Summary
Las bacterias pueden acumular mutaciones perjudiciales o beneficiosas durante su vida. En una población de células, los individuos que han acumulado mutaciones beneficiosas pueden superar rápidamente a sus semejantes. Aquí presentamos un procedimiento simple para visualizar la competencia intraespecies en una población de células bacterianas a lo largo del tiempo utilizando individuos marcados fluorescentemente.
Abstract
Muchos microorganismos como las bacterias proliferan extremadamente rápido y las poblaciones pueden alcanzar altas densidades celulares. Pequeñas fracciones de células en una población siempre tienen mutaciones acumuladas que son perjudiciales o beneficiosas para la célula. Si el efecto de aptitud de una mutación proporciona a la subpoblación una fuerte ventaja de crecimiento selectivo, los individuos de esta subpoblación pueden superar rápidamente e incluso eliminar por completo a sus compañeros inmediatos. Así, los pequeños cambios genéticos y la acumulación selección-impulsada de células que han adquirido mutaciones beneficiosas pueden llevar a un cambio completo del genotipo de una población de la célula. Aquí presentamos un procedimiento para supervisar la rápida expansión clonal y la eliminación de mutaciones beneficiosas y perjudiciales, respectivamente, en una población celular bacteriana a lo largo del tiempo por cocultivación de individuos marcados fluorescentemente de la bacteria modelo Gram-positiva Bacillus subtilis. El método es fácil de realizar y muy ilustrativo para mostrar la competencia intraespecies entre los individuos en una población celular bacteriana.
Introduction
Las bacterias del suelo suelen estar dotadas de redes reguladoras flexibles y amplias capacidades metabólicas. Ambas características permiten a las células ajustar sus vías catabólicas y anabólicas para competir con sus compañeros y otros microorganismos por los nutrientes, que están disponibles en un nicho ecológico dado1. Sin embargo, si las bacterias son incapaces de adaptarse a su entorno, otros mecanismos pueden explicar la supervivencia de una especie. De hecho, como muchas bacterias proliferan rápidamente y las poblaciones pueden alcanzar altas densidades celulares, las subpoblaciones pueden haber acumulado espontáneamente mutaciones beneficiosas que proporcionan a las células una ventaja de crecimiento selectivo y, por lo tanto, aumentan su aptitud. Además, los puntos críticos mutacionales y la mutagénesis adaptativa inducida por el estrés pueden facilitar la evolución de una bacteria inadaptada2,3. Así, la acumulación de mutaciones y el crecimiento bajo selección continua es el origen de la enorme diversidad microbiana, incluso dentro del mismo género4,5. Al igual que en la naturaleza, la conformación de genomas bacterianos también ocurre en el laboratorio debido al cultivo continuo bajo selección. Esto se ejemplifica en la domesticación de la bacteria Gram-positiva B. subtilis, que se utiliza en todo el mundo en la investigación básica y en la industria. En la década de 1940, B. subtilis fue tratado con rayos X perjudiciales para el ADN, seguidos de un cultivo bajo una condición de crecimiento específica6. Las mutaciones que se han acumulado en las bacterias durante su domesticación explican la pérdida de muchas características de crecimiento, es decir, la cepa de laboratorio B. subtilis 168 perdió la capacidad de formar colonias complejas7,8.
Hoy en día, para las bacterias modelo mejor estudiadas Escherichia coli y B. subtilis,una variedad de herramientas poderosas está disponible para manipular genéticamente sus genomas con el fin de abordar cuestiones científicas específicas. A veces la inactivación de un gen de interés causa un defecto de crecimiento severo, que luego es claramente visible en el medio de crecimiento estándar9. Por el contrario, las mutaciones que causan un defecto de crecimiento débil y, por lo tanto, solo afectan ligeramente la aptitud de la cepa a menudo se ignoran. Sin embargo, en ambos casos la incubación prolongada y el paso de las cepas mutantes durante varias generaciones suelen dar lugar a la acumulación de mutantes supresores que han restaurado el fenotipo de la cepa madre2,9. La caracterización de mutantes supresores y la identificación de las mutaciones que han restaurado el defecto de crecimiento de la cepa mutante madre es un enfoque muy útil que permite la elucidación de procesos celulares importantes y a menudonovedosos 10,11.
