Summary
Bakterier kan ackumulera antingen skadliga eller fördelaktiga mutationer under sin livstid. I en population av celler individer som har ackumulerat fördelaktiga mutationer kan snabbt konkurrera ut sina kamrater. Här presenterar vi ett enkelt förfarande för att visualisera intraspecies konkurrens i en bakteriell cellpopulation över tid med fluorescerande märkta individer.
Abstract
Många mikroorganismer som bakterier förökar sig extremt snabbt och populationerna kan nå höga celltätheter. Små fraktioner av celler i en population har alltid ackumulerade mutationer som antingen är skadliga eller fördelaktiga för cellen. Om fitness effekten av en mutation ger subpopulationen en stark selektiv tillväxt fördel, individerna av denna subpopulation kan snabbt konkurrera ut och även helt eliminera sina omedelbara kamrater. Således kan små genetiska förändringar och urvalsdriven ackumulering av celler som har förvärvat fördelaktiga mutationer leda till en fullständig förskjutning av genotypen av en cellpopulation. Här presenterar vi ett förfarande för att övervaka den snabba klonurvalet expansion och eliminering av fördelaktiga respektive skadliga mutationer, i en bakteriell cellpopulation över tiden genom kokultivering av fluorescerande märkta individer av Gram-positiv modellbakterien Bacillus subtilis. Metoden är lätt att utföra och mycket belysande att visa intraspecies konkurrens bland individerna i en bakteriecellpopulation.
Introduction
Jordbakterier är vanligtvis utrustade med flexibla regleringsnätverk och bred metabolisk kapacitet. Båda funktionerna gör det möjligt för cellerna att justera sina katabola och anabola vägar för att konkurrera med sina kamrater och andra mikroorganismer för näringsämnena, som finns i en given ekologisk nisch1. Men om bakterierna inte kan anpassa sig till sin miljö kan andra mekanismer stå för en art överlevnad. Faktum är att eftersom många bakterier förökar sig snabbt och populationerna kan nå höga celltätheter subpopulationer kan spontant ha ackumulerade fördelaktiga mutationer som ger cellerna en selektiv tillväxtfördel och därför öka deras kondition. Dessutom kan mutationella hotspots och stressinducerad adaptiv mutagenes underlätta utvecklingen av en maladapterad bakterie2,3. Således är ackumulering av mutationer och tillväxt under kontinuerligt urval ursprunget för den enorma mikrobiella mångfalden, även inom samma släkte4,5. Liksom i naturen förekommer formning av bakteriella genom också i laboratoriet på grund av kontinuerlig odling under urval. Detta exemplifieras av domesticeringen av grampositiva bakterien B. subtilis, som används över hela världen inom grundforskning och industri. På 1940-talet behandlades B. subtilis med DNA-skadliga röntgenstrålar följt av odling under ett specifikt tillväxttillstånd6. Mutationerna som har ackumulerats i bakterierna under domesticeringen står för förlusten av många tillväxtegenskaper, dvs. B. subtilis laboratoriestam 168 förlorade förmågan att bilda komplexa kolonier7,8.
Nuförtiden, för de bäst studerade modellbakterierna Escherichia coli och B. subtilis, finns en mängd kraftfulla verktyg tillgängliga för att genetiskt manipulera deras genom för att ta itu med specifika vetenskapliga frågor. Ibland orsakar inaktiveringen av en gen av intresse en allvarlig tillväxtdefekt, som sedan tydligt syns på standardtillväxtmedium9. Däremot ignoreras ofta mutationer som orsakar en svag tillväxtdefekt och därmed bara något påverkar stammens kondition. I båda fallen leder dock långvarig inkubation och passaging av mutanta stammar i flera generationer vanligtvis till ackumulering av suppressor mutanter som har återställt fenotyp avmoderstammen 2,9. Karakteriseringen av suppressormutanter och identifieringen av mutationerna som har återställt tillväxtdefekten hos den överordnade mutantstammen är ett mycket användbart tillvägagångssätt som möjliggör klargörande av viktiga och ofta nya celluläraprocesser 10,11.
