Den Quellung reaktion er den gyldne standard teknik til serotypning Streptococcus pneumoniae. Denne teknik udnytter et mikroskop og specifik pneumokok antisera og er almindeligt anvendt i reference og forskningslaboratorier verden over.
Der er over 90 forskellige kapsulære serotyper af Streptococcus pneumoniae (Pneumokokker). Samt at det er et redskab til at forstå pneumokok-epidemiologi, kan capsular serotypning give nyttige oplysninger til undersøgelser vaccinens effekt og virkning. Den Quellung reaktion er den gyldne standard metode til pneumokok kapsel-serotypning. Fremgangsmåden involverer afprøvning af en pneumokok cellesuspension med poolet og specifikke antisera rettet mod kapselpolysaccharidet. Antigen-antistof-reaktioner observeres mikroskopisk. Protokollen har tre trin: 1) udarbejdelse af en bakteriel celle suspension, 2) blanding af celler og antisera på en glasplade, og 3) med at læse Quellung reaktion ved hjælp af et mikroskop. Den Quellung reaktion er rimelig enkel at udføre og kan anvendes, hvor et egnet mikroskop og antisera er tilgængelige.
Streptococcus pneumoniae (den pneumokokker) er ansvarlig for død af en anslået 800.000 børn under fem år årligt med sygdomsbyrden falder overvejende ressourcefattige lande 1. Pneumokoksygdom variere i sværhedsgrad fra lokaliserede infektioner såsom akut otitis media til alvorlige livstruende infektioner, såsom sepsis, meningitis og lungebetændelse 2. Over 90 capsular serotyper af pneumokokker er blevet beskrevet 3, 4. Aktuelle Pneumokokvacciner yde beskyttelse mod de serotyper, der er ansvarlige for størstedelen af invasiv sygdom 5, 6. Imidlertid har udbredt anvendelse af vacciner været forbundet med udskiftning af serotyper i vaccinen ved nonvaccine serotyper, både i nasopharyngealt vogn og invasiv sygdom 7, 8. Dette understreger betydningen af serotypning til epidemiologiskovervågning og langsigtet vaccine konsekvensanalyser 9.
Den gyldne standard metode til pneumokok skrive er kapselåbningen reaktion test, kendt som Quellung reaktion, første gang beskrevet af Neufeld i 1902 (se østrigsk 10). Der er fundet en høj grad af overensstemmelse mellem laboratorier og mellem Quellung reaktion og andre serotypning metoder 11-13. Der er flere variationer af Quellung reaktion 10, 14-16. Den her beskrevne metode kræver ikke brug af en tæller plet eller oliebestandighedsobjektet linse, men snarere, en dråbe af tilberedte prøve er blandet med maskinskrivning serum og undersøges straks under 400X forstørrelse.
Den Quellung Reaktionen udføres sædvanligvis ved anvendelse af kommercielt tilgængelige antisera. Den her beskrevne metode anvender mindre antisera sammenlignet med nogle andre metoder, 16, 17, hvilket gør det mere omkostningseffektivt. Når en isolspiste er identificeret som pneumokok det sekventielt testet med antisera puljer, indtil en positiv reaktion. Hver pulje antiserum indeholder forskellige blandinger af antisera rejst mod 91 pneumokok serotyper 18. Når puljen er etableret, bliver den enkelte type og gruppe antisera, der er inkluderet i den reaktive pulje testet enkeltvis i rækkefølge. Type antisera generelt reagerer med en enkelt serotype (fx type 1 antiserum reagerer med serotype 1), mens gruppe antisera reagere med alle de serotyper i en bestemt gruppe (f.eks Gruppe 22 antiserum reagerer med serotyper 22F og 22A). Nogle serotyper inden for grupper er differentieret yderligere hjælp faktor antisera (f.eks Serotype 22F reagerer med faktor 22b, men ikke 22c). I dette tilfælde test fortsættes med alle relevante faktor antisera indtil serotype bestemmes 19, 20. Den Quellung reaktionen er enkel og hurtig 14 og kan udføres i enhver laboratory der er udstyret med en god kvalitet mikroskop og passende sæt antisera.
