Summary
Bakterier kan akkumulere enten skadelige eller gunstige mutasjoner i løpet av livet. I en populasjon av celler kan individer som har akkumulert gunstige mutasjoner raskt utkonkurrere sine medmennesker. Her presenterer vi en enkel prosedyre for å visualisere intraarter konkurranse i en bakteriell cellepopulasjon over tid ved hjelp av fluorescerende merkede individer.
Abstract
Mange mikroorganismer som bakterier sprer seg ekstremt raskt, og bestandene kan nå høye celletettheter. Små brøkdeler av celler i en populasjon har alltid akkumulert mutasjoner som enten er skadelige eller gunstige for cellen. Hvis kondisjonseffekten av en mutasjon gir subpopulasjonen en sterk selektiv vekstfordel, kan individene i denne subpopulasjonen raskt utkonkurrere og til og med eliminere sine nærmeste stipendiater helt. Dermed kan små genetiske endringer og seleksjonsdrevet akkumulering av celler som har fått gunstige mutasjoner føre til et fullstendig skifte av genotypen til en cellepopulasjon. Her presenterer vi en prosedyre for å overvåke rask klonisk ekspansjon og eliminering av gunstige og skadelige mutasjoner, henholdsvis i en bakteriell cellepopulasjon over tid ved kokultivasjon av fluorescerende merkede individer av Gram-positiv modellbakterien Bacillus subtilis. Metoden er enkel å utføre og svært illustrerende for å vise intraspecies konkurranse blant individene i en bakteriell cellepopulasjon.
Introduction
Jordbakterier er vanligvis utstyrt med fleksible regulatoriske nettverk og bred metabolsk kapasitet. Begge funksjonene gjør det mulig for cellene å justere sine katabolske og anabole veier for å konkurrere med sine medmennesker og andre mikroorganismer for næringsstoffene, som er tilgjengelige i en gitt økologisk nisje1. Men hvis bakteriene ikke klarer å tilpasse seg miljøet, kan andre mekanismer utgjøre overlevelse av en art. Faktisk, så mange bakterier sprer seg raskt og populasjonene kan nå høy celle tetthet subpopulasjoner kan ha spontant akkumulert gunstige mutasjoner som gir cellene en selektiv vekst fordel og derfor øke deres kondisjon. Videre kan mutasjonelle hotspots og stressindusert adaptiv mutagenese lette utviklingen av en maladapted bakterie2,3. Dermed er akkumulering av mutasjoner og vekst under kontinuerlig utvelgelse opprinnelsen til det enorme mikrobielle mangfoldet, selv innenfor samme slekt4,5. Som i naturen forekommer forming av bakterielle genomer også i laboratoriet på grunn av kontinuerlig dyrking under utvelgelse. Dette er eksemplifisert ved domesticering av Gram-positiv bakterie B. subtilis, som brukes over hele verden i grunnleggende forskning og i industrien. På 1940-tallet B. subtilis ble behandlet med DNA-skadelige røntgenstråler etterfulgt av dyrking under en bestemt veksttilstand6. Mutasjonene som har akkumulert i bakteriene under domesticering står for tap av mange vekstegenskaper, det vil si at B. subtilis laboratoriestamme 168 mistet evnen til å danne komplekse kolonier7,8.
I dag, for de best studerte modellbakteriene Escherichia coli og B. subtilis, er en rekke kraftige verktøy tilgjengelig for å genetisk manipulere sine genomer for å adressere spesifikke vitenskapelige spørsmål. Noen ganger forårsaker inaktivering av et gen av interesse en alvorlig vekstfeil, som da er tydelig synlig på standard vekstmedium9. Til sammenligning blir mutasjoner som forårsaker en svak vekstfeil og dermed bare litt påvirker belastningens kondisjon, ofte ignorert. Men i begge tilfeller fører langvarig inkubasjon og passivring av mutantstammene i flere generasjoner vanligvis til opphopning av undertrykkermutanter som har gjenopprettet fenotypen til foreldrestammen2,9. Karakteriseringen av undertrykkermutanter og identifisering av mutasjonene som har gjenopprettet vekstfeilen til foreldremutantstammen, er en veldig nyttig tilnærming som tillater belysning av viktige og ofte nye cellulære prosesser10,11.