Vi är intresserade av kontrollen av glutamat homeostas i B. subtilis12. I likhet med E. colisvarar B. subtilis på stör av glutamathomeostas (dvs.block i glutamatnedbrytning2) genom ackumulering av suppressormutanter. Genomiska förändringar i dessa suppressor mutanter som förvärvades av spontan mutation visade sig snabbt återställa glutamat homeostas9,13. Därför är det inte förvånande att anpassning av B. subtilis till ett specifikt tillväxttillstånd under domesticering av bakterien speglas i enzymsyntesen och i de utvecklade enzymatiska aktiviteterna, som är involverade i glutamatmetabolism12. det har föreslagits att bristen på exogen glutamat i tillväxtmediet under domesticeringsprocessen var drivkraften för uppkomsten och fixeringen av den kryptiska glutamat dehydrogenas (GDH) gudBCR genen i laboratoriestammen 1682,14. Denna hypotes stöds av vår observation att den minskade mängden GDH-aktivitet i laboratoriestammen ger bakterierna en selektiv tillväxtfördel när exogen glutamat är knapp2. Dessutom resulterar odling av en B. subtilis stam, som syntetiserar GDH GudB, i avsaknad av exogen glutamat i ackumulering av suppressor mutanter som har inaktiverat gudB genen 2. Uppenbarligen är närvaron av en katabolt aktiv GDH ofördelaktig för cellen eftersom endogent producerade glutamat som annars skulle kunna användas för anabolism bryts ned till ammonium och 2-oxoglutarat (Figur 1). När glutamat tillhandahålls av mediet har däremot en B. subtilisstam utrustad med GDH-aktivitet på hög nivå en selektiv tillväxtfördel jämfört med en stam som bara syntetiserar en funktionell GDH. Det är rimligt att anta att GDH-aktivitet på hög nivå gör det möjligt för bakterierna att använda glutamat som en andra kolkälla utöver andra kolkällor som tillhandahålls avmediet 2 (se figur 1). Således påverkar GDH-aktivitet starkt bakteriernas kondition, beroende på tillgången på exogen glutamat.
Här presenterar vi en mycket belysande metod för att övervaka och visualisera intraspecies konkurrens mellan två B. subtilis stammar som skiljer sig åt i en enda locus på kromosomen (Figur 2). De två stammarna var märkta med yfp- och cfp-generna som kodade fluorforerna YFP och CFP och kokultiverade under olika näringsförhållanden. Genom provtagning över tid och genom plätering av lämpliga utspädningar på agarplattor kan de överlevande i var och en av kulturerna enkelt övervakas med hjälp av ett gemensamt stereofluorescensmikroskop. Förfarandet som beskrivs i detta dokument är lätt att utföra och lämpligt att visualisera den snabba klonurformiga expansionen och eliminering av fördelaktiga och skadliga mutationer, respektive i en cellpopulation över tid.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Förberedelse av Agarplattor, Kulturmedia, Kryostockar och Prekulturer
- Förbered tillväxtmedier och erforderliga reagenser (se tabell över material och reagenser).
- Strimlar B. subtilis-stammarna (t.ex. BP40 (rocG+ gudBCR amyE::PgudB-yfp) och BP52 (rocG+ gudB+ amyE::PgudB-cfp) uttrycker en respektive två aktiva GDH:er) 2 som kommer att användas i konkurrensexperimentet på SP medium agar-plattor för att få enstaka kolonier. Inkubera plattorna över natten vid 37 °C.
- Ta enstaka kolonier och inokulera sterila odlingsrör som innehåller 4 ml LB flytande medium. Odla bakterierna över natten vid 28 °C och 220 varv/min.
- Odla över natten kulturer vid 28 °C för att undvika att cellerna lyser eller sporulerar.
- Mät den optiska densiteten hos kulturerna vid en våglängd på 600 nm (OD600)med hjälp av en standardspektrofotometer.
- Om kulturerna har nått en OD600 på 2,0, blanda 0, 75 ml av kulturerna med 0,75 ml steril 50% glycerollösning i 1,5 ml reaktionsrör. Den slutliga OD600 ska vara 1,0 för att erhålla kryostockar som innehåller ca 108 celler/ml.
- Förvara rören vid -80 °C.
- Gör tre förkulturer av varje stam märkt med cfp och yfp kodning fluorofor gener. Inokulera prekulturerna (sterila odlingsrör som innehåller 4 ml LB flytande medium) med 1 μl celler från -80 °C kryostockar. Inkubera kulturerna över natten vid 28 °C och 220 varv/min.
2. Kokultivering av bakterier, provtagning och provlagring
- Förbered 100 ml C-Glc och CE-Glc minimalt medium (se tabellen över reagenser och material) och överför 20 ml av varje medium till sterila 100 ml skakflaskor.
- Ta 0,1 ml av de förkulturer som odlades över natten, späd dem med 0,9 ml LB-medium i en 1,5 ml cuvette och bestäm OD600.
- För tävlingsexperimentet, ta de prekulturer av de olika stammarna som har en liknande OD600 mellan 1,0-1,5.
- För att erhålla populationer av blandade celler, späd ut cellerna i de förkulturer som hade lämpligt OD600 till en OD600 på 0, 05 i 20 ml C-Glc och CE-Glc minimalt medium kompletterat i 100 ml skakkolvar. För tävlingsexperimentet bör de två stammarna blandas i ett 1:1-förhållande.
- Ta 10 ml prover från flaskorna, överför dem till 15 ml plaströr, skörda cellerna genom centrifugering i 10 minuter vid 4 000 x g i en vanlig bordscentrifugge och kassera supernaten.