Et kritisk trin i denne teknik er at sikre en ren kultur anvendes til at fremstille suspensionen sammen med tilsætning af et passende antal af bakterieceller til suppen. Det skal bemærkes, at kolonivækst og morfologi på agarplader varierer mellem forskellige pneumokok isolater. Nogle producerer tørre og ru kolonier, som kan være svært at vælge med en løkke og ikke emulgere godt i bouillon. Af denne grund kan en større feje af bakterier kræves ved udarbejdelsen af celle suspension. Under alle omstændigheder er det nødvendigt, at de enkelte celler og ikke aggregater, er indlysende i den negative kontrol, så deres relative størrelse kan sammenlignes med celler med antisera tilsat. Derudover kan for mange bakterieceller resultere i en falsk negativ reaktion, hvor et overskud af kapselantigenet kan hæmme Quellung reaktion 10. Af denne grund er det vigtigt at skabe en bakteriesuspension med en egnet celledensitet (figur 1). SUSpensionen kan konserveres i adskillige måneder ved tilsætning af nogle dråber koncentreret formalin. Dette gør det lettere at batch test og også steriliserer bouillon reducerer risikoen for laboratorie-infektioner, selv om dette skal afvejes mod risikoen for håndtering af formalin sikkerhed, som er giftigt, ætsende, kræftfremkaldende, sensibiliserende og brandfarlig. Derudover har vi observeret, at nogle isolater viser svagere reaktioner i nærvær af formalin (data ikke vist).
Quellung reaktioner er undersøgt ved hjælp af et mikroskop. Anvendelsen af fasekontrast øger synligheden af kapslen. I nogle laboratorier reaktionen ses ved hjælp olieimmersionsobjektiv ved 1.000 x forstørrelse 14, 16. Desuden er nogle laboratorier bruge en tæller plet (methylenblåt) for yderligere at øge synligheden af en positiv reaktion 10, 16, 22. Metoden præsenteres her ses uden olie-immersion og under 400X forstørrelse 15, 17. Denne metode er hurtig, enkel og relativt let at læse 23.
Det er vigtigt at opretholde en god intern kontrol kvalitet procedurer for at sikre antisera og testprocedurer er i orden. Deltagelse i en ekstern kvalitetssikring program er ofte gavnligt.
En væsentlig begrænsning af Quellung reaktion til serotypning af pneumokokker er de høje omkostninger af antiseraene påkrævet. Imidlertid er minimeret i den ovennævnte protokol, på grund af den lille mængde af antiserum anvendt til hver reaktion. Er blevet beskrevet flere andre fremgangsmåder til serotypning pneumokokker 23, 24. Men Quellung fortsat guldstandarden og udvikling af nye metoder kræver standardisering mod Quellung reaktion 23. Ved hjælp af passende antisera kan Quellung reaktion også bruges til at identificere og skrive andre hætterule producerende bakterier 25. Den Quellung reaktion er medvirkende til karakterisering af nuværende og kommende pneumokok serotyper, samt give oplysninger om vaccinens effekt og virkningen af vaccination mod transport og sygdom på lang sigt.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet af Bill og Melinda Gates Foundation (PneuCarriage projekt, Grant 52099), og den victorianske regering operationelle infrastruktur Support Program. Takket være Eileen Dunne, Janet Strachan, og Kim Hare for kritisk læsning af manuskriptet.
Pneumococcus (Neufeld) antisera | SSI Diagnostica | http://www.ssi.dk/ssidiagnostica Bring all antisera to room temperature before use |
|
Pneumococcus (Omni) antiserum | SSI Diagnostica | 2438 | Bring all antisera to room temperature before use |
Optical Microscope | Leica Microsystems | Leica DML | |
Calibrated Disposable Inoculating Loops 1 µl | Copan | CD175S01 | |
Horse Blood Agar (HBA) plates | Thermo Fisher Scientific | PP2001 | http://www.thermofisher.com.au/ Bring to room temperature before use |
Heart Infusion (HI) broth | Media Preparation Unit (MPU), The University of Melbourne | 40HIN | Bring to room temperature before use |
Glass microscope slides 76 mm x 26 mm | Lomb Scientific | 7101 | Sharps hazard: Dispose in a biohazard sharps container |
Circular glass coverslips | NeuVitro | GG-5 | |
*Excluding the antisera, all other materials can be purchased from alternative suppliers | |||
*Plates prepared from defibranated sheep blood are suitable but blood plates prepared from citrated blood or human blood are not |