Vi er interessert i kontroll av glutamat homeostase i B. subtilis12. I likhet med E. colireagerer B. subtilis på perturbasjon av glutamat homeostase (dvs.blokk i glutamatforringelse2) ved opphopning av undertrykkermutanter. De genomiske endringene i disse undertrykkermutantene som ble anskaffet ved spontan mutasjon, ble vist å raskt gjenopprette glutamat homeostase9,13. Derfor er det ikke overraskende at tilpasning av B. subtilis til en bestemt veksttilstand under domesticering av bakterien speiles i enzymsyntese og i de utviklede enzymatiske aktivitetene, som er involvert i glutamatmetabolisme12. Det har blitt antydet at mangelen på eksogen glutamat i vekstmediet under domesticeringsprosessen var drivkraften for fremveksten og fikseringen av det kryptiske glutamat dehydrogenase (GDH) gudBCR-genet i laboratoriestammen 1682,14. Denne hypotesen støttes av vår observasjon om at den reduserte mengden GDH-aktivitet i laboratoriestammen gir bakteriene en selektiv vekstfordel når eksogen glutamat er knapp2. Videre, dyrking av en B. subtilis stamme, syntetisering av GDH GudB, i fravær av eksogen glutamat resulterer i opphopning av undertrykkermutanter som har inaktivert gudB-genet 2. Åpenbart er tilstedeværelsen av en katabolsk aktiv GDH ufordelaktig for cellen fordi endogenet produsert glutamat som ellers kunne brukes til anabolisme, forringes til ammonium og 2-oksoglutarat (figur 1). Til sammenligning, når glutamat er gitt av mediet, har en B. subtilis-stamme utstyrt med GDH-aktivitet på høyt nivå en selektiv vekstfordel i forhold til en stamme som bare syntetiserer en funksjonell GDH. Det er rimelig å anta at høy GDH-aktivitet gjør at bakteriene kan utnytte glutamat som en annen karbonkilde i tillegg til andre karbonkilder levert av mediet2 (se figur 1). Dermed påvirker GDH-aktivitet sterkt kondisjon av bakterier, avhengig av tilgjengeligheten av eksogen glutamat.
Her presenterer vi en svært illustrerende metode for å overvåke og visualisere intraarter konkurranse mellom to B. subtilis stammer som varierer i et enkelt locus på kromosomet (Figur 2). De to stammene ble merket med yfp- og cfp-genene som koder fluoroforene YFP og CFP, og kokultivert under forskjellige ernæringsmessige forhold. Ved prøvetaking over tid og ved å plate passende fortynning på agarplater, kan de overlevende i hver av kulturene enkelt overvåkes ved hjelp av et vanlig stereofluorescensmikroskop. Prosedyren beskrevet i dette dokumentet er lett å utføre og egnet til å visualisere den raske kloniske utvidelsen og eliminering av henholdsvis gunstige og skadelige mutasjoner i en cellepopulasjon over tid.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Utarbeidelse av Agarplater, kulturmedier, kryostocks og prekulturer
- Forbered vekstmedier og nødvendige reagenser (se tabell over materialer og reagenser).
- Strekk B. subtilis-stammene (f.eks. BP40 (rocG+ gudBCR amyE::PgudB-yfp) og BP52 (rocG+ gudB+ amyE::PgudB-cfp) som uttrykker henholdsvis en og to aktive GDHs)2 som vil bli brukt i konkurranseeksperimentet på SP medium agarplater for å få enkeltkolonier. Inkuber platene over natten ved 37 °C.
- Ta enkle kolonier og inokuler sterile kulturrør som inneholder 4 ml LB flytende medium. Dyr øk bakteriene over natten ved 28 °C og 220 o/min.
- Vokse over natten kulturer ved 28 °C for å unngå at cellene lyses eller sporulate.
- Mål kulturenes optiske tetthet ved en bølgelengde på 600 nm (OD600) ved hjelp av et standard spektrofotometer.
- Hvis kulturene har nådd en OD600 av 2,0, bland 0,75 ml av kulturene med 0,75 ml av en steril 50% glyseroloppløsning i 1,5 ml reaksjonsrør. Den endelige OD600 skal være 1,0 for å oppnå kryostocks som inneholder ca. 108 celler/ml.
- Oppbevar rørene ved -80 °C.
- Lag tre prekulturer av hver stamme merket med cfp og yfp koding fluorophore gener. Inokuler prekulturene (sterile kulturrør som inneholder 4 ml LB flytende medium) med 1 μl celler fra -80 °C kryostocks. Inkuber kulturene over natten ved 28 °C og 220 o/min.
2. Kokultur av bakterier, prøveinnsamling og prøvelagring
- Forbered 100 ml C-Glc og CE-Glc minimalt medium (se tabell over reagenser og materialer), og overfør 20 ml av hvert medium til sterile 100 ml ristflasker.
- Ta 0,1 ml av prekulturene som ble dyrket over natten, fortynn dem med 0,9 ml LB medium i en 1,5 ml cuvette, og bestem OD600.
- For konkurranseeksperimentet, ta de prekulturene av de forskjellige stammene som har en lignende OD600 mellom 1,0-1,5.
- For å oppnå blandede cellepopulasjoner, fortynn cellene i prekulturene som hadde riktig OD600 til en OD600 av 0,05 i 20 ml C-Glc og CE-Glc minimalt medium supplert i 100 ml risteflasker. For konkurranseeksperimentet skal de to stammene blandes i et 1:1-forhold.
