Summary
Les bactéries peuvent accumuler des mutations néfastes ou bénéfiques au cours de leur vie. Dans une population de cellules, les individus qui ont accumulé des mutations bénéfiques peuvent rapidement surpasser leurs semblables. Ici, nous présentons une procédure simple pour visualiser la compétition intraspécifique dans une population de cellules bactériennes au fil du temps en utilisant des individus marqués par fluorescence.
Abstract
De nombreux micro-organismes tels que les bactéries prolifèrent extrêmement rapidement et les populations peuvent atteindre des densités cellulaires élevées. De petites fractions de cellules dans une population ont toujours accumulé des mutations qui sont préjudiciables ou bénéfiques pour la cellule. Si l’effet de valeur adaptative d’une mutation procure à la sous-population un fort avantage de croissance sélective, les individus de cette sous-population peuvent rapidement supprèter et même éliminer complètement leurs compagnons immédiats. Ainsi, de petits changements génétiques et l’accumulation pilotée par la sélection de cellules qui ont acquis des mutations bénéfiques peuvent conduire à un déplacement complet du génotype d’une population cellulaire. Nous présentons ici une procédure pour surveiller l’expansion clonale rapide et l’élimination des mutations bénéfiques et néfastes, respectivement, dans une population de cellules bactériennes au fil du temps par cocultivation d’individus marqués par fluorescence de la bactérie modèle Gram-positive Bacillus subtilis. La méthode est facile à réaliser et très illustrative pour montrer la compétition intraspéciféenne entre les individus dans une population cellulaire bactérienne.
Introduction
Les bactéries du sol sont généralement dotées de réseaux de régulation flexibles et de vastes capacités métaboliques. Les deux caractéristiques permettent aux cellules d’ajuster leurs voies cataboliques et anaboliques pour rivaliser avec leurs semblables et d’autres micro-organismes pour les nutriments, qui sont disponibles dans une niche écologique donnée1. Cependant, si les bactéries sont incapables de s’adapter à leur environnement, d’autres mécanismes peuvent expliquer la survie d’une espèce. En effet, comme de nombreuses bactéries prolifèrent rapidement et que les populations peuvent atteindre des densités cellulaires élevées, les sous-populations peuvent avoir spontanément accumulé des mutations bénéfiques qui procurent aux cellules un avantage de croissance sélective et augmentent donc leur aptitude. De plus, les points chauds mutationnels et la mutagenèse adaptative induite par le stress peuvent faciliter l’évolution d’une bactérie mal adaptée2,3. Ainsi, l’accumulation de mutations et la croissance sous sélection continue est à l’origine de l’énorme diversité microbienne, même au sein d’un même genre4,5. Comme dans la nature, la mise en forme des génomes bactériens se produit également en laboratoire en raison de la culture continue sous sélection. Ceci est illustré par la domestication de la bactérie Gram-positive B. subtilis, qui est utilisée dans le monde entier dans la recherche fondamentale et dans l’industrie. Dans les années 1940, B. subtilis a été traité avec des rayons X dommageables pour l’ADN, suivi d’une culture dans une condition de croissance spécifique6. Les mutations qui se sont accumulées dans les bactéries lors de leur domestication expliquent la perte de nombreuses caractéristiques de croissance, c’est-à-dire que la souche de laboratoire B. subtilis 168 a perdu la capacité de former des colonies complexes7,8.
De nos jours, pour les bactéries modèles les mieux étudiées Escherichia coli et B. subtilis,une variété d’outils puissants est disponible pour manipuler génétiquement leurs génomes afin de répondre à des questions scientifiques spécifiques. Parfois, l’inactivation d’un gène d’intérêt provoque un grave défaut de croissance, qui est alors clairement visible sur le milieu de croissance standard9. En revanche, les mutations qui provoquent un défaut de croissance faible et n’affectent donc que légèrement la forme physique de la souche sont souvent ignorées. Cependant, dans les deux cas, l’incubation et le passaging prolongés des souches mutantes pendant plusieurs générations entraînent généralement l’accumulation de mutants suppresseurs qui ont restauré le phénotype de la souche parente2,9. La caractérisation des mutants suppresseurs et l’identification des mutations qui ont restauré le défaut de croissance de la souche mutante mère est une approche très utile qui permet d’élucider des processus cellulaires importants et souvent nouveaux10,11.