- Återanvänd cellerna i 0,5 ml färskt LB-medium och överför cellerna till en steril 1,5 ml reaktionskopp. Tillsätt 0,5 ml steril glycerol 50% , blanda suspensionen genom rigorös virvel och förvara proverna i en -80 °C frys tills vidare behandling.
- Inkubera de celler som finns kvar i skakkolverna i upp till 24 timmar vid 37 °C och 220 varv/min. Håll skakkolvarna i mörker för att förhindra fotoblekning av fluorforerna.
- Ta ytterligare prover på 0, 1 ml efter 7 timmar och 24 timmars tillväxt. Mät och notera proverna OD600 av 1:10 utspädningar (i C-Glc eller CE-Glc minimal medium).
- Ta lämplig mängd celler från varje kultur för att göra kryostockar som har en OD600 av 1,0. Förvara proverna vid -80 °C tills vidare behandling.
3. Provbehandling, plätering och inkubation för kvantitativa analyser
- Efter att ha samlat alla prover, tina kryostockarna och späd cellerna i en 0,9% saltlösning (se tabell över reagenser och material) upp till 10-3.
- Plåt 0,1 ml av utspädningarna på10-3 sp medium agarplattor och fördela cellerna med sterila glaspipetter.
- Inkubera plattorna över natten vid 37 °C i mörker tills enstaka kolonier har dykt upp.
4. Räkna de överlevande med stereofluorescensmikroskopi för kvantitativ analys
- Dela botten av agarplattan med en svart penna i fyra delar för en bättre orientering medan du räknar de överlevande under stereofluorescensmikroskopet.
- Placera plattan upp och ner under mikroskopet och sätt kolonierna i fokus med hjälp av den kalla ljuskällan.
- När kolonierna är i fokus, byt till lämplig filteruppsättning för CFP för att visualisera de överlevande cellerna i den cfp-märktastammen. Räkna de överlevande av denna stam genom att märka kolonierna med en penna och notera numret.
- Ta bort etiketterna med etanol och byt till YFP-filteruppsättningen för att visualisera de överlevande cellerna i den yfp-märktastammen. Räkna de överlevande igen genom att märka kolonierna med en penna och notera numret.
5. Provbehandling och mikroskopi för semikvantitativa analyser
- För illustrativ figur, punkt 10 μl av utspädningen10-4 (cirka 100 celler) från steg 3.1 på en SP-agarplatta (se figur 3).
- Inkubera plattorna över natten vid 37 °C i mörker tills enstaka kolonier har dykt upp.
- Placera Petriskålen utan lock under mikroskopet och sätt platsen i fokus med den kalla ljuskällan.
- Ta bilder av fläckarna för illustrativ figur. Välj en lämplig exponeringstid för att ta bilderna av kolonierna med den kalla ljuskällan.
- Utan att flytta plattan, byt till cfp-filteruppsättningen, justera exponeringstiden och ta en bild. Gör samma sak med YFP-filteruppsättningen och spara bilderna för ytterligare analyser.
6. Dataanalys
- Använd programvara som Excel för kvantitativa dataanalyser. Baserat på de räknade kolonierna beräknar du procentandelen gula och blå kolonier med avseende på hela antalet kolonier, som är inställda på 100%.
- Använd de beräknade talen för att skapa ett staplat stapeldiagram (se figur 4 och figur 5). Använd ett bildbehandlingsprogram som Adobe Photoshop för att konstruera sammanfogade bilder av bilderna tagna från de olika platserna. Alternativt kan den fritt tillgängliga programvaran ImageJ, nedladdningsbar http://rsbweb.nih.gov/ij/ kan användas för bildbehandling.
- Öppna bilderna från en plats som togs med cfp-filteruppsättningen och YFP-filteruppsättningen. Optimera kontrasten och ljusstyrkan för att minska eventuella bakgrundsfluorescenser från mediet.
- Gå till en av bilderna och markera alla. Kopiera bilden och klistra in den på den andra bilden.
- Använd antingen funktionen "färg dodge" för att sammanfoga bilderna eller överlagra de fluorescerande bilderna med hjälp av kanalfliken. Sammanslagna bilder av kolonierna från olika medier och olika tidpunkter representerar tillväxten av de olika stammarna inom vätskekulturen.
7. Specifika tips: Färgbrytare Experiment och kokultivering av isogena stammar märkta med cfp och yfp
Uttrycket av någon av de två fluoroforkodande generna i B. subtilis kan påverka konditionen och därmed bakteriernas tillväxttakt. Därför rekommenderas att utföra följande experiment för att utesluta att elimineringen av en konkurrentstam från cellpopulationen under odlingen helt enkelt beror på en negativ effekt av fluorforen:
- Upprepa hela experimentet och kokultivera omvänt märkta stammar (t.ex. den tidigare cfp-märktastammen är nu märkt med yfp-genen och vice versa). Även om de erhållna resultaten är omvända bör de jämföras med den tidigare iakttagelsen att den ena stammen har en selektiv tillväxtfördel jämfört med den andra stammen.