- Ta 10 ml prøver fra kolber, overfør dem til 15 ml plastrør, høst cellene ved sentrifugering i 10 min ved 4000 x g i en standard bordplate sentrifuge, og kast supernatanten.
- Resuspend cellene i 0,5 ml frisk LB medium, og overfør cellene til en steril 1,5 ml reaksjonskopp. Tilsett 0,5 ml 50% steril glyserol, bland suspensjonen ved streng virveling, og oppbevar prøvene i en -80 °C fryser til videre behandling.
- Inkuber cellene som er igjen i risteflaskene i opptil 24 timer ved 37 °C og 220 o/min. Hold risteflaskene i mørket for å forhindre fotobleking av fluoroforene.
- Ta ytterligere prøver på 0,1 ml etter 7 timer og 24 timers vekst. Mål og noter OD600 av 1:10 fortynninger (i C-Glc eller CE-Glc minimal medium) av prøvene.
- Ta riktig mengde celler fra hver kultur for å lage kryostocks som har en OD600 av 1.0. Oppbevar prøvene ved -80 °C inntil videre behandling.
3. Prøvebehandling, plating og inkubasjon for kvantitative analyser
- Etter å ha samlet alle prøver, tin kryostocks og fortynn cellene i en 0,9% saltløsning (se tabell over reagenser og materialer) opptil10-3.
- Plate 0,1 ml av de10-3 fortynningene på SP medium agarplater og fordel cellene ved hjelp av sterile glasspipetter.
- Inkuber platene over natten ved 37 °C i mørket til enkeltkolonier har dukket opp.
4. Telle de overlevende ved stereofluorescensmikroskopi for kvantitativ analyse
- Del bunnen av agarplaten med en svart penn i fire deler for bedre orientering mens du teller de overlevende under stereofluorescensmikroskopet.
- Plasser platen opp ned under mikroskopet og sett koloniene i fokus ved hjelp av kaldt lyskilden.
- Når koloniene er i fokus, bytt til riktig filtersett for CFP for å visualisere de overlevende cellene i den cfp-merkedestammen. Tell de overlevende av denne stammen ved å merke koloniene med en penn og noter nummeret.
- Fjern etikettene med etanol og bytt til YFP-filtersettet for å visualisere de overlevende cellene i den yfp-merkedestammen. Tell de overlevende igjen ved å merke koloniene med en penn og notere nummeret.
5. Prøvebehandling og mikroskopi for semikantative analyser
- For illustrasjonsfigurer, spot 10 μl av10-4 fortynning (ca. 100 celler) fra trinn 3.1 på en SP-agarplate (se figur 3).
- Inkuber platene over natten ved 37 °C i mørket til enkeltkolonier har dukket opp.
- Plasser Petri-retten uten lokk under mikroskopet og sett stedet i fokus ved hjelp av kaldt lyskilden.
- Ta bilder av stedene for illustrasjonsfigurer. Velg en passende eksponeringstid for å ta bildene av koloniene med kaldt lyskilden.
- Uten å flytte platen, bytt til CFP-filtersettet, juster eksponeringstiden og ta et bilde. Gjør det samme med YFP-filtersettet og lagre bildene for videre analyser.
6. Dataanalyse
- Bruk programvare som Excel for kvantitative dataanalyser. Basert på de talte koloniene beregner du prosentandelen av gule og blå kolonier med hensyn til hele antall kolonier, som er satt til 100%.
- Bruk de beregnede tallene til å opprette et stablet liggende stolpediagram (se figur 4 og figur 5). Bruk et bildebehandlingsprogram, for eksempel Adobe Photoshop, til å lage sammenslåtte bilder av bildene som er tatt fra de forskjellige stedene. Alternativt kan den fritt tilgjengelige programvaren ImageJ, som kan lastes ned fra http://rsbweb.nih.gov/ij/ brukes til bildebehandling.
- Åpne bildene fra ett sted som ble tatt med CFP-filtersettet og YFP-filtersettet. Optimaliser kontrasten og lysstyrken for å redusere fluorescens fra mediet.
- Gå til et av bildene, og merk alle. Kopier bildet og lim det inn på det andre bildet.
- Enten bruk funksjonen "farge dodge" for å slå sammen bildene eller legge over fluorescerende bilder ved hjelp av kanalfanen. Sammenslåtte bilder av koloniene fra ulike medier og ulike tidspunkter representerer veksten av de ulike stammene i den flytende kulturen.
7. Spesifikke tips: Fargebrytereksperiment og kokulturering av isogene stammer merket med cfp og yfp
Uttrykket av et av de to fluorofor-kodingsgenene i B. subtilis kan påvirke kondisjon og dermed vekstraten til bakteriene. Derfor anbefales det å utføre følgende eksperimenter for å utelukke at eliminering av en konkurrentstamme fra cellepopulasjonen under dyrking bare skyldes en negativ effekt av fluoroforen:
- Gjenta hele eksperimentet og kokultivate omvendt merkede stammer (f.eks. den tidligere cfp-merkedestammen er nå merket med yfp-genet og omvendt). Selv om de oppnådde resultatene er omvendt, bør de være sammenlignbare med den forrige observasjonen om at den ene stammen har en selektiv vekstfordel i forhold til den andre stammen.