Nous nous intéressons au contrôle de l’homéostasie du glutamate chez B. subtilis12. Semblable à E. coli, B. subtilis répond à la perturbation de l’homéostasie du glutamate(c’est-à-direle blocage dans la dégradation du glutamate2)par l’accumulation de mutants suppresseurs. Les changements genomic de ces mutants suppresseurs qui ont été acquis par mutation spontanée ont été montrés pour reconstituer rapidement l’homéostasie de glutamate9,13. Par conséquent, il n’est pas surprenant que l’adaptation de B. subtilis à une condition de croissance spécifique lors de la domestication de la bactérie se reflète dans la synthèse enzymatique et dans les activités enzymatiques évoluées, qui sont impliquées dans le métabolisme du glutamate12. Il a été suggéré que le manque de glutamate exogène dans le milieu de croissance pendant le processus de domestication ait été la force motrice de l’émergence et de la fixation du gène cryptique de la glutamate déshydrogénase (GDH) gudBCR dans la souche de laboratoire 1682,14. Cette hypothèse est soutenue par notre observation que la quantité réduite d’activité de GDH dans la souche de laboratoire fournit aux bactéries un avantage de croissance sélective quand le glutamate exogène est rare2. De plus, la culture d’une souche de B. subtilis, synthétisant le GDH GudB, en l’absence de glutamate exogène entraîne l’accumulation de mutants suppresseurs qui ont inactivé le gène gudB 2. De toute évidence, la présence d’un GDH cataboliquement actif est désavantageuse pour la cellule car le glutamate produit de manière endogène qui pourrait autrement être utilisé pour l’anabolisme est dégradé en ammonium et en 2-oxoglutarate (Figure 1). En revanche, lorsque le glutamate est fourni par le milieu, une souche de B. subtilis équipée d’une activité GDH de haut niveau a un avantage de croissance sélective par rapport à une souche qui ne synthétise qu’un seul GDH fonctionnel. Il est raisonnable de supposer que l’activité GDH de haut niveau permet aux bactéries d’utiliser le glutamate comme deuxième source de carbone en plus des autres sources de carbone fournies par le milieu2 (voir figure 1). Ainsi, l’activité GDH affecte fortement la forme physique des bactéries, en fonction de la disponibilité du glutamate exogène.
Nous présentons ici une méthode très illustrative pour surveiller et visualiser la concurrence intraspécifiques entre deux souches de B. subtilis qui diffèrent par un seul locus sur le chromosome (Figure 2). Les deux souches ont été étiquetées avec les gènes yfp et cfp codant pour les fluorophores YFP et CFP, et cocultivées dans différentes conditions nutritionnelles. En prélevant des échantillons au fil du temps et en plaquant des dilutions appropriées sur des plaques de gélose, les survivants de chacune des cultures ont pu être facilement surveillés à l’aide d’un microscope à fluorescence stéréo commun. Le procédé décrit en ce document est facile à exécuter et approprié pour visualiser l’expansion et l’élimination clonales rapides des mutations salutaires et préjudiciables, respectivement, dans une population de cellules au fil du temps.
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Protocol
1. Préparation des plaques de gélose, des milieux de culture, des cryostocks et des précultures
- Préparer les milieux de croissance et les réactifs requis (voir le tableau des matériaux et des réactifs).
- Stries les souches de B. subtilis ( par exemple. BP40 (rocG+ gudBCR amyE::PgudB-yfp) et BP52 (rocG+ gudB+ amyE::PgudB-cfp) exprimant respectivement un et deux GDH actifs)2 qui seront utilisés dans l’expérience de compétition sur des plaques de gélose moyenne SP pour obtenir des colonies uniques. Incuber les plaques pendant la nuit à 37 °C.
- Prendre des colonies simples et inoculer des tubes de culture stériles contenant 4 ml de milieu liquide LB. Cultiver les bactéries pendant la nuit à 28 °C et 220 tr/min.
- Cultiver des cultures pendant la nuit à 28 °C pour éviter que les cellules ne se lysent ou ne se sporculent.
- Mesurer la densité optique des cultures à une longueur d’onde de 600 nm (DO600)à l’aide d’un spectrophotomètre étalon.
- Si les cultures ont atteint une DO600 de 2,0, mélanger 0,75 ml des cultures avec 0,75 ml d’une solution stérile de glycérol à 50 % dans des tubes réactionnaires de 1,5 ml. La DOfinale 600 doit être de 1,0 pour obtenir des cryostocks contenant environ 108 cellules/ml.
- Conserver les tubes à -80 °C.
- Faire trois précultures de chaque souche étiquetée avec les gènes cfp et yfp codant pour les gènes fluorophores. Inoculer les précultures (tubes de culture stériles contenant 4 ml de milieu liquide LB) avec des cellules de 1 μl provenant de cryostocks de -80 °C. Incuber les cultures pendant la nuit à 28 °C et 220 rpm.
