 (पीला) केवल एक कार्यात्मक GDH आउटकॉम्पेट स्ट्रेन BP54 (ब्लू) से लैस है, जो ग्लूटामेट-अपमानजनक एंजाइम, आरओजी और गुड्ब दोनों को संश्लेषित करता है । (ख)इसके विपरीत, दो कार्यात्मक जीडीएचएस का संश्लेषण बैक्टीरिया के लिए लाभप्रद है जब बहिर्जात ग्लूटामेट उपलब्ध होता है क्योंकि ग्लूकोज के अलावा, ग्लूटामेट का उपयोग कार्बन स्रोत के रूप में किया जाता है। जैसा कि(सी)और(डी)में दिखाया गया है, एक डाई स्विच प्रयोग में तुलनीय परिणाम प्राप्त किए गए थे। इस आंकड़े को गुंका एट अलसे संशोधित किया गया था । 20132. बड़ी छवि देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 5। बैक्टीरिया की फिटनेस पर फ्लोरोफोर-एन्कोडिंग सीएफपी और वाईएफपी जीन के प्रभाव का मूल्यांकन करने के लिए नियंत्रण प्रयोग। आइसोजेनिक उपभेदों की मिश्रित आबादी BP40(rocG+ gudBCR amyE::yfp)और BP41(rocG+ gudBCR amyE::cfp)या BP52(rocG+ gudB+ amyE::cfp)और BP156(rocG+ gudB+ amyE: yfp)अनुपस्थिति में हो गए थे(ए)और उपस्थिति में(बी) जीवित कोशिकाओं को क्रमशः प्रोटोकॉल 1-4 और 6 में वर्णित के रूप में गिना गया था । सलाखों के कम से कम चार स्वतंत्र रूप से दोहराया प्रयोगों के लिए मानक विचलन का प्रतिनिधित्व करते हैं। इस आंकड़े को गुंका एट अलसे संशोधित किया गया था । 20132. बड़ी छवि देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
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Discussion
बैक्टीरिया की प्रतिस्पर्धी फिटनेस का विश्लेषण करने के लिए कई तरीके विकसित किए गए हैं16. कई मामलों में बैक्टीरिया को विभिन्न एंटीबायोटिक प्रतिरोध कैसेट17के साथ लेबल किया गया था । हमारे दृष्टिकोण के समान, एंटीबायोटिक प्रतिरोध कैसेट के साथ कोशिकाओं की लेबलिंग परिभाषित विकास की स्थिति के तहत cocultivation के दौरान बैक्टीरिया की प्रतिस्पर्धी फिटनेस के मूल्यांकन की अनुमति देता है । इसके अलावा, इस विधि का उपयोग कोशिकाओं की प्रतिस्पर्धी फिटनेस निर्धारित करने के लिए किया जा सकता है जो गुणसूत्र17पर एक विशिष्ट लोकस में एक दूसरे से भिन्न होते हैं। हालांकि, प्रतिस्पर्धी फिटनेस की निगरानी के लिए एंटीबायोटिक प्रतिरोध कैसेट का उपयोग करके कुछ नुकसान हैं। प्रतिरोध जीन की अभिव्यक्ति के रूप में ज्यादातर असमान शक्ति वाले प्रमोटरों द्वारा संचालित है एंटीबायोटिक दवाओं के लिए प्रतिरोध प्रदान एंजाइमों शायद विभिंन स्तरों पर उत्पादित कर रहे हैं । इसलिए, कमजोर फिटनेस प्रभाव इस दृष्टिकोण के साथ पता लगाने योग्य नहीं हो सकता है। हमारे दृष्टिकोण में, दोनों फ्लोरोफोर जीन एक ही चयन मार्कर के साथ एकीकृत किया गया था और उनकी अभिव्यक्ति एक ही प्रमोटरों द्वारा संचालित है2। एंटीबायोटिक प्रतिरोध कैसेट के साथ प्रतिस्पर्धी फिटनेस की निगरानी करने के लिए एक और नुकसान यह हो सकता है कि दृष्टिकोण अधिक श्रमसाध्य है क्योंकि कॉलोनी की गिनती के लिए उपयुक्त एंटीबायोटिक दवाओं के साथ पूरक दो प्रकार की आगर प्लेटें हैं। वैकल्पिक रूप से, बैक्टीरिया की फिटनेस बस विकास दर की निगरानी और एक तथाकथित फिटनेस सूचकांक16की गणना से निर्धारित किया जा सकता है । जाहिर है, यह सबसे सटीक दृष्टिकोण है क्योंकि बैक्टीरिया व्यक्तिगत रूप से खेती कर रहे है और विषाक्त यौगिकों कि एक निश्चित जीनोटाइप के साथ एक तनाव द्वारा उत्पादित किया जा सकता है प्रतिस्पर्धी तनाव के विकास को प्रभावित नहीं करेगा । इसके अलावा, एंटीबायोटिक दवाओं का उपयोग करने की कोई आवश्यकता नहीं है जो कोशिकाओं के विकास को प्रभावित कर सकती है। हालांकि, दोनों दृष्टिकोण बहुत उदाहरण नहीं है के रूप में प्रतिस्पर्धी फिटनेस का वर्णन संख्या केवल एक जगह तटस्थ तरीके से प्रस्तुत किया जा सकता है ।