Estamos interesados en el control de la homeostasis del glutamato en B. subtilis12. Similar a E. coli, B. subtilis responde a la perturbación de la homeostasis del glutamato(es decir,bloqueo en la degradación del glutamato2)por la acumulación de mutantes supresores. Se demostró que las alteraciones genómicas en estos mutantes supresores que fueron adquiridos por mutación espontánea restauran rápidamente la homeostasis del glutamato9,13. Por lo tanto, no es sorprendente que la adaptación de B. subtilis a una condición de crecimiento específica durante la domesticación de la bacteria se refleje en la síntesis enzimática y en las actividades enzimáticas evolucionadas, que están involucradas en el metabolismo del glutamato12. Se ha sugerido que la falta de glutamato exógeno en el medio de crecimiento durante el proceso de domesticación fue la fuerza impulsora para la aparición y fijación de la críptica glutamato deshidrogenasa (GDH) del gen GUDBCR en la cepa de laboratorio 1682,14. Esta hipótesis es apoyada por nuestra observación de que la cantidad reducida de actividad de GDH en la cepa de laboratorio proporciona a las bacterias una ventaja de crecimiento selectivo cuando el glutamato exógeno es escaso2. Por otra parte, el cultivo de una cepa de B. subtilis, sintetizando el GDH GudB, en ausencia de glutamato exógeno da lugar a la acumulación de mutantes supresores que han inactivado el gen gudB 2. Obviamente, la presencia de un GDH catabólicamente activo es desventajosa para la célula porque el glutamato producido endógenamente que de otra manera podría ser utilizado para el anabolismo se degrada a amonio y 2-oxoglutarato(Figura 1). Por el contrario, cuando el glutamato es proporcionado por el medio, una cepa de B. subtilis equipada con actividad GDH de alto nivel tiene una ventaja de crecimiento selectivo sobre una cepa que sintetiza solo un GDH funcional. Es razonable suponer que la actividad de GDH de alto nivel permite a las bacterias utilizar el glutamato como segunda fuente de carbono además de otras fuentes de carbono proporcionadas por el medio2 (ver Figura 1). Por lo tanto, la actividad de GDH afecta fuertemente la aptitud de las bacterias, dependiendo de la disponibilidad de glutamato exógeno.
Aquí presentamos un método muy ilustrativo para monitorear y visualizar la competencia intraespecípecíta entre dos cepas de B. subtilis que difieren en un solo lugar geométrico en el cromosoma(Figura 2). Las dos cepas fueron etiquetadas con los genes yfp y cfp que codifican los fluoróforos YFP y CFP, y cocultivadas bajo diferentes condiciones nutricionales. Mediante el muestreo a lo largo del tiempo y el enchapado de diluciones apropiadas en placas de agar, los sobrevivientes en cada uno de los cultivos podrían ser fácilmente monitoreados utilizando un microscopio de fluorescencia estéreo común. El procedimiento descrito en este papel es fácil de realizar y conveniente visualizar la extensión y la eliminación clónicas rápidas de mutaciones beneficiosas y perjudiciales, respectivamente, en una población de la célula en un cierto plazo.
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Protocol
1. Preparación de placas de agar, medios de cultivo, criostocks y precultivos
- Prepare los medios de crecimiento y los reactivos requeridos (ver tabla de materiales y reactivos).
- Raya las cepas de B. subtilis (por ejemplo. BP40 (rocG+ gudBCR amyE::PgudB-yfp) y BP52 (rocG+ gudB+ amyE::PgudB-cfp) expresando uno y dos GDHs activos, respectivamente)2 que se utilizarán en el experimento de competencia en placas de agar medio SP para obtener colonias individuales. Incubar las placas durante la noche a 37 °C.
- Tome colonias individuales e inoculte tubos de cultivo estériles que contengan 4 ml de medio líquido LB. Crecen las bacterias durante la noche a 28 °C y 220 rpm.
- Crecer cultivos nocturnos a 28 °C para evitar que las células lise o esporular.
- Mida la densidad óptica de los cultivos a una longitud de onda de 600 nm (OD600)utilizando un espectrofotómetro estándar.
- Si los cultivos han alcanzado un OD600 de 2,0, mezcle 0,75 ml de los cultivos con 0,75 ml de una solución estéril de glicerol al 50% en tubos de reacción de 1,5 ml. El ODfinal 600 debe ser 1.0 para obtener criostocks que contengan aproximadamente 108 células/ml.
- Guarde los tubos a -80 °C.
- Hacer tres precultivos de cada cepa etiquetados con los genes de fluoróforo de codificación cfp e yfp. Inocular los precultivos (tubos de cultivo estériles que contengan 4 ml de lb de medio líquido) con células de 1 μl de criostocks de -80 °C. Incubar los cultivos durante la noche a 28 °C y 220 rpm.