2. Cocultivation des bactéries, prélèvement d’échantillons et entreposage des échantillons
- Préparer fraîchement 100 ml de C-Glc et de milieu minimal CE-Glc (voir tableau des réactifs et des matériaux) et transférer 20 ml de chaque milieu dans des flacons stériles de secouer de 100 ml.
- Prenez 0,1 ml des précultures qui ont été cultivées pendant la nuit, diluez-les avec 0,9 ml de milieu LB dans une cuvette de 1,5 ml, et déterminez la DO600.
- Pour l’expérience de compétition, prenez les précultures des différentes souches qui ont une DO600 similaire entre 1,0 et 1,5.
- Pour obtenir des populations cellulaires mixtes, diluer les cellules des précultures qui avaient la DO600 appropriée à une DO600 de 0,05 dans 20 ml de milieu minimal C-Glc et CE-Glc complété dans des flacons de secouage de 100 ml. Pour l’expérience de compétition, les deux souches doivent être mélangées dans un rapport de 1:1.
- Prélever 10 ml d’échantillons dans les flacons, les transférer dans des tubes en plastique de 15 ml, récolter les cellules par centrifugation pendant 10 min à 4 000 x g dans une centrifugeuse de table standard et jeter le surnageant.
- Ressusciter les cellules dans 0,5 ml de milieu LB frais et transférer les cellules dans une tasse de réaction stérile de 1,5 ml. Ajouter 0,5 ml de glycérol stérile à 50 %, mélanger la suspension par vortexage rigoureux et conserver les échantillons dans un congélateur à -80 °C jusqu’à un traitement ultérieur.
- Incuber les cellules laissées dans les ballons de secouage jusqu’à 24 heures à 37 °C et 220 tr/min. Gardez les flacons de secouer dans l’obscurité pour éviter le photo blanchiment des fluorophores.
- Prendre d’autres échantillons de 0,1 ml après 7 heures et 24 heures de croissance. Mesurer et noter la DO600 des dilutions 1:10 (en milieu minimal C-Glc ou CE-Glc) des échantillons.
- Prenez la quantité appropriée de cellules de chaque culture pour faire des cryostocks qui ont une DO600 de 1.0. Conserver les échantillons à -80 °C jusqu’à un traitement ultérieur.
3. Traitement des échantillons, placage et incubation pour les analyses quantitatives
- Après avoir prélevé tous les échantillons, décongelez les cryostocks et diluez les cellules dans une solution saline à 0,9% (voir tableau des réactifs et des matériaux) jusqu’à10-3.
- Plaquer 0,1 ml des10-3 dilutions sur des plaques de gélose moyenne SP et répartir les cellules à l’aide de pipettes en verre stérile.
- Incuber les plaques pendant la nuit à 37 °C dans l’obscurité jusqu’à ce que des colonies simples apparaissent.
4. Comptage des survivants par microscopie à fluorescence stéréo pour l’analyse quantitative
- Divisez le fond de la plaque de gélose avec un stylo noir en quatre parties pour une meilleure orientation tout en comptant les survivants sous le microscope à fluorescence stéréoscopique.
- Placez la plaque à l’envers sous le microscope et ez les colonies au point à l’aide de la source de lumière froide.
- Une fois que les colonies sont au point, passez au filtre approprié pour cfp pour visualiser les cellules survivantes de la souche marqué cfp. Comptez les survivants de cette souche en étiquetant les colonies avec un stylo et notez le nombre.
- Retirez les étiquettes avec de l’éthanol et passez au filtre YFP défini pour visualiser les cellules survivantes de la souche étiquetée yfp. Comptez à nouveau les survivants en étiquetant les colonies avec un stylo et notez le nombre.
5. Traitement des échantillons et microscopie pour les analyses semi-quantitatives
- Pour des illustrations, spot 10 μl de la dilution10-4 (environ 100 cellules) de l’étape 3.1 sur une plaque de gélose SP (voir figure 3).
- Incuber les plaques pendant la nuit à 37 °C dans l’obscurité jusqu’à ce que des colonies simples apparaissent.
- Placez la boîte de Pétri sans couvercle sous le microscope et ressettez la tache à l’aide de la source de lumière froide.
- Prenez des photos des spots pour des figures illustratives. Choisissez un temps d’exposition approprié pour prendre les photos des colonies avec la source de lumière froide.