- Gjenta hele eksperimentet og kokultivat isogene stammer merket med yfp og cfp (f.eks. BP40 (rocG+ gudBCR amyE::PgudB-yfp) og BP41 (rocG+ gudBCR amyE::PgudB-cfp)). Beregn den negative effekten av en av de to fluoroforene på bakteriens kondisjon ved å følge sammensetningen av cellepopulasjonen over tid.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Metoden beskrevet her ble vellykket brukt til å visualisere intraarter konkurranse i en celle populasjon bestående av B. subtilis stammer som ble merket med cfp og yfp gener som koder fluorophores CFP og YFP, henholdsvis. Som vist i figur 3, kan metoden brukes til å visualisere intraarter konkurranse på en svært illustrerende måte. Ved å oppdage prøvene på små områder ble klonsammensetningen av cellepopulasjonen synlig på et øyeblikk. Selv om denne tilnærmingen ikke er egnet for kvantitative analyser, er den nyttig for omtrent å estimere effekten av forskjellige vekstparametere (dvs.nitrogenkilde) på utviklingen av en cellepopulasjon som i utgangspunktet inneholdt begge stammene i like store mengder (figur 3). Videre, i en liten tilnærming, kan kondisjonen til forskjellige B. subtilis stammer som ble dyrket under samme veksttilstand testes ved hjelp av en enkelt agarplate. For kvantitative analyser anbefales det å forplante prøvene over hele overflaten av en agarplate. Dette vil forhindre overlegg av koloniene og dermed tillater distinkt identifisering og telling av kolonier som dukket opp fra enkeltceller. Ved å plating passende fortynning på agarplater kan klonisk sammensetning av en cellepopulasjon over tid bestemmes nøyaktig bare ved å telle de gule og blå fluorescerende koloniene (se figur 4). Som vi tidligere har rapportert, påvirker GDH-aktivitet sterkt kondisjon av B. subtilis avhengig av tilgjengeligheten av eksogen glutamat2. Åpenbart, i fravær av eksogen glutamat høyt nivå GDH aktivitet er ufordelaktig for bakteriene som enzymer RocG og GudB nedbrytes glutamat som er nødvendig i anabolisme (se figur 1 og figur 4A). Derimot, hvis det gis til bakteriene, kan glutamat tjene som en aminogruppedonor i transamineringsreaksjoner. Videre kan glutamat mates inn i karbonmetabolisme og brukes som en energikilde på grunn av tilstedeværelsen av de katabolsk aktive GDHs RocG og GudB (Figur 1 og Figur 4B). Som vist i figur 4C og 4D, ble lignende resultater oppnådd i et fargebrytereksperiment. Igjen ble bakterier utstyrt med høy GDH-aktivitet utkonkurrert av celler med redusert GDH-aktivitet i vekstmedier som manglet glutamat. Derimot ble bakterier som syntetiserer bare en aktiv GDH eliminert fra kulturen da mediet ble supplert med glutamat. Som vist i figur 5A og 5Bforble den første sammensetningen av den blandede cellepopulasjonen nesten konstant over tid. I konkurranseeksperimentet skyldtes dermed eliminering av en av de to stammene som var utstyrt med forskjellige mengder GDH-aktivitet, ikke en vekstfeil forårsaket av fluoroforene (se figur 4). Samlet sett er bruken av fluoroforer et kraftig verktøy for overvåking av intraarter konkurranse i en bakteriell cellepopulasjon.
Figur 1. Koblingen mellom karbon- og nitrogenmetabolisme i B. subtilis. Når glutamat ikke er gitt av mediet, den store amino donor som er nødvendig for anabolisme syntetiseres fra ammonium og 2-oxoglutarate ved den kombinerte virkningen av glutaminsyntetase (GS) og glutamatsyntase (GOGAT). Derimot, i nærvær av eksogen glutamat kan de katabolsk aktive GDHs RocG og / eller GudB forringe glutamat til ammonium og 2-oksoglutarate, som da fungerer som en karbonkilde.
Figur 2. Eksperimentell arbeidsflyt. Stamme 1 (merket med yfp) og stamme 2 (merket med cfp) varierer i ett locus fra hverandre. I eksemplet som presenteres her, har vi sammenlignet effekten av eksogent glutamat (effektor) på det genotypiske skiftet av cellepopulasjonen som i utgangspunktet inneholdt 50% av rocG+ gudB+ (koding av to aktive GDHs) og 50% av rocG+ gudBCR (koding av en aktiv GDH) celler. Klikk her for å vise større bilde.