- Upprepa hela experimentet och kokultivera isogena stammar märkta med yfp och cfp (t.ex. BP40 (rocG+ gudBCR amyE::PgudB-yfp) och BP41 (rocG+ gudBCR amyE::PgudB-cfp)). Uppskatta den negativa effekten av någon av de två fluorforerna på bakteriernas kondition genom att följa cellpopulationens sammansättning över tiden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Metoden som beskrivs här tillämpades framgångsrikt för att visualisera intraspecies konkurrens i en cellpopulation bestående av B. subtilis stammar som var märkta med cfp och yfp gener kodning fluorophores CFP respektive YFP. Som visas i figur 3kan metoden användas för att visualisera intraspecieskonkurrens på ett mycket belysande sätt. Genom att upptäcka proverna på små områden gjordes cellpopulationens klonursammansättning synlig i korthet. Även om detta tillvägagångssätt inte är lämpligt för kvantitativa analyser är det användbart för att grovt uppskatta effektenav olika tillväxtparametrar (dvs.kvävekälla) på utvecklingen av en cellpopulation som ursprungligen innehöll båda stammarna i lika stora mängder (figur 3). Dessutom, i ett småskaligt tillvägagångssätt kan lämpligheten hos olika B. subtilisstammar som odlades under samma tillväxttillstånd testas med en enda agarplatta. För kvantitativa analyser rekommenderas att proverna förökas över hela ytan på en agarplatta. Detta kommer att förhindra överlägg av kolonierna och därmed möjliggör distinkt identifiering och antal kolonier som uppstod från enstaka celler. Genom att plätera lämpliga utspädningar på agarplattor kan en cellpopulations klonurs sammansättning över tiden bestämmas exakt genom att räkna de gula och blå fluorescerande kolonierna (se figur 4). Som vi tidigare har rapporterat, GDH aktivitet påverkar starkt konditionen hos B. subtilis beroende på tillgången på exogen glutamat2. Uppenbarligen, i avsaknad av exogen glutamat hög nivå GDH verksamhet är ofördelaktig för bakterierna som enzymerna RocG och GudB försämra glutamat som behövs i anabolat (se figur 1 och figur 4A). Däremot, om det ges till bakterierna, glutamat kan fungera som en aminogruppdonator i transaminationsreaktioner. Dessutom kan glutamat matas in i kolmetabolismen och användas som energikälla på grund av närvaron av de katabolt aktiva GDH RocG och GudB (figur 1 och figur 4B). Som visas i figurerna 4C och 4Derhölls liknande resultat i ett färgbytesexperiment. Återigen, bakterier utrustade med hög nivå GDH verksamhet konkurrerades ut av celler med minskad GDH verksamhet i tillväxt medier saknar glutamat. Däremot eliminerades bakterier som syntetiserar endast en aktiv GDH från kulturen när mediet kompletterades med glutamat. Som visas i figurerna 5A och 5Bförblev den ursprungliga sammansättningen av den blandade cellpopulationen nästan konstant över tiden. I konkurrensexperimentet berodde således elimineringen av någon av de två stammar som var utrustade med olika mängder GDH-verksamhet inte på en tillväxtdefekt orsakad av fluorforerna (se figur 4). Sammantaget är användningen av fluorforer ett kraftfullt verktyg för att övervaka intraspecieskonkurrens i en bakteriecellpopulation.
Figur 1. Sambandet mellan kol- och kvävemetabolism i B. subtilis. När glutamat inte tillhandahålls av mediet syntetiseras den stora aminodonatorn som behövs för anabolat från ammonium och 2-oxoglutarat genom den kombinerade verkan av glutaminsyntetas (GS) och glutamatsyntas (GOGAT). I närvaro av exogen glutamat kan däremot kataboltaktiva GDH RocG och/eller GudB bryta ned glutamat till ammonium och 2-oxoglutarat, som sedan fungerar som kolkälla.
Figur 2. Experimentellt arbetsflöde. Stam 1 (märkt med yfp) och stam 2 (märkt med cfp)skiljer sig i en locus från varandra. I exemplet som presenteras här har vi jämfört effekten av exogen glutamat (effector) på den genotypiska förskjutningen av cellpopulationen som ursprungligen innehöll 50% av rocG+ gudB+ (kodning av två aktiva GDH) och 50% av rocG+ gudBCR (kodning av en aktiv GDH) celler. Klicka här om du vill visa större bild.