- Sans déplacer la plaque, passez à l’ensemble de filtres CFP, ajustez le temps d’exposition et prenez une photo. Faites de même avec le filtre YFP défini et enregistrez les images pour des analyses plus approfondies.
6. Analyse des données
- Utilisez un logiciel tel qu’Excel pour les analyses de données quantitatives. En fonction des colonies comptées, calculer le pourcentage de colonies jaunes et bleues par rapport au nombre total de colonies, qui sont fixées à 100 %.
- Utilisez les nombres calculés pour créer un diagramme à barres empilées (voir Figure 4 et Figure 5). Utilisez un programme de traitement d’image tel qu’Adobe Photoshop pour construire des images fusionnées des images prises à partir des différents endroits. Alternativement, le logiciel disponible gratuitement ImageJ, téléchargeable à partir de http://rsbweb.nih.gov/ij/ peut être utilisé pour le traitement d’image.
- Ouvrez les photos à partir d’un emplacement qui ont été prises avec le jeu de filtres CFP et le jeu de filtres YFP. Optimisez le contraste et la luminosité pour réduire toute fluorescence d’arrière-plan à partir du support.
- Accédez à l’une des images et sélectionnez tout. Copiez l’image et collez-la sur l’autre image.
- Utilisez la fonction « dodge couleur » pour fusionner les images ou superposez les images fluorescentes à l’aide de l’onglet canaux. Des images fusionnées des colonies de différents milieux et de différents points temporels représentent la croissance des différentes souches au sein de la culture liquide.
7. Conseils spécifiques: Expérience de commutation de colorant et cocultivation de souches isogéniques étiquetées avec cfp et yfp
L’expression de l’un ou l’autre des deux gènes codant pour les fluorophores chez B. subtilis pourrait influencer la condition physique et donc le taux de croissance des bactéries. Par conséquent, il est recommandé d’effectuer les expériences suivantes afin d’exclure que l’élimination d’une souche concurrente de la population cellulaire pendant la culture soit simplement due à un effet négatif du fluorophore:
- Répétez l’expérience entière et cocultivate inversement marqué souches(par exemple, la souche antérieure marqué cfpest maintenant étiquetée avec le gène yfp et vice versa). Bien qu’inverses, les résultats obtenus doivent être comparables à l’observation précédente selon laquelle une souche a un avantage de croissance sélective par rapport à l’autre souche.
- Répétez l’ensemble de l’expérience et cocultivate souches isogéniques étiquetées avec yfp et cfp (par exemple BP40 (rocG+ gudBCR amyE: :PgudB-yfp) et BP41 (rocG+ gudBCR amyE: :PgudB-cfp)). Estimer l’effet négatif de l’un ou l’autre des deux fluorophores sur la valeur adaptative de la bactérie en suivant la composition de la population cellulaire au fil du temps.
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Representative Results
La méthode décrite ici a été appliquée avec succès pour visualiser la compétition intraspécifique dans une population cellulaire constituée de souches de B. subtilis qui ont été marqués avec les gènes cfp et yfp codant pour les fluorophores CFP et YFP, respectivement. Comme le montre la figure 3,la méthode peut être utilisée pour visualiser la concurrence intraspécifeur d’une manière très illustrative. En repérant les échantillons sur de petites zones, la composition clonale de la population cellulaire a été rendue visible en un coup d’œil. Bien qu’elle ne convienne pas aux analyses quantitatives, cette approche est utile pour estimer grossièrement l’effet de différents paramètres de croissance(c.-à-d.source d’azote) sur le développement d’une population cellulaire qui contenait initialement les deux souches en quantités égales(figure 3). De plus, dans une approche à petite échelle, l’aptitude de différentes souches de B. subtilis cultivées dans les mêmes conditions de croissance peut être testée à l’aide d’une seule plaque de gélose. Pour les analyses quantitatives, il est recommandé de propager les échantillons sur toute la surface d’une plaque de gélose. Cela empêchera la superposition des colonies et permettra ainsi l’identification et le comptage distincts des colonies qui ont émergé de cellules individuelles. En plaquant des dilutions appropriées sur des plaques de gélose, la composition clonale d’une population cellulaire au fil du temps peut être déterminée avec précision simplement en comptant les colonies fluorescentes jaunes et bleues (voir figure 4). Comme nous l’avons précédemment rapporté, l’activité de GDH affecte fortement la forme physique de B. subtilis selon la disponibilité du glutamate exogène2. De toute évidence, en l’absence de glutamate exogène, l’activité GDH de haut niveau est désavantageuse pour les bactéries car les enzymes RocG et GudB dégradent le glutamate nécessaire dans l’anabolisme (voir figure 1 et figure 4A). En revanche, s’il est fourni aux bactéries, le glutamate peut servir de donneur de groupe aminé dans les réactions de transamination. De plus, le glutamate peut être introduit dans le métabolisme du carbone et utilisé comme source d’énergie en raison de la présence des GDHs cataboliquement actifs RocG et GudB(figure 1 et figure 4B). Comme le montrent les figures 4C et 4D,des résultats similaires ont été obtenus dans une expérience de changement de colorant. Encore une fois, des bactéries équipées de l’activité de haut niveau de GDH ont été surpassées par des cellules avec l’activité réduite de GDH dans les milieux de croissance manquant de glutamate. En revanche, des bactéries synthétisant seulement un GDH actif ont été éliminées de la culture quand le milieu a été complété avec du glutamate. Comme le montrent les figures 5A et 5B,la composition initiale de la population cellulaire mixte est demeurée presque constante au fil du temps. Ainsi, dans l’expérience de compétition, l’élimination de l’une ou l’autre des deux souches qui étaient équipées de quantités différentes d’activité GDH n’était pas due à un défaut de croissance causé par les fluorophores (voir figure 4). Pris ensemble, l’utilisation de fluorophores est un outil puissant pour surveiller la concurrence intraspécifique dans une population cellulaire bactérienne.