इंट्रास्पेसिस प्रतियोगिता की निगरानी और मात्रा निर्धारित करने के लिए फ्लोरोफोर एन्कोडिंग जीन के उपयोग के अन्य तरीकों पर कई फायदे हैं। यदि दोनों उपभेदों ने क्रोमोसोम में दोहरे समरूप पुनर्संयोजन द्वारा फ्लोरोफोर एन्कोडिंग जीन को एकीकृत किया है, तो खेती के किसी भी चरण में एंटीबायोटिक दवाओं का उपयोग करने की कोई आवश्यकता नहीं है। इसलिए, खेती के दौरान संस्कृति से लिए जाने वाले नमूनों का विश्लेषण एक ही विकास माध्यम पर किया जा सकता है और दोनों उपभेद बढ़ने में सक्षम हैं। यह दृष्टिकोण बहुत ही उदाहरण के तरीके से इंट्रास्पेसेपी प्रतियोगिता के दृश्य की अनुमति देता है। इसके अलावा, इस अर्धकांवात्मक दृष्टिकोण का उपयोग करके कई विकास स्थितियों का परीक्षण एक ही समय में किया जा सकता है और कई अलग-अलग उपभेदों की तुलना समानांतर रूप से की जा सकती है। अंत में, माइक्रोस्कोप स्लाइड पर नमूनों के निर्धारण की कोई आवश्यकता नहीं है क्योंकि कोकृषण के दौरान बैक्टीरियल कल्चर से लिए गए नमूनों को फ्रीजर18में संग्रहित किया जा सकता है। इस प्रकार, सभी नमूनों और प्रतिकृति एक ही समय में विश्लेषण किया जा सकता है।
हमारे प्रोटोकॉल में दो महत्वपूर्ण कदमों का उल्लेख किया जाना चाहिए । यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि क्रायोस्टॉक्स में प्रत्येक प्रतियोगी तनाव के समान विकास चरण में कोशिकाओं की समान मात्रा होनी चाहिए। क्रायोस्टॉक्स में उपभेदों की एक प्रारंभिक असंगति और इसके परिणामस्वरूप प्रयोग शुरू करने से पहले शेक फ्लास्क में प्रतिस्पर्धा प्रयोग के परिणाम पर मजबूत प्रभाव पड़ेगा। इसलिए, प्रयोग से पहले क्रायोस्टॉक्स की संरचना की जांच करना बुद्धिमानी है। इसके अलावा, कोशिकाओं की एक उचित राशि समान रूप से थाली पर प्रचार किया जाना चाहिए । अन्यथा उभरा उपनिवेश भी एक दूसरे के करीब हैं और जीवित कोशिकाओं का सटीक निर्धारण मुश्किल हो जाएगा।
फ्लोरोफोर-आधारित दृष्टिकोण की कुछ सीमाएं और कमियां भी हैं। एक बहु-अच्छी प्लेट रीडर में Cocultivation और सीएफपी और वाईएफपी संकेतों का एक साथ पता लगाना संभव नहीं है क्योंकि फ्लोरोफोरस की उत्तेजन और उत्सर्जन स्पेक्ट्रा एक दूसरे के बहुत करीब हैं। हालांकि, इस तकनीकी समस्या को विभिन्न फ्लोरोसेंट प्रोटीन का उपयोग करके दरकिनार किया जा सकता है, जैसे कि हरे और लाल प्रकाश का उत्सर्जन करने वाले, एक ही प्रोटीन पाड़ पर बेहतर आधारित हैं। फ्लोरोफोर आधारित दृष्टिकोण की एक और खामी यह हो सकती है कि कुछ उत्परिवर्तन बैक्टीरिया के केवल कमजोर विकास दोष का कारण बनते हैं। इस प्रकार, यदि फ्लोरोफोर-एन्कोडिंग जीन में से किसी के कारण होने वाला विकास दोष एक निश्चित उत्परिवर्तन के कारण होने वाले विकास दोष की तुलना में मजबूत होता है, तो फ्लोरोफोर-आधारित दृष्टिकोण इंट्राप्रेजि प्रतियोगिता का विश्लेषण करने के लिए उपयुक्त नहीं है। इसलिए, उपभेदों का एक पूरा सेट बनाने से पहले यह पहले केवल माता-पिता के तनाव को सीएफपी और वाईएफपी दोनों के साथ लेबल करने और उपभेदों को cocultivate करने की सिफारिश की जाती है। विकास प्रयोगों से पता चलेगा कि फ्लोरोफोरस बैक्टीरिया की फिटनेस को कितना मजबूत करते हैं (आंकड़े 5A और 5Bदेखें)।