Figur 3. Semikvantitativ metod för att visualisera konkurrensen inom specifiken på ett beskrivande sätt (se avsnitt 5). Före kokultivering (0 timmar) och efter 7 timmar och 24 timmar av tillväxt utspädningar(10-4)av celler sågs på SP agar plattor. De överlevande cellerna som har bildat kolonier efter 12 timmars inkubation vid 37 °C identifierades av stereo fluorescensmikroskopi. Exponeringstid, 0,6 sek; skalstång, 1 mm. Denna siffra modifierades från Gunka et al. 20132.
Figur 4. Kvantifiering av konkurrensen inom de olika arterna. Efter provutspädning och förökning av cellerna (se steg 3.1-3.3) på SP medium inkuberades plattorna över natten vid 37 °C. Gula och blå kolonier kvantifierades enligt beskrivningen i protokollen 4 och 6. De svarta felstaplarna representerar standardavvikelser för minst fyra oberoende upprepade experiment. Varje agarplatta innehöll minst 100 räknebara kolonier. a)I avsaknad av exogen glutamat B. subtilis stam BP40 (gul) utrustad med endast en funktionell GDH konkurrerar ut stam BP54 (blå), som syntetiserar både glutamatnedbrytande enzymer, RocG och GudB. (B) Syntesen av två funktionella GDH är däremot fördelaktig för bakterierna när exogen glutamat finns tillgänglig eftersom glutamat förutom glukos används som kolkälla. Som framgår av (C) och (D) erhölls jämförbara resultat i ett färgomkopplarexperiment. Denna siffra modifierades från Gunka et al. 20132. Klicka här om du vill visa större bild.
Figur 5. Kontrollexperiment för att utvärdera effekten av fluorforkodning cfp och yfp gener på bakteriernas kondition. Blandade populationer av de isogena stammarna BP40 (rocG+ gudBCR amyE::yfp) och BP41 (rocG+ gudBCR amyE::cfp) eller BP52 (rocG+ gudB+ amyE::cfp) och BP156 (rocG+ gudB+ amyE::yfp) odlades i frånvaro (A) och i närvaro (B) av exogen glutamat. De överlevande cellerna räknades enligt beskrivningen i protokollen 1-4 respektive 6. Staplarna representerar standardavvikelser för minst fyra oberoende upprepade experiment. Denna siffra modifierades från Gunka et al. 20132. Klicka här om du vill visa större bild.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Flera metoder har utvecklats för att analysera konkurrenskraftig kondition hos bakterier16. I många fall var bakterierna märkta med olika antibiotikaresistenskassetter17. I likhet med vårt tillvägagångssätt möjliggör märkning av cellerna med antibiotikaresistenskassetter utvärdering av bakteriernas konkurrenskraftiga kondition under kokultivering under definierade tillväxtförhållanden. Dessutom kan denna metod användas för att bestämma konkurrenskraftig kondition hos celler som skiljer sig från varandra i en specifik johannesbröd på kromosomen17. Det finns dock vissa nackdelar med att använda antibiotikaresistenskassetter för att övervaka konkurrenskraftig kondition. Eftersom uttrycket av resistensgenerna främst drivs av att promotors har ojämlik styrka produceras enzymerna som ger resistens mot antibiotika förmodligen på olika nivåer. Därför kan svaga fitness effekter inte upptäckas med detta tillvägagångssätt. I vårt tillvägagångssätt integrerades båda fluorforgenerna med samma urvalsmarkör och deras uttryck drivs av samma promotor2. En annan nackdel med att övervaka konkurrenskraftig kondition med antibiotikaresistenskassetter kan vara att tillvägagångssättet är mer mödosamt eftersom två typer av agarplattor kompletterade med lämpliga antibiotika behövs för koloniräkningen. Alternativt kan bakteriernas kondition bestämmas genom att helt enkelt övervaka tillväxttakten och genom beräkningen av ett så kallat fitnessindex16. Uppenbarligen är detta det mest exakta tillvägagångssättet eftersom bakterierna odlas individuellt och giftiga föreningar som kan produceras av en stam med en viss genotyp kommer inte att påverka tillväxten av den konkurrerande stammen. Dessutom finns det inget behov av att använda antibiotika som kan påverka cellernas tillväxt. Båda tillvägagångssätten är dock inte särskilt belysande eftersom siffrorna som beskriver konkurrenskraftig kondition bara kan presenteras på ett ganska neutralt sätt.