Figur 3. Semikantiv tilnærming for å visualisere intraarter konkurranse på en beskrivende måte (se avsnitt 5). Før kokultivasjon (0 timer) og etter 7 timer og 24 timers vekstfortynning(10-4) av cellene ble oppdaget på SP agarplater. De overlevende cellene som har dannet kolonier etter 12 timers inkubasjon ved 37 °C, ble identifisert ved stereofluorescensmikroskopi. Eksponeringstid, 0,6 sek; skalastang, 1 mm. Denne figuren ble modifisert fra Gunka et al. 20132.
Figur 4. Kvantifisering av intraspecies konkurranse. Etter prøvefortynning og forplantning av cellene (se trinn 3.1-3.3) på SP-medium ble platene inkubert over natten ved 37 °C. Gule og blå kolonier ble kvantifisert som beskrevet i protokoll 4 og 6. De svarte feilfeltene representerer standardavvik for minst fire uavhengig gjentatte eksperimenter. Hver agarplate inneholdt minst 100 tellbare kolonier. (A) I fravær av eksogen glutamat B. subtilis stamme BP40 (gul) utstyrt med bare en funksjonell GDH utkonkurrerer stammen BP54 (blå), som syntetiserer både glutamat-nedbrytende enzymer, RocG og GudB. (B) Til sammenligning er syntese av to funksjonelle GDHs fordelaktig for bakteriene når eksogent glutamat er tilgjengelig fordi glutamat i tillegg til glukose brukes som karbonkilde. Som vist i (C) og (D), ble sammenlignbare resultater oppnådd i et fargebrytereksperiment. Denne figuren ble modifisert fra Gunka et al. 20132. Klikk her for å vise større bilde.
Figur 5. Kontrolleksperiment for å evaluere effekten av fluorofor-koding av cfp- og yfp-gener på bakterienes kondisjon. Blandede populasjoner av de isogene stammene BP40 (rocG+ gudBCR amyE::yfp) og BP41 (rocG+ gudBCR amyE::cfp) eller BP52 (rocG+ gudB+ amyE::cfp) og BP156 (rocG+ gudB+ amyE::yfp) ble dyrket i fravær (A) og i nærvær (B) av eksogen glutamat. De overlevende cellene ble regnet som beskrevet i henholdsvis protokoll 1-4 og 6. Stolpene representerer standardavvik for minst fire uavhengig gjentatte eksperimenter. Denne figuren ble modifisert fra Gunka et al. 20132. Klikk her for å vise større bilde.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Flere metoder er utviklet for å analysere konkurransedyktig kondisjon av bakterier16. I mange tilfeller ble bakteriene merket med forskjellige antibiotikaresistenskassetter17. I likhet med vår tilnærming tillater merking av cellene med antibiotikaresistenskassetter evalueringen av bakteriens konkurransedyktige kondisjon under kokultivasjon under definerte vekstforhold. Videre kan denne metoden brukes til å bestemme konkurransedyktig kondisjon av celler som adskiller seg fra hverandre i et bestemt locus på kromosomet17. Det er imidlertid noen ulemper ved å bruke antibiotikaresistenskassetter for å overvåke konkurransedyktig kondisjon. Ettersom uttrykket av resistensgenene for det meste er drevet av at promotorer har ulik styrke, produseres enzymene som gir resistens mot antibiotika sannsynligvis på forskjellige nivåer. Derfor kan svake kondisjonseffekter ikke kunne påvises med denne tilnærmingen. I vår tilnærming ble begge fluoroforgenene integrert med samme utvalgsmarkør, og deres uttrykk er drevet av de samme promotorene2. En annen ulempe med å overvåke konkurransedyktig kondisjon med antibiotikaresistenskassetter kan være at tilnærmingen er mer arbeidskrevende ettersom to typer agarplater supplert med passende antibiotika er nødvendig for kolonitellingen. Alternativt kan trening av bakterier bestemmes ved ganske enkelt å overvåke vekstraten og ved beregning av en såkalt treningsindeks16. Åpenbart er dette den mest presise tilnærmingen fordi bakteriene dyrkes individuelt og giftige forbindelser som kan produseres av en stamme med en viss genotype, vil ikke påvirke veksten av den konkurrerende stammen. Videre er det ikke nødvendig å bruke antibiotika som kan påvirke veksten av cellene. Begge tilnærmingene er imidlertid ikke veldig illustrerende, da tallene som beskriver konkurransedyktig kondisjon bare kan presenteres på en ganske nøytral måte.