2. Cocultivación de bacterias, recolección de muestras y almacenamiento de muestras
- Preparar recién 100 ml de medio mínimo C-Glc y CE-Glc (ver tabla de reactivos y materiales), y transferir 20 ml de cada medio en matraces estériles de 100 ml.
- Tomar 0,1 ml de los precultivos que se cultivaron durante la noche, diluirlos con 0,9 ml lb medio en una cubeta de 1,5 ml, y determinar el OD600.
- Para el experimento de competición, tome aquellas preculturas de las diferentes cepas que tienen un OD600 similar entre 1.0-1.5.
- Para obtener poblaciones de células mixtas, diluir las células de los precultivos que tenían el OD600 adecuado a un OD600 de 0,05 en 20 ml C-Glc y CE-Glc medio mínimo complementado en matraces de agitación de 100 ml. Para el experimento de competición, las dos cepas deben mezclarse en una proporción de 1:1.
- Tome muestras de 10 ml de los frascos, transfiéralos a tubos de plástico de 15 ml, coseche las células por centrifugación durante 10 min a 4.000 x g en una centrífuga de mesa estándar y deseche el sobrenadante.
- Resuspend las células en 0.5 ml de medio lb fresco, y transferir las células a una taza de reacción estéril de 1.5 ml. Añadir 0,5 ml de glicerol estéril al 50%, mezclar la suspensión mediante un riguroso vórtice y almacenar las muestras en un congelador de -80 °C hasta su posterior tratamiento.
- Incubar las células que quedan en los frascos de agitación durante un máximo de 24 horas a 37 °C y 220 rpm. Mantenga los frascos de agitación en la oscuridad para evitar el blanqueamiento fotográfico de los fluoróforos.
- Tomar muestras adicionales de 0,1 ml después de 7 horas y 24 horas de crecimiento. Mida y observe el OD600 de diluciones 1:10 (en medio mínimo C-Glc o CE-Glc) de las muestras.
- Tome la cantidad apropiada de células de cada cultivo para hacer criostocks que tengan un OD600 de 1.0. Guarde las muestras a -80 °C hasta su posterior tratamiento.
3. Tratamiento de muestras, revestimiento e incubación para análisis cuantitativos
- Después de recoger todas las muestras, descongelar los criostocks, y diluir las células en una solución salina al 0,9% (ver tabla de reactivos y materiales) hasta 10-3.
- Placa 0.1 ml de las 10-3 diluciones en placas de agar medio SP y distribuir las células utilizando pipetas de vidrio estériles.
- Incubar las placas durante la noche a 37 °C en la oscuridad hasta que hayan aparecido colonias individuales.
4. Contar a los sobrevivientes por microscopía de fluorescencia estéreo para análisis cuantitativo
- Divida la parte inferior de la placa de agar con un bolígrafo negro en cuatro partes para una mejor orientación mientras se cuentan los sobrevivientes bajo el microscopio de fluorescencia estéreo.
- Coloque la placa boca abajo bajo el microscopio y enfoque las colonias usando la fuente de luz fría.
- Una vez que las colonias están en foco, cambie al conjunto de filtros apropiado para CFP para visualizar las células sobrevivientes de la cepa etiquetada como CFP. Cuente a los sobrevivientes de esta cepa etiquetando las colonias con un bolígrafo y anote el número.
- Retire las etiquetas con etanol y cambie al conjunto de filtros YFP para visualizar las células sobrevivientes de la cepa etiquetada con yfp. Cuente a los sobrevivientes nuevamente etiquetando las colonias con un bolígrafo y anote el número.
5. Tratamiento de muestras y microscopía para análisis semicuantitativos
- Para obtener cifras ilustrativas, spot 10 μl de la dilución10-4 (aproximadamente 100 células) del paso 3.1 en una placa de agar SP (ver Figura 3).
- Incubar las placas durante la noche a 37 °C en la oscuridad hasta que hayan aparecido colonias individuales.
- Coloque la placa de Petri sin tapa debajo del microscopio y enfoque el punto usando la fuente de luz fría.
- Tome fotos de las manchas para las figuras ilustrativas. Elija un tiempo de exposición apropiado para tomar las fotos de las colonias con la fuente de luz fría.
- Sin mover la placa, cambie al conjunto de filtros CFP, ajuste el tiempo de exposición y tome una foto. Haga lo mismo con el conjunto de filtros YFP y guarde las imágenes para análisis adicionales.