Användningen av fluorforkodningsgener för att övervaka och kvantifiera intraspecieskonkurrens har flera fördelar jämfört med andra metoder. Om båda stammarna har integrerat fluorforkodningsgenerna genom dubbel homolog rekombination i kromosomen, finns det inget behov av att använda antibiotika i något av odlingsstegen. Därför kan prover som tas från kulturen under odling analyseras på samma tillväxtmedium och båda stammarna kan växa. Detta tillvägagångssätt möjliggör visualisering av intraspecies konkurrens på ett mycket belysande sätt. Dessutom, med hjälp av denna semiquantitative strategi flera tillväxt villkor kan testas samtidigt och många olika stammar kan jämföras parallellt. Slutligen finns det inget behov av fixering av proverna på mikroskopbilder eftersom de prover som togs från bakteriekulturen under kokultiveringen kan lagras i en frys18. Således kan alla prover och replikat analyseras samtidigt.
Två kritiska steg i vårt protokoll måste nämnas. Det är viktigt att notera att kryostockarna bör innehålla lika stora mängder celler i samma tillväxtfas som varje konkurrentstam. En första oproportionerligt urrapportering av stammarna i kryostockarna och följaktligen i skakkolvarna innan experimentet påbörjas kommer att ha en stark inverkan på resultatet av konkurrensexperimentet. Därför är det klokt att kontrollera sammansättningen av kryostockarna före experimentet. Dessutom bör en lämplig mängd celler förökas jämnt över plattan. Annars är de uppkomna kolonierna för nära varandra och en exakt bestämning av de överlevande cellerna blir svår.
Det finns också vissa begränsningar och nackdelar med det fluoroforbaserade tillvägagångssättet. Kokultivering i en multi-well plåtläsare och samtidig upptäckt av cfp- och YFP-signaler är inte möjlig eftersom fluororernas excitations- och utsläppsspektra ligger för nära varandra. Detta tekniska problem kan dock kringgås med hjälp av olika fluorescerande proteiner, såsom de som avger grönt och rött ljus, optimalt baserat på samma proteinställning. En annan nackdel med det fluoroforbaserade tillvägagångssättet kan vara att vissa mutationer bara orsakar en svag tillväxtdefekt av bakterierna. Således, om tillväxtdefekten som kan orsakas av någon av de fluorforkodande generna är starkare än tillväxtdefekten som orsakas av en viss mutation, är det fluoroforbaserade tillvägagångssättet inte lämpligt att analysera intraspecies konkurrens. Därför, innan du skapar en hel uppsättning stammar rekommenderas att först märka endast föräldrastammen med både, cfp och yfp, och att kokultivera stammarna. Tillväxtexperimenten kommer att avslöja hur starka fluorforerna påverkar bakteriernas kondition (se figurerna 5A och 5B).
I framtiden blir det intressant att testa om det fluorforbaserade tillvägagångssättet för att övervaka intraspecieskonkurrens kommer att vara mer exakt och mindre mödosamt om de överlevande cellerna räknas med hjälp av flödescytometri. Nyligen har flödescytometri visat sig vara ett kraftfullt verktyg för att analysera sammansättningen av B. subtilis biofilms19. Dessutom kan det vara lämpligare att analysera svaga fitnesseffekter som påverkar bakteriernas konkurrenskraftiga kondition genom kontinuerlig kokultivering av fluoroformärkta bakterier i en fermentor. I motsats till skakkolvar gör detta tillvägagångssätt det möjligt att hålla tillväxtförhållandena konstanta och därmed övervaka konkurrensen inom de olika ämnena under en lång tidsperiod.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande ekonomiska intressen.
Acknowledgments
Arbetet i författarnas labb stöddes av Deutsche Forschungsgemeinschaft (http://www.dfg.de; CO 1139/1-1), Fonds der Chemischen Industrie (http://www.vci.de/fonds) och Göttingen Centre for Molecular Biology (GZMB). Författarna vill uppmärksamma Jörg Stülke för hjälpsamma kommentarer och kritisk läsning av manuskriptet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| (NH4)2SO4 | Roth, Germany | 3746 | |
| Agar | Difco, USA | 214010 | |
| Ammonium ferric citrate (CAF) | Sigma-Aldrich, Germany | 9714 | |
| CaCl2 | Roth, Germany | 5239 | |
| Glucose | Applichem, Germany | A3617 | |
| Glycerol | Roth, Germany | 4043 | |
| K2HPO4•3H2O | Roth, Germany | 6878 | |
| KCl | Applichem, Germany | A3582 | |
| KH2PO4 | Roth, Germany | 3904 | |
| KOH | Roth, Germany | 6751 | |
| MgSO4•7H2O | Roth, Germany | P027 | |
| MnCl2 | Roth, Germany | T881 | |
| MnSO4•4H2O | Merck Millipore, Germany | 102786 | |
| NaCl | Roth, Germany | 9265 | |
| Nutrient broth | Roth, Germany | X929 | |