Bruk av fluoroforkodingsgener for å overvåke og kvantifisere intraarter konkurranse har flere fordeler i forhold til andre metoder. Hvis begge stammene har integrert fluoroforkodingsgenene ved dobbel homolog rekombinasjon i kromosomet, er det ikke nødvendig å bruke antibiotika i noen av dyrkingstrinnene. Derfor kan prøver som tas fra kulturen under dyrking analyseres på samme vekstmedium, og begge stammene er i stand til å vokse. Denne tilnærmingen tillater visualisering av intraspecies konkurranse på en svært illustrerende måte. Videre kan bruk av denne semikantede tilnærmingen flere vekstforhold testes samtidig, og mange forskjellige stammer kan sammenlignes parallelt. Til slutt er det ikke behov for fiksering av prøvene på mikroskopskred fordi prøvene som ble tatt fra bakteriekulturen under kokultivasjon, kan lagres i en fryser18. Dermed kan alle prøver og replikeringer analyseres samtidig.
To kritiske trinn i vår protokoll må nevnes. Det er viktig å merke seg at kryostocks skal inneholde like mengder celler i samme vekstfase av hver konkurrentstamme. En innledende uforholdsmessig av stammene i kryostocks og følgelig i shake kolber før du starter eksperimentet vil ha en sterk innvirkning på utfallet av konkurranseeksperimentet. Derfor er det lurt å sjekke sammensetningen av kryostocks før eksperimentet. Videre bør en passende mengde celler forplantes jevnt over platen. Ellers er de fremvoksende koloniene for nær hverandre, og en presis bestemmelse av de overlevende cellene vil bli vanskelig.
Det er også noen begrensninger og ulemper ved den fluoroforbaserte tilnærmingen. Kokultivasjon i en multi-brønn plateleser og samtidig deteksjon av CFP- og YFP-signalene er ikke mulig, da eksitasjons- og utslippsspektraet til fluoroforene er for nær hverandre. Imidlertid kan dette tekniske problemet omgås ved hjelp av forskjellige fluorescerende proteiner, for eksempel de som avgir grønt og rødt lys, optimalt basert på samme proteinstillas. En annen ulempe ved den fluoroforbaserte tilnærmingen kan være at noen mutasjoner bare forårsaker en svak vekstfeil i bakteriene. Således, hvis vekstfeilen som kan være forårsaket av et av fluoroforkodingsgenene er sterkere enn vekstfeilen forårsaket av en viss mutasjon, er den fluoroforbaserte tilnærmingen ikke hensiktsmessig å analysere intraspecies konkurranse. Derfor, før du lager et helt sett med stammer, anbefales det å først merke bare foreldrestammen med både cfp og yfp, og å kokultivate stammene. Veksteksperimentene vil avdekke hvor sterke fluoroforene påvirker bakteriens kondisjon (se figur 5A og 5B).
I fremtiden vil det være interessant å teste om den fluoroforbaserte tilnærmingen til å overvåke intraarter konkurranse vil være mer nøyaktig og mindre arbeidskrevende hvis de overlevende cellene telles ved hjelp av strømningscytometri. Nylig har strømningscytometri vist seg å være et kraftig verktøy for å analysere sammensetningen av B. subtilis biofilmer19. Videre kan det være mer hensiktsmessig å analysere svake kondisjonseffekter som påvirker konkurransedyktig kondisjon av bakterier ved kontinuerlig kokultivasjon av fluoroformerkede bakterier i en gjærer. I motsetning til riste kolber, gjør denne tilnærmingen det mulig å holde vekstforholdene konstante og dermed overvåke intraarter konkurranse over lang tid.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer at de ikke har konkurrerende økonomiske interesser.
Acknowledgments
Arbeidet i forfatterlaboratoriet ble støttet av Deutsche Forschungsgemeinschaft (http://www.dfg.de; CO 1139/1-1), Fonds der Tsjetsjenske Industrie (http://www.vci.de/fonds) og Göttingen Senter for molekylærbiologi (GZMB). Forfatterne ønsker å anerkjenne Jörg Stülke for nyttige kommentarer og kritisk lesning av manuskriptet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| (NH4)2SO4 | Roth, Germany | 3746 | |
| Agar | Difco, USA | 214010 | |
| Ammonium ferric citrate (CAF) | Sigma-Aldrich, Germany | 9714 | |
| CaCl2 | Roth, Germany | 5239 | |
| Glucose | Applichem, Germany | A3617 | |
| Glycerol | Roth, Germany | 4043 | |
| K2HPO4•3H2O | Roth, Germany | 6878 | |
| KCl | Applichem, Germany | A3582 | |
| KH2PO4 | Roth, Germany | 3904 | |
| KOH | Roth, Germany | 6751 | |
| MgSO4•7H2O | Roth, Germany | P027 | |
| MnCl2 | Roth, Germany | T881 | |
| MnSO4•4H2O | Merck Millipore, Germany | 102786 | |
| NaCl | Roth, Germany | 9265 | |
| Nutrient broth | Roth, Germany | X929 | |
| Potassium glutamate | Applichem, Germany | A3712 | |