6. Análisis de datos
- Utilice software como Excel para los análisis de datos cuantitativos. Sobre la base de las colonias contadas, calcular el porcentaje de colonias amarillas y azules con respecto al número total de colonias, que se establecen en 100%.
- Utilice los números calculados para crear un diagrama de barras apiladas (consulte la figura 4 y la figura 5). Utilice un programa de procesamiento de imágenes como Adobe Photoshop para construir imágenes combinadas de las imágenes tomadas desde los diferentes puntos. Alternativamente, el software de libre acceso ImageJ, descargable desde http://rsbweb.nih.gov/ij/ se puede utilizar para el procesamiento de imágenes.
- Abra las imágenes desde un punto que se tomaron con el conjunto de filtros CFP y el conjunto de filtros YFP. Optimice el contraste y el brillo para reducir cualquier fluorescencia de fondo del medio.
- Vaya a una de las imágenes y seleccione todas. Copie la imagen y péguela en la otra imagen.
- Utilice la función "esquivar el color" para combinar las imágenes o superponer las imágenes fluorescentes utilizando la pestaña de canales. Los cuadros combinados de las colonias de diversos medios y de diversos puntos del tiempo representan el crecimiento de las diversas tensiones dentro de la cultura líquida.
7. Consejos específicos: Experimento de interruptor de tinte y cocultivo de cepas isógenas etiquetadas con cfp y yfp
La expresión de cualquiera de los dos genes que codifican fluoróforos en B. subtilis podría influir en la aptitud y, por lo tanto, en la tasa de crecimiento de las bacterias. Por lo tanto, se recomienda realizar los siguientes experimentos para excluir que la eliminación de una cepa competidora de la población celular durante el cultivo se deba simplemente a un efecto negativo del fluoróforo:
- Repita todo el experimento y cocultiva las cepas etiquetadas inversamente(por ejemplo, la cepa etiquetada anteriormente con cfpahora está etiquetada con el gen yfp y viceversa). Aunque inversamente, los resultados obtenidos deben ser comparables a la observación anterior de que una cepa tiene una ventaja de crecimiento selectivo sobre la otra cepa.
- Repita todo el experimento y coculte las cepas isógenas etiquetadas con yfp y cfp (por ejemplo, BP40 (rocG+ gudBCR amyE: :PgudB-yfp) y BP41 (rocG+ gudBCR amyE: :PgudB-cfp)). Estimar el efecto negativo de cualquiera de los dos fluoróforos sobre la aptitud de las bacterias siguiendo la composición de la población celular a lo largo del tiempo.
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Representative Results
El método descrito aquí se aplicó con éxito para visualizar la competencia intraespecies en una población celular que consiste en cepas de B. subtilis que fueron etiquetados con los genes cfp e yfp que codifican los fluoróforos CFP y YFP, respectivamente. Como se muestra en la Figura 3,el método se puede utilizar para visualizar la competencia intraespecies de una manera muy ilustrativa. Al detectar las muestras en áreas pequeñas, la composición clonal de la población celular se hizo visible de un vistazo. Aunque no es apropiado para análisis cuantitativos, este enfoque es útil para estimar aproximadamente el efecto de diferentes parámetros de crecimiento(es decir,fuente de nitrógeno) en el desarrollo de una población celular que inicialmente contenía ambas cepas en cantidades iguales (Figura 3). Además, en un enfoque a pequeña escala, la aptitud de diferentes cepas de B. subtilis que se cultivaron bajo la misma condición de crecimiento se puede probar utilizando una sola placa de agar. Para los análisis cuantitativos se recomienda propagar las muestras sobre toda la superficie de una placa de agar. Esto evitará la superposición de las colonias y, por lo tanto, permite la identificación y el recuento distintos de las colonias que surgieron de células individuales. Mediante el enchapado de diluciones apropiadas en placas de agar, la composición clonal de una población celular a lo largo del tiempo se puede determinar con precisión simplemente contando las colonias fluorescentes amarillas y azules (ver Figura 4). Como hemos informado previamente, la actividad de GDH afecta fuertemente a la aptitud de B. subtilis dependiendo de la disponibilidad de glutamato exógeno2. Obviamente, en ausencia de glutamato exógeno, la actividad de GDH de alto nivel es desventajosa para las bacterias, ya que las enzimas RocG y GudB degradan el glutamato que se necesita en el anabolismo (ver Figura 1 y Figura 4A). Por el contrario, si se proporciona a las bacterias, el glutamato puede servir como donante de grupo amino en las reacciones de transaminación. Por otra parte, el glutamato puede ser introducido en el metabolismo del carbono y utilizado como fuente de energía debido a la presencia de los GDHs catabólicamente activos RocG y GudB (Figura 1 y Figura 4B). Como se muestra en las Figuras 4C y 4D,se obtuvieron resultados similares en un experimento de interruptor de tinte. Una vez más, las bacterias equipadas con actividad de alto nivel de GDH fueron superadas por las células con actividad reducida de GDH en medios de crecimiento que carecían de glutamato. Por el contrario, las bacterias que sintetizaban solamente un GDH activo fueron eliminadas de la cultura cuando el medio fue complementado con el glutamato. Como se muestra en las Figuras 5A y 5B,la composición inicial de la población de células mixtas se mantuvo casi constante a lo largo del tiempo. Así, en el experimento de competición la eliminación de cualquiera de las dos cepas que estaban equipadas con diferentes cantidades de actividad GDH no se debió a un defecto de crecimiento causado por los fluoróforos (ver Figura 4). En conjunto, el uso de fluoróforos es una herramienta poderosa para monitorear la competencia intraespecípeda en una población celular bacteriana.