भविष्य में यह परीक्षण करना दिलचस्प होगा कि क्या इंट्राप्रेपी प्रतियोगिता की निगरानी करने के लिए फ्लोरोफोर-आधारित दृष्टिकोण अधिक सटीक और कम श्रमसाध्य होगा यदि जीवित कोशिकाओं को प्रवाह साइटोमेट्री का उपयोग करके गिना जाता है। हाल ही में, प्रवाह साइटोमेट्री को बी सबटिलिस बायोफिल्म्स19की संरचना का विश्लेषण करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण के रूप में दिखाया गया है। इसके अलावा, कमजोर फिटनेस प्रभावों का विश्लेषण करना अधिक उपयुक्त हो सकता है जो किण्वक में फ्लोरोफोर-लेबल वाले बैक्टीरिया के निरंतर cocultivation द्वारा बैक्टीरिया की प्रतिस्पर्धी फिटनेस को प्रभावित करते हैं। फ्लास्क को हिलाने के विपरीत, यह दृष्टिकोण विकास की स्थिति को स्थिर रखने की अनुमति देता है और इस प्रकार लंबे समय तक इंट्रास्पेसी प्रतिस्पर्धा की निगरानी करता है।
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Disclosures
लेखकों की घोषणा है कि वे कोई प्रतिस्पर्धी वित्तीय हितों की है ।
Acknowledgments
लेखकों की प्रयोगशाला में काम ड्यूश Forschungsgemeinschaft (http://www.dfg.de; सीओ 1139/1-1), प्रिय डेर चेमिसचेन इंडस्ट्रीज (http://www.vci.de/fonds), और गोटिंगेन सेंटर फॉर मॉलिक्यूलर बायोलॉजी (GZMB) । लेखक सहायक टिप्पणियों और पांडुलिपि के महत्वपूर्ण पढ़ने के लिए जोर्ग स्टलके को स्वीकार करना चाहते हैं।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| (NH4)2SO4 | Roth, Germany | 3746 | |
| Agar | Difco, USA | 214010 | |
| Ammonium ferric citrate (CAF) | Sigma-Aldrich, Germany | 9714 | |
| CaCl2 | Roth, Germany | 5239 | |
| Glucose | Applichem, Germany | A3617 | |
| Glycerol | Roth, Germany | 4043 | |
| K2HPO4•3H2O | Roth, Germany | 6878 | |
| KCl | Applichem, Germany | A3582 | |
| KH2PO4 | Roth, Germany | 3904 | |
| KOH | Roth, Germany | 6751 | |
| MgSO4•7H2O | Roth, Germany | P027 | |
| MnCl2 | Roth, Germany | T881 | |
| MnSO4•4H2O | Merck Millipore, Germany | 102786 | |
| NaCl | Roth, Germany | 9265 | |
| Nutrient broth | Roth, Germany | X929 | |
| Potassium glutamate | Applichem, Germany | A3712 | |
| Tryptone | Roth, Germany | 8952 | |
| Tryptophan | Applichem, Germany | A3445 | |
| Yeast extract | Roth, Germany | 2363 | |
| 1.5 ml Reaction tubes | Sarstedt, Germany | 72,690,001 | |
| 2.0 ml Reaction tubes | Sarstedt, Germany | 72,691 | |
| 15 ml Plastic tubes with screw cap | Sarstedt, Germany | 62,554,001 | |
| Petri dishes | Sarstedt, Germany | 82.1473 | |
| 1.5 ml Polystyrene cuvettes | Sarstedt, Germany | 67,742 | |
| 15 ml Glass culture tubes | Brand, Germany | 7790 22 | |
| 100 ml Shake flasks with aluminium caps | Brand, Germany | 928 24 | |
| Sterile 10 ml glass pipettes | Brand, Germany | 278 23 | |
| Incubator (28 and 37 °C) | New Brunswick | M1282-0012 | |
| Standard pipette set (2-20 μl, 10-100 μl, 100-1,000 μl) | Eppendorf, Germany | 4910 000.034, 4910 000.042, | |
| Table top centrifuge for 1.5 and 2 ml reaction tubes | Thermo Scientific, Heraeus Fresco 21, Germany | 75002425 | |
| Table top centrifuge for 15 ml plastic tubes | Heraeus Biofuge Primo R, Germany | 75005440 | |
| Standard spectrophotometer | Amersham Biosciences Ultrospec 2100 pro, Germany | 80-2112-21 | |
| Stereofluorescence microscope | Zeiss SteREO Lumar V12, Germany | 495008-0009-000 | |
| Freezer (-20 and -80 °C) | - | - | |
| Fridge (4 °C) | - | - | |
| Autoclave | Zirbus, LTA 2x3x4, Germany | - | |
| pH meter | pH-meter 766, Calimatic, Knick, Germany | 766 | |