| Tryptone | Roth, Germany | 8952 | |
| Tryptophan | Applichem, Germany | A3445 | |
| Yeast extract | Roth, Germany | 2363 | |
| 1.5 ml Reaction tubes | Sarstedt, Germany | 72,690,001 | |
| 2.0 ml Reaction tubes | Sarstedt, Germany | 72,691 | |
| 15 ml Plastic tubes with screw cap | Sarstedt, Germany | 62,554,001 | |
| Petri dishes | Sarstedt, Germany | 82.1473 | |
| 1.5 ml Polystyrene cuvettes | Sarstedt, Germany | 67,742 | |
| 15 ml Glass culture tubes | Brand, Germany | 7790 22 | |
| 100 ml Shake flasks with aluminium caps | Brand, Germany | 928 24 | |
| Sterile 10 ml glass pipettes | Brand, Germany | 278 23 | |
| Incubator (28 and 37 °C) | New Brunswick | M1282-0012 | |
| Standard pipette set (2-20 μl, 10-100 μl, 100-1,000 μl) | Eppendorf, Germany | 4910 000.034, 4910 000.042, | |
| Table top centrifuge for 1.5 and 2 ml reaction tubes | Thermo Scientific, Heraeus Fresco 21, Germany | 75002425 | |
| Table top centrifuge for 15 ml plastic tubes | Heraeus Biofuge Primo R, Germany | 75005440 | |
| Standard spectrophotometer | Amersham Biosciences Ultrospec 2100 pro, Germany | 80-2112-21 | |
| Stereofluorescence microscope | Zeiss SteREO Lumar V12, Germany | 495008-0009-000 | |
| Freezer (-20 and -80 °C) | - | - | |
| Fridge (4 °C) | - | - | |
| Autoclave | Zirbus, LTA 2x3x4, Germany | - | |
| pH meter | pH-meter 766, Calimatic, Knick, Germany | 766 | |
| Vortex | Vortex 3, IKA, Germany | 3340000 | |
| Balance | CP2202S, Sartorius, Germany | replaced by | |
| Black pen (permanent marker) | Staedler, Germany | 317-9 | |
| Powerpoint program | Microsoft, USA | - | |
| Office Excel program | Microsoft, USA | - | Program for data processing |
| Adobe Photoshop CS5 | Adobe, USA | replaced by CS6, download | Computer program for image processing |
| Computer | PC or Mac | - | |
| ZEN pro 2011 software for the stereofluorescence microscope | Zeiss, Germany | 410135 1002 110 | AxioCam MRc Rev. Obtained through Zeiss |
| Specific solution recipes | |||
| SP Medium | |||
| 8 g Nutrient broth | |||
| 0.25 mg MgSO4•7H2O | |||
| 1 g KCl | |||
| 15 g agar for solid SP medium | if required | ||
| add 1 L with H2O | autoclave for 20 min at 121 °C | ||
| 1 ml CaCl2 (0.5 M), sterilized by filtration | |||
| 1 ml MnCl2 (10 mM), sterilized by filtration | |||
| 2 ml ammonium ferric citrate (CAF, 2.2 mg/ml), sterilized by filtration | |||
| LB Medium | |||
| 10 g Tryptone | |||
| 5 g Yeast extract | |||
| 10 g NaCl | |||
| 15 g agar for solid LB medium | if required | ||
| add 1 L with H2O | autoclave for 20 min at 121 °C | ||
| C-Glc Minimal Medium | |||
| 200 ml 5 x C salts | |||
| 10 ml L-Tryptophan (5 mg/ml), sterilized by filtration | |||
| 10 ml ammonium ferric citrate (CAF, 2.2 mg/ml), sterilized by filtration | |||
| 10 ml III’ salts | |||
| 25 ml Glucose (20%) | autoclaved for 20 min at 121 °C | ||
| add 1 L with sterile H2O | |||
| CE-Glc Minimal Medium | |||
| 200 ml 5 x C salts | |||
| 10 ml L-Tryptophan (5 mg/ml), sterilized by filtration | |||
| 10 ml ammonium ferric citrate (CAF, 2.2 mg/ml), sterilized by filtration | |||
| 10 ml III’ salts | |||
| 20 ml Glutamate (40%) | |||
| 25 ml Glucose (20%), autoclaved for 20 min at 121 °C | |||
| add 1 L with sterile H2O | |||
| 5 x C salts | |||
| 20 g KH2PO4 | |||
| 80 g K2HPO4•3H2O | |||
| 16.5 g (NH4)2SO4 | |||
| add 1 L with sterile H2O | autoclave for 20 min at 121 °C | ||
| III’ salts | |||
| 0.232 g MnSO4•4H2O | |||
| 12.3 g MgSO4•7H2O | |||
| add 1 L with sterile H2O, autoclave for 20 min at 121 °C | |||
| 40% Glutamate solution | |||
| 200 g L-Glutamic acid | |||
| adjust the pH to 7.0 by adding approximately 80 g KOH | |||
| add 0.5 L with sterile H2O | autoclave for 20 min at 121 °C | ||
| 0.9% Saline (NaCl) Solution | |||
| add 1 L with sterile H2O | autoclave for 20 min at 121 °C | ||
| 50% Glycerol solution | |||
| 295 ml Glycerol (87%) | |||
| add 0.5 L with sterile H2O | autoclave for 20 min at 121 °C | ||
| Bacteria (All strains are based on the Bacillus subtilis strain 168) | |||
| Bacillus subtilis BP40 (rocG+ gudBCR amyE::PgudB-yfp) | Laboratory strain collection | ||
| Bacillus subtilis BP41 (rocG+ gudBCR amyE::PgudB-cfp) | |||
| Bacillus subtilis BP52 (rocG+ gudB+ amyE::PgudB-cfp) | |||
| Bacillus subtilis BP156 (rocG+ gudB+ amyE::PgudB-yfp) | |||
References
- Buescher, F. I., et al. Global network reorganization during dynamic adaptations of Bacillus subtilis metabolism. Science. 335, 1099-1103 (2012).