| Potassium glutamate | Applichem, Germany | A3712 | |
| Tryptone | Roth, Germany | 8952 | |
| Tryptophan | Applichem, Germany | A3445 | |
| Yeast extract | Roth, Germany | 2363 | |
| 1.5 ml Reaction tubes | Sarstedt, Germany | 72,690,001 | |
| 2.0 ml Reaction tubes | Sarstedt, Germany | 72,691 | |
| 15 ml Plastic tubes with screw cap | Sarstedt, Germany | 62,554,001 | |
| Petri dishes | Sarstedt, Germany | 82.1473 | |
| 1.5 ml Polystyrene cuvettes | Sarstedt, Germany | 67,742 | |
| 15 ml Glass culture tubes | Brand, Germany | 7790 22 | |
| 100 ml Shake flasks with aluminium caps | Brand, Germany | 928 24 | |
| Sterile 10 ml glass pipettes | Brand, Germany | 278 23 | |
| Incubator (28 and 37 °C) | New Brunswick | M1282-0012 | |
| Standard pipette set (2-20 μl, 10-100 μl, 100-1,000 μl) | Eppendorf, Germany | 4910 000.034, 4910 000.042, | |
| Table top centrifuge for 1.5 and 2 ml reaction tubes | Thermo Scientific, Heraeus Fresco 21, Germany | 75002425 | |
| Table top centrifuge for 15 ml plastic tubes | Heraeus Biofuge Primo R, Germany | 75005440 | |
| Standard spectrophotometer | Amersham Biosciences Ultrospec 2100 pro, Germany | 80-2112-21 | |
| Stereofluorescence microscope | Zeiss SteREO Lumar V12, Germany | 495008-0009-000 | |
| Freezer (-20 and -80 °C) | - | - | |
| Fridge (4 °C) | - | - | |
| Autoclave | Zirbus, LTA 2x3x4, Germany | - | |
| pH meter | pH-meter 766, Calimatic, Knick, Germany | 766 | |
| Vortex | Vortex 3, IKA, Germany | 3340000 | |
| Balance | CP2202S, Sartorius, Germany | replaced by | |
| Black pen (permanent marker) | Staedler, Germany | 317-9 | |
| Powerpoint program | Microsoft, USA | - | |
| Office Excel program | Microsoft, USA | - | Program for data processing |
| Adobe Photoshop CS5 | Adobe, USA | replaced by CS6, download | Computer program for image processing |
| Computer | PC or Mac | - | |
| ZEN pro 2011 software for the stereofluorescence microscope | Zeiss, Germany | 410135 1002 110 | AxioCam MRc Rev. Obtained through Zeiss |
| Specific solution recipes | |||
| SP Medium | |||
| 8 g Nutrient broth | |||
| 0.25 mg MgSO4•7H2O | |||
| 1 g KCl | |||
| 15 g agar for solid SP medium | if required | ||
| add 1 L with H2O | autoclave for 20 min at 121 °C | ||
| 1 ml CaCl2 (0.5 M), sterilized by filtration | |||
| 1 ml MnCl2 (10 mM), sterilized by filtration | |||
| 2 ml ammonium ferric citrate (CAF, 2.2 mg/ml), sterilized by filtration | |||
| LB Medium | |||
| 10 g Tryptone | |||
| 5 g Yeast extract | |||
| 10 g NaCl | |||
| 15 g agar for solid LB medium | if required | ||
| add 1 L with H2O | autoclave for 20 min at 121 °C | ||
| C-Glc Minimal Medium | |||
| 200 ml 5 x C salts | |||
| 10 ml L-Tryptophan (5 mg/ml), sterilized by filtration | |||
| 10 ml ammonium ferric citrate (CAF, 2.2 mg/ml), sterilized by filtration | |||
| 10 ml III’ salts | |||
| 25 ml Glucose (20%) | autoclaved for 20 min at 121 °C | ||
| add 1 L with sterile H2O | |||
| CE-Glc Minimal Medium | |||
| 200 ml 5 x C salts | |||
| 10 ml L-Tryptophan (5 mg/ml), sterilized by filtration | |||
| 10 ml ammonium ferric citrate (CAF, 2.2 mg/ml), sterilized by filtration | |||
| 10 ml III’ salts | |||
| 20 ml Glutamate (40%) | |||
| 25 ml Glucose (20%), autoclaved for 20 min at 121 °C | |||
| add 1 L with sterile H2O | |||
| 5 x C salts | |||
| 20 g KH2PO4 | |||
| 80 g K2HPO4•3H2O | |||
| 16.5 g (NH4)2SO4 | |||
| add 1 L with sterile H2O | autoclave for 20 min at 121 °C | ||
| III’ salts | |||
| 0.232 g MnSO4•4H2O | |||
| 12.3 g MgSO4•7H2O | |||
| add 1 L with sterile H2O, autoclave for 20 min at 121 °C | |||
| 40% Glutamate solution | |||
| 200 g L-Glutamic acid | |||
| adjust the pH to 7.0 by adding approximately 80 g KOH | |||
| add 0.5 L with sterile H2O | autoclave for 20 min at 121 °C | ||
| 0.9% Saline (NaCl) Solution | |||
| add 1 L with sterile H2O | autoclave for 20 min at 121 °C | ||
| 50% Glycerol solution | |||
| 295 ml Glycerol (87%) | |||
| add 0.5 L with sterile H2O | autoclave for 20 min at 121 °C | ||
| Bacteria (All strains are based on the Bacillus subtilis strain 168) | |||
| Bacillus subtilis BP40 (rocG+ gudBCR amyE::PgudB-yfp) | Laboratory strain collection | ||
| Bacillus subtilis BP41 (rocG+ gudBCR amyE::PgudB-cfp) | |||
| Bacillus subtilis BP52 (rocG+ gudB+ amyE::PgudB-cfp) | |||
| Bacillus subtilis BP156 (rocG+ gudB+ amyE::PgudB-yfp) | |||
References
- Buescher, F. I., et al. Global network reorganization during dynamic adaptations of Bacillus subtilis metabolism. Science. 335, 1099-1103 (2012).