Figura 1. El vínculo entre el metabolismo del carbono y el nitrógeno en B. subtilis. Cuando el glutamato no es proporcionado por el medio, el principal donante de aminoácidos que se necesita para el anabolismo se sintetiza a partir de amonio y 2-oxoglutarato por la acción combinada de la glutamina sintetasa (GS) y la glutamato sintasa (GOGAT). Por el contrario, en presencia de glutamato exógeno los GDHs catabólicamente activos RocG y/o GudB pueden degradar el glutamato a amonio y 2-oxoglutarato, que luego sirve como fuente de carbono.
Figura 2. Flujo de trabajo experimental. La cepa 1 (etiquetada con yfp)y la cepa 2 (etiquetada con cfp)difieren en un locus entre sí. En el ejemplo presentado aquí, hemos comparado el efecto del glutamato exógeno (efector) sobre el desplazamiento genotípico de la población celular que inicialmente contenía el 50% de rocG+ gudB+ (codificando dos GDHs activos) y el 50% de rocG+ gudBCR (codificando un GDH activo) células. Haga clic aquí para ver la imagen más grande.
Figura 3. Enfoque semicuantitativo para visualizar la competencia intraespecínica de forma descriptiva (ver sección 5). Antes de la cocultivación (0 horas), y después de 7 horas y 24 horas de diluciones del crecimiento (10-4)de células fueron manchados en las placas del agar sp. Las células supervivientes que han formado colonias después de 12 horas de incubación a 37 °C fueron identificadas por microscopía de fluorescencia estéreo. Tiempo de exposición, 0,6 seg; barra de escala, 1 mm. Esta figura fue modificada de Gunka et al. 20132.
Figura 4. Cuantificación de la competencia intraespecies. Después de la dilución de la muestra y la propagación de las células (ver pasos 3.1-3.3) en medio SP, las placas se incubaron durante la noche a 37 °C. Las colonias amarillas y azules se cuantificaron como se describe en los Protocolos 4 y 6. Las barras de error negras representan desviaciones estándar para al menos cuatro experimentos repetidos independientemente. Cada placa de agar contenía al menos 100 colonias contables. (A)En ausencia de glutamato exógeno, la cepa BP40 (amarilla) de B. subtilis equipada con un solo GDH funcional compensa a la cepa BP54 (azul), que sintetiza ambas enzimas degradadoras de glutamato, RocG y GudB. (B) Por el contrario, la síntesis de dos GDHs funcionales es ventajosa para las bacterias cuando el glutamato exógeno está disponible porque además de la glucosa, el glutamato se utiliza como fuente de carbono. Como se muestra en(C)y(D),se obtuvieron resultados comparables en un experimento de interruptor de tinte. Esta figura fue modificada de Gunka et al. 20132. Haga clic aquí para ver la imagen más grande.
Figura 5. Experimento de control para evaluar el efecto de los genes cfp e yfp que codifican fluoróforos sobre la aptitud de las bacterias. Las poblaciones mixtas de las cepas isógenas BP40(rocG+ gudBCR amyE::yfp)y BP41(rocG+ gudBCR amyE::cfp)o BP52(rocG+ gudB+ amyE::cfp)y BP156(rocG+ gudB+ amyE::yfp)se cultivaron en ausencia(A)y en presencia(B)de glutamato exógeno. Las células supervivientes fueron contadas según lo descrito en los protocolos 1-4 y 6, respectivamente. Las barras representan desviaciones estándar para al menos cuatro experimentos repetidos independientemente. Esta figura fue modificada de Gunka et al. 20132. Haga clic aquí para ver la imagen más grande.