| Vortex | Vortex 3, IKA, Germany | 3340000 | |
| Balance | CP2202S, Sartorius, Germany | replaced by | |
| Black pen (permanent marker) | Staedler, Germany | 317-9 | |
| Powerpoint program | Microsoft, USA | - | |
| Office Excel program | Microsoft, USA | - | Program for data processing |
| Adobe Photoshop CS5 | Adobe, USA | replaced by CS6, download | Computer program for image processing |
| Computer | PC or Mac | - | |
| ZEN pro 2011 software for the stereofluorescence microscope | Zeiss, Germany | 410135 1002 110 | AxioCam MRc Rev. Obtained through Zeiss |
| Specific solution recipes | |||
| SP Medium | |||
| 8 g Nutrient broth | |||
| 0.25 mg MgSO4•7H2O | |||
| 1 g KCl | |||
| 15 g agar for solid SP medium | if required | ||
| add 1 L with H2O | autoclave for 20 min at 121 °C | ||
| 1 ml CaCl2 (0.5 M), sterilized by filtration | |||
| 1 ml MnCl2 (10 mM), sterilized by filtration | |||
| 2 ml ammonium ferric citrate (CAF, 2.2 mg/ml), sterilized by filtration | |||
| LB Medium | |||
| 10 g Tryptone | |||
| 5 g Yeast extract | |||
| 10 g NaCl | |||
| 15 g agar for solid LB medium | if required | ||
| add 1 L with H2O | autoclave for 20 min at 121 °C | ||
| C-Glc Minimal Medium | |||
| 200 ml 5 x C salts | |||
| 10 ml L-Tryptophan (5 mg/ml), sterilized by filtration | |||
| 10 ml ammonium ferric citrate (CAF, 2.2 mg/ml), sterilized by filtration | |||
| 10 ml III’ salts | |||
| 25 ml Glucose (20%) | autoclaved for 20 min at 121 °C | ||
| add 1 L with sterile H2O | |||
| CE-Glc Minimal Medium | |||
| 200 ml 5 x C salts | |||
| 10 ml L-Tryptophan (5 mg/ml), sterilized by filtration | |||
| 10 ml ammonium ferric citrate (CAF, 2.2 mg/ml), sterilized by filtration | |||
| 10 ml III’ salts | |||
| 20 ml Glutamate (40%) | |||
| 25 ml Glucose (20%), autoclaved for 20 min at 121 °C | |||
| add 1 L with sterile H2O | |||
| 5 x C salts | |||
| 20 g KH2PO4 | |||
| 80 g K2HPO4•3H2O | |||
| 16.5 g (NH4)2SO4 | |||
| add 1 L with sterile H2O | autoclave for 20 min at 121 °C | ||
| III’ salts | |||
| 0.232 g MnSO4•4H2O | |||
| 12.3 g MgSO4•7H2O | |||
| add 1 L with sterile H2O, autoclave for 20 min at 121 °C | |||
| 40% Glutamate solution | |||
| 200 g L-Glutamic acid | |||
| adjust the pH to 7.0 by adding approximately 80 g KOH | |||
| add 0.5 L with sterile H2O | autoclave for 20 min at 121 °C | ||
| 0.9% Saline (NaCl) Solution | |||
| add 1 L with sterile H2O | autoclave for 20 min at 121 °C | ||
| 50% Glycerol solution | |||
| 295 ml Glycerol (87%) | |||
| add 0.5 L with sterile H2O | autoclave for 20 min at 121 °C | ||
| Bacteria (All strains are based on the Bacillus subtilis strain 168) | |||
| Bacillus subtilis BP40 (rocG+ gudBCR amyE::PgudB-yfp) | Laboratory strain collection | ||
| Bacillus subtilis BP41 (rocG+ gudBCR amyE::PgudB-cfp) | |||
| Bacillus subtilis BP52 (rocG+ gudB+ amyE::PgudB-cfp) | |||
| Bacillus subtilis BP156 (rocG+ gudB+ amyE::PgudB-yfp) | |||
References
- Buescher, F. I., et al. Global network reorganization during dynamic adaptations of Bacillus subtilis metabolism. Science. 335, 1099-1103 (2012).