Figure 1. Le lien entre le métabolisme du carbone et de l’azote chez B. subtilis. Lorsque le glutamate n’est pas fourni par le milieu, le principal donneur d’aminé nécessaire à l’anabolisme est synthétisé à partir d’ammonium et de 2-oxoglutarate par l’action combinée de la glutamine synthétase (GS) et de la glutamate synthase (GOGAT). En revanche, en présence de glutamate exogène, les GDHs RocG et/ou GudB cataboliquement actifs peuvent dégrader le glutamate en ammonium et en 2-oxoglutarate, qui sert alors de source de carbone.
Figure 2. Flux de travail expérimental. La souche 1 (étiquetée avec yfp)et la souche 2 (étiquetée avec cfp)diffèrent dans un locus l’une de l’autre. Dans l’exemple présenté ici, nous avons comparé l’effet du glutamate exogène (effecteur) sur le décalage génotypique de la population cellulaire qui contenait initialement 50% de rocG+ gudB+ (codant deux GDHs actifs) et 50% de rocG+ gudBCR (codant pour un GDH actif) cellules. Cliquez ici pour agrandir l’image.
Figure 3. Approche semi-quantitative pour visualiser la concurrence intraspécificole de manière descriptive (voir la section 5). Avant la cocultivation (0 heure), et après 7 heures et 24 heures des dilutions de croissance (10-4)des cellules ont été repérées sur des plaques de gélose de SP. Les cellules survivantes qui ont formé des colonies après 12 heures d’incubation à 37 °C ont été identifiées par microscopie à fluorescence stéréo. Temps d’exposition, 0,6 s; barre d’échelle, 1 mm. Ce chiffre a été modifié à partir de Gunka et al. 20132.
Figure 4. Quantification de la concurrence intraspécifétion. Après dilution de l’échantillon et propagation des cellules (voir étapes 3.1 à 3.3) sur milieu SP, les plaques ont été incubées pendant une nuit à 37 °C. Les colonies jaunes et bleues ont été quantifiées comme décrit dans les Protocoles 4 et 6. Les barres d’erreur noires représentent des écarts types pour au moins quatre expériences répétées indépendamment. Chaque plaque de gélose contenait au moins 100 colonies dénombrables. (A) En l’absence de glutamate exogène, la souche BP40 (jaune) de B. subtilis est équipée d’une seule souche fonctionnelle de GDH outcompetes BP54 (bleu), qui synthétise à la fois les enzymes dégradant le glutamate, RocG et GudB. (B) En revanche, la synthèse de deux GDHs fonctionnels est avantageuse pour les bactéries lorsque du glutamate exogène est disponible car en plus du glucose, le glutamate est utilisé comme source de carbone. Comme indiqué en(C)et(D),des résultats comparables ont été obtenus dans une expérience de commutation de colorant. Ce chiffre a été modifié à partir de Gunka et al. 20132. Cliquez ici pour agrandir l’image.