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Discussion
Se han desarrollado varios métodos para analizar la aptitud competitiva de las bacterias16. En muchos casos las bacterias fueron etiquetadas con diferentes casetes de resistencia a los antibióticos17. Similar a nuestro enfoque, el etiquetado de las células con casetes de resistencia a antibióticos permite la evaluación de la aptitud competitiva de las bacterias durante el cocultivo en condiciones de crecimiento definidas. Por otra parte, este método se puede utilizar para determinar la aptitud competitiva de las células que diferencian de uno a en un lugar geométrico específico en el cromosoma17. Sin embargo, hay algunas desventajas en el uso de casetes de resistencia a los antibióticos para controlar la aptitud competitiva. Como la expresión de los genes de resistencia es impulsada principalmente por promotores que tienen una fuerza desigual, las enzimas que confieren resistencia a los antibióticos probablemente se producen a diferentes niveles. Por lo tanto, los efectos débiles de la aptitud pueden no ser perceptibles con este acercamiento. En nuestro enfoque, ambos genes fluoróforos se integraron con el mismo marcador de selección y su expresión es impulsada por los mismos promotores2. Otra desventaja para monitorear la aptitud competitiva con casetes de resistencia a los antibióticos podría ser que el enfoque es más laborioso, ya que se necesitan dos tipos de placas de agar complementadas con los antibióticos apropiados para el conteo de colonias. Alternativamente, la aptitud de las bacterias puede determinarse simplemente mediante el seguimiento de la tasa de crecimiento y mediante el cálculo de un llamado índice de aptitud16. Obviamente, este es el enfoque más preciso porque las bacterias se cultivan individualmente y los compuestos tóxicos que podrían ser producidos por una cepa con un determinado genotipo no afectarán el crecimiento de la cepa competidora. Además, no hay necesidad de usar antibióticos que puedan afectar el crecimiento de las células. Sin embargo, ambos enfoques no son muy ilustrativos, ya que los números que describen la aptitud competitiva solo se pueden presentar de una manera bastante neutral.
El uso de genes que codifican fluoróforos para monitorear y cuantificar la competencia intraespecies tiene varias ventajas sobre otros métodos. Si ambas cepas han integrado los genes que codifican el fluoróforo por doble recombinación homóloga en el cromosoma, no hay necesidad de utilizar antibióticos en ninguna de las etapas de cultivo. Por lo tanto, las muestras que se toman del cultivo durante el cultivo se pueden analizar en el mismo medio de crecimiento y ambas cepas son capaces de crecer. Este enfoque permite la visualización de la competencia intraespecíes de una manera muy ilustrativa. Además, utilizando este enfoque semicuantitativo se pueden probar varias condiciones de crecimiento al mismo tiempo y se pueden comparar muchas cepas diferentes en paralelo. Por último, no hay necesidad de fijación de las muestras en portaobjetos de microscopio porque las muestras que se tomaron del cultivo bacteriano durante el cocultivo se pueden almacenar en un congelador18. Por lo tanto, todas las muestras y réplicas se pueden analizar al mismo tiempo.
Hay que mencionar dos pasos críticos en nuestro protocolo. Es importante tener en cuenta que las criostocks deben contener cantidades iguales de células en la misma fase de crecimiento de cada cepa competidora. Una desproporción inicial de las cepas en las criostocks y, en consecuencia, en los frascos de agitación antes de comenzar el experimento tendrá un fuerte impacto en el resultado del experimento de competencia. Por lo tanto, es aconsejable comprobar la composición de los criostocks antes del experimento. Por otra parte, una cantidad apropiada de células se debe propagar uniformemente sobre la placa. De lo contrario, las colonias emergidas están demasiado cerca unas de otras y una determinación precisa de las células sobrevivientes será difícil.