- Gunka, K., Stannek, L., Care, R. A., Commichau, F. M. Selection-driven accumulation of suppressor mutants in Bacillus subtilis: the apparent high mutation frequency of the cryptic gudB gene and the rapid clonal expansion of gudB+ suppressors are due to growth under selection. PLoS One. 8, (2013).
- Al Mamum, A. A. M., et al. Identity and function of a large gene network underlying mutagenic repair of DNA breaks. Science. 338, 1344-1348 (2012).
- Koeppel, A. F., Wertheim, J. O., Barone, L., Gentile, N., Krizanc, D., Cohan, F. M. Speedy speciation in a bacterial microcosm: new species can arise as frequently as adaptations within a species. ISME J. 7, 1080-1091 (2013).
- Maughan, H., Nicholson, W. L. Increased fitness and alteration of metabolic pathways during Bacillus subtilis evolution in the laboratory. Appl. Environ. Microbiol. 77, 4105-4118 (2011).
- Burkholder, P. R., Giles, N. H. Induced biochemical mutations in Bacillus subtilis. Am. J. Bot. 34, 345-348 (1947).
- McLoon, A. L., Guttenplan, S. B., Kearns, D. B., Kolter, R., Losick, R. Tracing the domestication of a biofilm-forming bacterium. J. Bacteriol. 193, 2027-2034 (2011).
- Zeigler, D. R., et al. The origins of 168, W23, and other Bacillus subtilis legacy strains. J. Bacteriol. 190, 6983-6995 (2008).
- Gunka, K., Tholen, S., Gerwig, J., Herzberg, C., Stülke, J., Commichau, F. M. A high-frequency mutation in Bacillus subtilis: requirements for the decryptification of the gudB glutamate dehydrogenase. 194, 1036-1044 (2012).
- Commichau, F. M., et al. Characterization of Bacillus subtilis mutants with carbon source-independent glutamate biosynthesis. J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 12, 106-113 (2007).
- Beckwith, J. Genetic suppressors and recovery of repressed biochemical memory. J. Biol. Chem. 284, 12585-12592 (2009).
- Gunka, K., Commichau, F. M. Control of glutamate homeostasis in Bacillus subtilis: a complex interplay between ammonium assimilation, glutamate biosynthesis and degradation. Mol. Microbiol. 85, 213-224 (2012).
- Yan, D. Protection of the glutamate pool concentrations in enteric bacteria. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 9475-9480 (2007).
- Belitsky, B. R., Sonenshein, A. L. Role and regulation of Bacillus subtilis glutamate dehydrogenase genes. J. Bacteriol. 180, 6298-6305 (1998).
- Commichau, F. M., Herzberg, C., Tripal, P., Valerius, O., Stülke, J. A regulatory protein-protein interaction governs glutamate biosynthesis in Bacillus subtilis: the glutamate dehydrogenase RocG moonlights in controlling the transcription factor GltC. Mol. Microbiol. 65, 642-654 (2007).
- Gordo, I., Perfeito, L., Sousa, A. Fitness effects of mutations in bacteria. J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 21, 20-35 (2011).
- Rabatinová, A., et al. The δ subunit of RNA polymerase is required for rapid changes in gene expression and competitive fitness of the cell. J. Bacteriol. 195, 2603-2611 (2013).
- Capra, E. J., Perchuk, B. S., Skerker, J. M., Laub, M. T. Adaptive mutations that prevent crosstalk enable the expansion of paralogous signalling protein families. Cell. 150, 222-232 (2012).
- García-Betancur, J. C., Yepes, A., Schneider, J., Lopez, D. Single-cell analysis of Bacillus subtilis biofilms using fluorescence microscopy and flow cytometry. J. Vis. Exp. (15), (2012).