- Gunka, K., Stannek, L., Care, R. A., Commichau, F. M. Selection-driven accumulation of suppressor mutants in Bacillus subtilis: the apparent high mutation frequency of the cryptic gudB gene and the rapid clonal expansion of gudB+ suppressors are due to growth under selection. PLoS One. 8, (2013).
- Al Mamum, A. A. M., et al. Identity and function of a large gene network underlying mutagenic repair of DNA breaks. Science. 338, 1344-1348 (2012).
- Koeppel, A. F., Wertheim, J. O., Barone, L., Gentile, N., Krizanc, D., Cohan, F. M. Speedy speciation in a bacterial microcosm: new species can arise as frequently as adaptations within a species. ISME J. 7, 1080-1091 (2013).
- Maughan, H., Nicholson, W. L. Increased fitness and alteration of metabolic pathways during Bacillus subtilis evolution in the laboratory. Appl. Environ. Microbiol. 77, 4105-4118 (2011).
- Burkholder, P. R., Giles, N. H. Induced biochemical mutations in Bacillus subtilis. Am. J. Bot. 34, 345-348 (1947).
- McLoon, A. L., Guttenplan, S. B., Kearns, D. B., Kolter, R., Losick, R. Tracing the domestication of a biofilm-forming bacterium. J. Bacteriol. 193, 2027-2034 (2011).
- Zeigler, D. R., et al. The origins of 168, W23, and other Bacillus subtilis legacy strains. J. Bacteriol. 190, 6983-6995 (2008).
- Gunka, K., Tholen, S., Gerwig, J., Herzberg, C., Stülke, J., Commichau, F. M. A high-frequency mutation in Bacillus subtilis: requirements for the decryptification of the gudB glutamate dehydrogenase. 194, 1036-1044 (2012).
- Commichau, F. M., et al. Characterization of Bacillus subtilis mutants with carbon source-independent glutamate biosynthesis. J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 12, 106-113 (2007).
- Beckwith, J. Genetic suppressors and recovery of repressed biochemical memory. J. Biol. Chem. 284, 12585-12592 (2009).
- Gunka, K., Commichau, F. M. Control of glutamate homeostasis in Bacillus subtilis: a complex interplay between ammonium assimilation, glutamate biosynthesis and degradation. Mol. Microbiol. 85, 213-224 (2012).
- Yan, D. Protection of the glutamate pool concentrations in enteric bacteria. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 9475-9480 (2007).
- Belitsky, B. R., Sonenshein, A. L. Role and regulation of Bacillus subtilis glutamate dehydrogenase genes. J. Bacteriol. 180, 6298-6305 (1998).
- Commichau, F. M., Herzberg, C., Tripal, P., Valerius, O., Stülke, J. A regulatory protein-protein interaction governs glutamate biosynthesis in Bacillus subtilis: the glutamate dehydrogenase RocG moonlights in controlling the transcription factor GltC. Mol. Microbiol. 65, 642-654 (2007).
- Gordo, I., Perfeito, L., Sousa, A. Fitness effects of mutations in bacteria. J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 21, 20-35 (2011).
- Rabatinová, A., et al. The δ subunit of RNA polymerase is required for rapid changes in gene expression and competitive fitness of the cell. J. Bacteriol. 195, 2603-2611 (2013).
- Capra, E. J., Perchuk, B. S., Skerker, J. M., Laub, M. T. Adaptive mutations that prevent crosstalk enable the expansion of paralogous signalling protein families. Cell. 150, 222-232 (2012).
- García-Betancur, J. C., Yepes, A., Schneider, J., Lopez, D. Single-cell analysis of Bacillus subtilis biofilms using fluorescence microscopy and flow cytometry. J. Vis. Exp. (15), (2012).