También hay algunas limitaciones e inconvenientes del enfoque basado en fluoróforos. El cocultivo en un lector de placas de múltiples pozos y la detección simultánea de las señales CFP y YFP no es posible ya que los espectros de excitación y emisión de los fluoróforos están demasiado cerca uno del otro. Sin embargo, este problema técnico podría evitarse utilizando diferentes proteínas fluorescentes, como las que emiten luz verde y roja, basadas de manera óptima en el mismo andamio de proteínas. Otro inconveniente del enfoque basado en fluoróforos podría ser que algunas mutaciones causan sólo un defecto de crecimiento débil de las bacterias. Por lo tanto, si el defecto de crecimiento que podría ser causado por cualquiera de los genes que codifican fluoróforos es más fuerte que el defecto de crecimiento causado por una determinada mutación, el enfoque basado en fluoróforos no es apropiado para analizar la competencia intraespecítica. Por lo tanto, antes de crear todo un conjunto de cepas, se recomienda etiquetar primero solo la cepa madre con ambas, cfp y yfp, y cocultivar las cepas. Los experimentos de crecimiento revelarán qué tan fuertes afectan los fluoróforos a la aptitud de las bacterias (ver Figuras 5A y 5B).
En el futuro será interesante probar si el enfoque basado en fluoróforos para monitorear la competencia intraespecítica será más preciso y menos laborioso si las células sobrevivientes se cuentan mediante citometría de flujo. Recientemente, la citometría de flujo ha demostrado ser una poderosa herramienta para analizar la composición de las biopelículas de B. subtilis 19. Por otra parte, pudo ser más apropiado analizar los efectos débiles de la aptitud que afectan a la aptitud competitiva de bacterias por la cocultivación continua de las bacterias fluoróforo-etiquetadas en un fermentador. A diferencia de los matraces de agitación, este enfoque permite mantener constantes las condiciones de crecimiento y, por lo tanto, controlar la competencia intraespecíes durante un largo período de tiempo.
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Disclosures
Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.
Acknowledgments
El trabajo en el laboratorio de los autores fue apoyado por la Deutsche Forschungsgemeinschaft (http://www.dfg.de; CO 1139/1-1), el Fonds der Chemischen Industrie (http://www.vci.de/fonds) y el Göttingen Centre for Molecular Biology (GZMB). Los autores desean agradecer a Jörg Stülke por sus útiles comentarios y su lectura crítica del manuscrito.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| (NH4)2SO4 | Roth, Germany | 3746 | |
| Agar | Difco, USA | 214010 | |
| Ammonium ferric citrate (CAF) | Sigma-Aldrich, Germany | 9714 | |
| CaCl2 | Roth, Germany | 5239 | |
| Glucose | Applichem, Germany | A3617 | |
| Glycerol | Roth, Germany | 4043 | |
| K2HPO4•3H2O | Roth, Germany | 6878 | |
| KCl | Applichem, Germany | A3582 | |
| KH2PO4 | Roth, Germany | 3904 | |
| KOH | Roth, Germany | 6751 | |
| MgSO4•7H2O | Roth, Germany | P027 | |
| MnCl2 | Roth, Germany | T881 | |
| MnSO4•4H2O | Merck Millipore, Germany | 102786 | |
| NaCl | Roth, Germany | 9265 | |
| Nutrient broth | Roth, Germany | X929 | |
| Potassium glutamate | Applichem, Germany | A3712 | |
| Tryptone | Roth, Germany | 8952 | |
| Tryptophan | Applichem, Germany | A3445 | |
| Yeast extract | Roth, Germany | 2363 | |
| 1.5 ml Reaction tubes | Sarstedt, Germany | 72,690,001 | |
| 2.0 ml Reaction tubes | Sarstedt, Germany | 72,691 | |
| 15 ml Plastic tubes with screw cap | Sarstedt, Germany | 62,554,001 | |
| Petri dishes | Sarstedt, Germany | 82.1473 | |
| 1.5 ml Polystyrene cuvettes | Sarstedt, Germany | 67,742 | |
| 15 ml Glass culture tubes | Brand, Germany | 7790 22 | |
| 100 ml Shake flasks with aluminium caps | Brand, Germany | 928 24 | |