Figure 5. Expérience de contrôle pour évaluer l’effet des gènes cfp et yfp codant pour les fluorophores sur la condition physique des bactéries. Des populations mixtes des souches isogéniques BP40 (rocG+ gudBCR amyE::yfp) et BP41 (rocG+ gudBCR amyE::cfp) ou BP52 (rocG+ gudB+ amyE::cfp) et BP156 (rocG+ gudB+ amyE::yfp) ont été cultivées en l’absence (A) et en présence (B) de glutamate exogène. Les cellules survivantes ont été comptées comme décrit dans les protocoles 1-4 et 6, respectivement. Les barres représentent des écarts types pour au moins quatre expériences répétées indépendamment. Ce chiffre a été modifié à partir de Gunka et al. 20132. Cliquez ici pour agrandir l’image.
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Discussion
Plusieurs méthodes ont été développées pour analyser l’aptitude compétitive des bactéries16. Dans de nombreux cas, les bactéries ont été étiquetées avec différentes cassettes de résistance aux antibiotiques17. Semblable à notre approche, l’étiquetage des cellules avec des cassettes de résistance aux antibiotiques permet l’évaluation de l’aptitude compétitive des bactéries lors de la cocultivation dans des conditions de croissance définies. De plus, cette méthode peut être utilisée pour déterminer l’aptitude compétitive des cellules qui diffèrent les unes des autres dans un locus spécifique sur le chromosome17. Cependant, il existe certains inconvénients à utiliser des cassettes de résistance aux antibiotiques pour surveiller la condition physique compétitive. Comme l’expression des gènes de résistance est principalement motivée par des promoteurs ayant une force inégale, les enzymes conférant une résistance aux antibiotiques sont probablement produites à différents niveaux. Par conséquent, les faibles effets de la condition physique peuvent ne pas être détectables avec cette approche. Dans notre approche, les deux gènes fluorophores ont été intégrés avec le même marqueur de sélection et leur expression est pilotée par les mêmes promoteurs2. Un autre inconvénient de surveiller l’aptitude compétitive avec des cassettes de résistance aux antibiotiques pourrait être que l’approche est plus laborieuse car deux types de plaques de gélose complétées par les antibiotiques appropriés sont nécessaires pour le comptage des colonies. Alternativement, l’adéquation des bactéries peut être déterminée en surveillant simplement le taux de croissance et en calculant un soi-disant indice de formephysique 16. Évidemment, c’est l’approche la plus précise parce que les bactéries sont cultivées individuellement et les composés toxiques qui pourraient être produits par une souche avec un certain génotype n’affecteront pas la croissance de la souche concurrente. De plus, il n’est pas nécessaire d’utiliser des antibiotiques qui pourraient affecter la croissance des cellules. Cependant, les deux approches ne sont pas très illustratives, car les chiffres décrivant la condition physique compétitive ne peuvent être présentés que de manière plutôt neutre.
L’utilisation de gènes codant pour les fluorophores pour surveiller et quantifier la concurrence intraspécifique présente plusieurs avantages par rapport à d’autres méthodes. Si les deux souches ont intégré les gènes codant pour les fluorophores par double recombinaison homologue dans le chromosome, il n’est pas nécessaire d’utiliser des antibiotiques dans l’une des étapes de culture. Par conséquent, les échantillons prélevés sur la culture pendant la culture peuvent être analysés sur le même milieu de croissance et les deux souches sont capables de croître. Cette approche permet de visualiser la concurrence intraspécifiste d’une manière très illustrative. De plus, en utilisant cette approche semi-quantitative, plusieurs conditions de croissance peuvent être testées en même temps et de nombreuses souches différentes peuvent être comparées en parallèle. Enfin, il n’est pas nécessaire de fixer les échantillons sur des lames de microscope car les échantillons qui ont été prélevés dans la culture bactérienne lors de la cocultivation peuvent être stockés dans un congélateur18. Ainsi, tous les échantillons et répliques peuvent être analysés en même temps.
Deux étapes critiques de notre protocole doivent être mentionnées. Il est important de noter que les cryostocks doivent contenir des quantités égales de cellules dans la même phase de croissance de chaque souche concurrente. Une première disproportion des souches dans les cryostocks et par conséquent dans les flacons de secouage avant le début de l’expérience aura un fort impact sur le résultat de l’expérience de compétition. Par conséquent, il est sage de vérifier la composition des cryostocks avant l’expérience. De plus, une quantité appropriée de cellules doit être propagée uniformément sur la plaque. Sinon, les colonies émergées sont trop proches les unes des autres et une détermination précise des cellules survivantes deviendra difficile.