- Gunka, K., Stannek, L., Care, R. A., Commichau, F. M. Selection-driven accumulation of suppressor mutants in Bacillus subtilis: the apparent high mutation frequency of the cryptic gudB gene and the rapid clonal expansion of gudB+ suppressors are due to growth under selection. PLoS One. 8, (2013).
- Al Mamum, A. A. M., et al. Identity and function of a large gene network underlying mutagenic repair of DNA breaks. Science. 338, 1344-1348 (2012).
- Koeppel, A. F., Wertheim, J. O., Barone, L., Gentile, N., Krizanc, D., Cohan, F. M. Speedy speciation in a bacterial microcosm: new species can arise as frequently as adaptations within a species. ISME J. 7, 1080-1091 (2013).
- Maughan, H., Nicholson, W. L. Increased fitness and alteration of metabolic pathways during Bacillus subtilis evolution in the laboratory. Appl. Environ. Microbiol. 77, 4105-4118 (2011).
- Burkholder, P. R., Giles, N. H. Induced biochemical mutations in Bacillus subtilis. Am. J. Bot. 34, 345-348 (1947).
- McLoon, A. L., Guttenplan, S. B., Kearns, D. B., Kolter, R., Losick, R. Tracing the domestication of a biofilm-forming bacterium. J. Bacteriol. 193, 2027-2034 (2011).
- Zeigler, D. R., et al. The origins of 168, W23, and other Bacillus subtilis legacy strains. J. Bacteriol. 190, 6983-6995 (2008).
- Gunka, K., Tholen, S., Gerwig, J., Herzberg, C., Stülke, J., Commichau, F. M. A high-frequency mutation in Bacillus subtilis: requirements for the decryptification of the gudB glutamate dehydrogenase. 194, 1036-1044 (2012).
- Commichau, F. M., et al. Characterization of Bacillus subtilis mutants with carbon source-independent glutamate biosynthesis. J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 12, 106-113 (2007).
- Beckwith, J. Genetic suppressors and recovery of repressed biochemical memory. J. Biol. Chem. 284, 12585-12592 (2009).
- Gunka, K., Commichau, F. M. Control of glutamate homeostasis in Bacillus subtilis: a complex interplay between ammonium assimilation, glutamate biosynthesis and degradation. Mol. Microbiol. 85, 213-224 (2012).
- Yan, D. Protection of the glutamate pool concentrations in enteric bacteria. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 9475-9480 (2007).
- Belitsky, B. R., Sonenshein, A. L. Role and regulation of Bacillus subtilis glutamate dehydrogenase genes. J. Bacteriol. 180, 6298-6305 (1998).
- Commichau, F. M., Herzberg, C., Tripal, P., Valerius, O., Stülke, J. A regulatory protein-protein interaction governs glutamate biosynthesis in Bacillus subtilis: the glutamate dehydrogenase RocG moonlights in controlling the transcription factor GltC. Mol. Microbiol. 65, 642-654 (2007).
- Gordo, I., Perfeito, L., Sousa, A. Fitness effects of mutations in bacteria. J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 21, 20-35 (2011).
- Rabatinová, A., et al. The δ subunit of RNA polymerase is required for rapid changes in gene expression and competitive fitness of the cell. J. Bacteriol. 195, 2603-2611 (2013).
- Capra, E. J., Perchuk, B. S., Skerker, J. M., Laub, M. T. Adaptive mutations that prevent crosstalk enable the expansion of paralogous signalling protein families. Cell. 150, 222-232 (2012).
- García-Betancur, J. C., Yepes, A., Schneider, J., Lopez, D. Single-cell analysis of Bacillus subtilis biofilms using fluorescence microscopy and flow cytometry. J. Vis. Exp. (15), (2012).