| Sterile 10 ml glass pipettes | Brand, Germany | 278 23 | |
| Incubator (28 and 37 °C) | New Brunswick | M1282-0012 | |
| Standard pipette set (2-20 μl, 10-100 μl, 100-1,000 μl) | Eppendorf, Germany | 4910 000.034, 4910 000.042, | |
| Table top centrifuge for 1.5 and 2 ml reaction tubes | Thermo Scientific, Heraeus Fresco 21, Germany | 75002425 | |
| Table top centrifuge for 15 ml plastic tubes | Heraeus Biofuge Primo R, Germany | 75005440 | |
| Standard spectrophotometer | Amersham Biosciences Ultrospec 2100 pro, Germany | 80-2112-21 | |
| Stereofluorescence microscope | Zeiss SteREO Lumar V12, Germany | 495008-0009-000 | |
| Freezer (-20 and -80 °C) | - | - | |
| Fridge (4 °C) | - | - | |
| Autoclave | Zirbus, LTA 2x3x4, Germany | - | |
| pH meter | pH-meter 766, Calimatic, Knick, Germany | 766 | |
| Vortex | Vortex 3, IKA, Germany | 3340000 | |
| Balance | CP2202S, Sartorius, Germany | replaced by | |
| Black pen (permanent marker) | Staedler, Germany | 317-9 | |
| Powerpoint program | Microsoft, USA | - | |
| Office Excel program | Microsoft, USA | - | Program for data processing |
| Adobe Photoshop CS5 | Adobe, USA | replaced by CS6, download | Computer program for image processing |
| Computer | PC or Mac | - | |
| ZEN pro 2011 software for the stereofluorescence microscope | Zeiss, Germany | 410135 1002 110 | AxioCam MRc Rev. Obtained through Zeiss |
| Specific solution recipes | |||
| SP Medium | |||
| 8 g Nutrient broth | |||
| 0.25 mg MgSO4•7H2O | |||
| 1 g KCl | |||
| 15 g agar for solid SP medium | if required | ||
| add 1 L with H2O | autoclave for 20 min at 121 °C | ||
| 1 ml CaCl2 (0.5 M), sterilized by filtration | |||
| 1 ml MnCl2 (10 mM), sterilized by filtration | |||
| 2 ml ammonium ferric citrate (CAF, 2.2 mg/ml), sterilized by filtration | |||
| LB Medium | |||
| 10 g Tryptone | |||
| 5 g Yeast extract | |||
| 10 g NaCl | |||
| 15 g agar for solid LB medium | if required | ||
| add 1 L with H2O | autoclave for 20 min at 121 °C | ||
| C-Glc Minimal Medium | |||
| 200 ml 5 x C salts | |||
| 10 ml L-Tryptophan (5 mg/ml), sterilized by filtration | |||
| 10 ml ammonium ferric citrate (CAF, 2.2 mg/ml), sterilized by filtration | |||
| 10 ml III’ salts | |||
| 25 ml Glucose (20%) | autoclaved for 20 min at 121 °C | ||
| add 1 L with sterile H2O | |||
| CE-Glc Minimal Medium | |||
| 200 ml 5 x C salts | |||
| 10 ml L-Tryptophan (5 mg/ml), sterilized by filtration | |||
| 10 ml ammonium ferric citrate (CAF, 2.2 mg/ml), sterilized by filtration | |||
| 10 ml III’ salts | |||
| 20 ml Glutamate (40%) | |||
| 25 ml Glucose (20%), autoclaved for 20 min at 121 °C | |||
| add 1 L with sterile H2O | |||
| 5 x C salts | |||
| 20 g KH2PO4 | |||
| 80 g K2HPO4•3H2O | |||
| 16.5 g (NH4)2SO4 | |||
| add 1 L with sterile H2O | autoclave for 20 min at 121 °C | ||
| III’ salts | |||
| 0.232 g MnSO4•4H2O | |||
| 12.3 g MgSO4•7H2O | |||
| add 1 L with sterile H2O, autoclave for 20 min at 121 °C | |||
| 40% Glutamate solution | |||
| 200 g L-Glutamic acid | |||
| adjust the pH to 7.0 by adding approximately 80 g KOH | |||
| add 0.5 L with sterile H2O | autoclave for 20 min at 121 °C | ||
| 0.9% Saline (NaCl) Solution | |||
| add 1 L with sterile H2O | autoclave for 20 min at 121 °C | ||
| 50% Glycerol solution | |||
| 295 ml Glycerol (87%) | |||
| add 0.5 L with sterile H2O | autoclave for 20 min at 121 °C | ||
| Bacteria (All strains are based on the Bacillus subtilis strain 168) | |||
| Bacillus subtilis BP40 (rocG+ gudBCR amyE::PgudB-yfp) | Laboratory strain collection | ||
| Bacillus subtilis BP41 (rocG+ gudBCR amyE::PgudB-cfp) | |||
| Bacillus subtilis BP52 (rocG+ gudB+ amyE::PgudB-cfp) | |||
| Bacillus subtilis BP156 (rocG+ gudB+ amyE::PgudB-yfp) | |||
References
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