L’approche à base de fluorophores présente également certaines limites et certains inconvénients. La cocultivation dans un lecteur de plaques multi-puits et la détection simultanée des signaux CFP et YFP ne sont pas possibles car les spectres d’excitation et d’émission des fluorophores sont trop proches les uns des autres. Cependant, ce problème technique pourrait être contourné en utilisant différentes protéines fluorescentes, telles que celles émettant de la lumière verte et rouge, de manière optimale sur la base du même échafaudage protéique. Un autre inconvénient de l’approche à base de fluorophores pourrait être que certaines mutations ne provoquent qu’un faible défaut de croissance des bactéries. Ainsi, si le défaut de croissance qui pourrait être provoqué par l’un ou l’autre des gènes de fluorophore-codage est plus fort que le défaut de croissance provoqué par une certaine mutation, l’approche basée sur fluorophore n’est pas appropriée pour analyser la concurrence intra-espèces. Par conséquent, avant de créer tout un ensemble de souches, il est recommandé d’étiqueter d’abord uniquement la souche parente avec les deux, cfp et yfp, et de cocultivater les souches. Les expériences de croissance révéleront à quel point les fluorophores affectent la condition physique des bactéries (voir les figures 5A et 5B).
À l’avenir, il sera intéressant de tester si l’approche basée sur les fluorophores pour surveiller la concurrence intraspécifique sera plus précise et moins laborieuse si les cellules survivantes sont comptées à l’aide de la cytométrie en flux. Récemment, la cytométrie de flux s’est révélée être un outil puissant pour analyser la composition des biofilms de B. subtilis 19. De plus, il pourrait être plus approprié d’analyser les effets de faible aptitude qui affectent l’aptitude compétitive des bactéries par cocultivation continue des bactéries étiquetées fluorophore dans un fermenteur. Contrairement aux flacons de secouage, cette approche permet de maintenir les conditions de croissance constantes et donc de surveiller la concurrence intraspécifique sur une longue période de temps.
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Disclosures
Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.
Acknowledgments
Les travaux dans le laboratoire des auteurs ont été soutenus par la Deutsche Forschungsgemeinschaft (http://www.dfg.de; CO 1139/1-1), le Fonds der Chemischen Industrie (http://www.vci.de/fonds) et le Centre de biologie moléculaire de Göttingen (GZMB). Les auteurs tiennent à remercier Jörg Stülke pour ses commentaires utiles et sa lecture critique du manuscrit.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| (NH4)2SO4 | Roth, Germany | 3746 | |
| Agar | Difco, USA | 214010 | |
| Ammonium ferric citrate (CAF) | Sigma-Aldrich, Germany | 9714 | |
| CaCl2 | Roth, Germany | 5239 | |
| Glucose | Applichem, Germany | A3617 | |
| Glycerol | Roth, Germany | 4043 | |
| K2HPO4•3H2O | Roth, Germany | 6878 | |
| KCl | Applichem, Germany | A3582 | |
| KH2PO4 | Roth, Germany | 3904 | |
| KOH | Roth, Germany | 6751 | |
| MgSO4•7H2O | Roth, Germany | P027 | |
| MnCl2 | Roth, Germany | T881 | |
| MnSO4•4H2O | Merck Millipore, Germany | 102786 | |
| NaCl | Roth, Germany | 9265 | |
| Nutrient broth | Roth, Germany | X929 | |
| Potassium glutamate | Applichem, Germany | A3712 | |
| Tryptone | Roth, Germany | 8952 | |
| Tryptophan | Applichem, Germany | A3445 | |
| Yeast extract | Roth, Germany | 2363 | |
| 1.5 ml Reaction tubes | Sarstedt, Germany | 72,690,001 | |
| 2.0 ml Reaction tubes | Sarstedt, Germany | 72,691 | |
| 15 ml Plastic tubes with screw cap | Sarstedt, Germany | 62,554,001 | |
| Petri dishes | Sarstedt, Germany | 82.1473 | |
| 1.5 ml Polystyrene cuvettes | Sarstedt, Germany | 67,742 | |
| 15 ml Glass culture tubes | Brand, Germany | 7790 22 | |
| 100 ml Shake flasks with aluminium caps | Brand, Germany | 928 24 | |
| Sterile 10 ml glass pipettes | Brand, Germany | 278 23 | |
| Incubator (28 and 37 °C) | New Brunswick | M1282-0012 | |
| Standard pipette set (2-20 μl, 10-100 μl, 100-1,000 μl) | Eppendorf, Germany | 4910 000.034, 4910 000.042, | |
| Table top centrifuge for 1.5 and 2 ml reaction tubes | Thermo Scientific, Heraeus Fresco 21, Germany | 75002425 | |
| Table top centrifuge for 15 ml plastic tubes | Heraeus Biofuge Primo R, Germany | 75005440 | |
| Standard spectrophotometer | Amersham Biosciences Ultrospec 2100 pro, Germany | 80-2112-21 | |
| Stereofluorescence microscope | Zeiss SteREO Lumar V12, Germany | 495008-0009-000 | |
| Freezer (-20 and -80 °C) | - | - | |
| Fridge (4 °C) | - | - | |
| Autoclave | Zirbus, LTA 2x3x4, Germany | - | |
| pH meter | pH-meter 766, Calimatic, Knick, Germany | 766 | |
| Vortex | Vortex 3, IKA, Germany | 3340000 | |
| Balance | CP2202S, Sartorius, Germany | replaced by | |
| Black pen (permanent marker) | Staedler, Germany | 317-9 | |
| Powerpoint program | Microsoft, USA | - | |
| Office Excel program | Microsoft, USA | - | Program for data processing |
| Adobe Photoshop CS5 | Adobe, USA | replaced by CS6, download | Computer program for image processing |
| Computer | PC or Mac | - | |
| ZEN pro 2011 software for the stereofluorescence microscope | Zeiss, Germany | 410135 1002 110 | AxioCam MRc Rev. Obtained through Zeiss |
| Specific solution recipes | |||
| SP Medium | |||
| 8 g Nutrient broth | |||
| 0.25 mg MgSO4•7H2O | |||
| 1 g KCl | |||
| 15 g agar for solid SP medium | if required | ||
| add 1 L with H2O | autoclave for 20 min at 121 °C | ||
| 1 ml CaCl2 (0.5 M), sterilized by filtration | |||
| 1 ml MnCl2 (10 mM), sterilized by filtration | |||
| 2 ml ammonium ferric citrate (CAF, 2.2 mg/ml), sterilized by filtration | |||
| LB Medium | |||
| 10 g Tryptone | |||
| 5 g Yeast extract | |||
| 10 g NaCl | |||
| 15 g agar for solid LB medium | if required | ||
| add 1 L with H2O | autoclave for 20 min at 121 °C | ||
| C-Glc Minimal Medium | |||
| 200 ml 5 x C salts | |||
| 10 ml L-Tryptophan (5 mg/ml), sterilized by filtration | |||
| 10 ml ammonium ferric citrate (CAF, 2.2 mg/ml), sterilized by filtration | |||
| 10 ml III’ salts | |||
| 25 ml Glucose (20%) | autoclaved for 20 min at 121 °C | ||
| add 1 L with sterile H2O | |||
| CE-Glc Minimal Medium | |||
| 200 ml 5 x C salts | |||
| 10 ml L-Tryptophan (5 mg/ml), sterilized by filtration | |||
| 10 ml ammonium ferric citrate (CAF, 2.2 mg/ml), sterilized by filtration | |||
| 10 ml III’ salts | |||
| 20 ml Glutamate (40%) | |||
| 25 ml Glucose (20%), autoclaved for 20 min at 121 °C | |||
| add 1 L with sterile H2O | |||
| 5 x C salts | |||
| 20 g KH2PO4 | |||
| 80 g K2HPO4•3H2O | |||
| 16.5 g (NH4)2SO4 | |||
| add 1 L with sterile H2O | autoclave for 20 min at 121 °C | ||
| III’ salts | |||
| 0.232 g MnSO4•4H2O | |||
| 12.3 g MgSO4•7H2O | |||
| add 1 L with sterile H2O, autoclave for 20 min at 121 °C | |||
| 40% Glutamate solution | |||
| 200 g L-Glutamic acid | |||
| adjust the pH to 7.0 by adding approximately 80 g KOH | |||
| add 0.5 L with sterile H2O | autoclave for 20 min at 121 °C | ||
| 0.9% Saline (NaCl) Solution | |||
| add 1 L with sterile H2O | autoclave for 20 min at 121 °C | ||
| 50% Glycerol solution | |||
| 295 ml Glycerol (87%) | |||
| add 0.5 L with sterile H2O | autoclave for 20 min at 121 °C | ||
| Bacteria (All strains are based on the Bacillus subtilis strain 168) | |||
| Bacillus subtilis BP40 (rocG+ gudBCR amyE::PgudB-yfp) | Laboratory strain collection | ||
| Bacillus subtilis BP41 (rocG+ gudBCR amyE::PgudB-cfp) | |||
| Bacillus subtilis BP52 (rocG+ gudB+ amyE::PgudB-cfp) | |||
| Bacillus subtilis BP156 (rocG+ gudB+ amyE::PgudB-yfp) | |||
References
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