Den Quellung reaksjonen er gullstandarden teknikk for Serotypebestemmelse Streptococcus pneumoniae. Denne teknikken benytter et mikroskop og bestemt pneumokokkantisera og er ofte brukt i referanse-og forskningslaboratorier verden over.
Det finnes over 90 ulike kapsel serotyper av Streptococcus pneumoniae (den pneumococcus). I tillegg til å være et verktøy for å forstå pneumokokk epidemiologi, kan kapsel serotyping gi nyttig informasjon for vaksine effekt og konsekvensutredninger. Den Quellung reaksjonen er gullstandarden metode for pneumokokkkapsel serotyping. Fremgangsmåten omfatter å teste en pneumokokk cellesuspensjon med poolet og spesifikk antisera rettet mot kapsulært polysakkarid. Den antigen-antistoff-reaksjoner er observert mikroskopisk. Protokollen har tre hovedtrinn: 1) Fremstilling av en bakteriell cellesuspensjonen, 2) blanding av celler og antisera på et objektglass, og 3) å lese den Quellung reaksjon ved hjelp av et mikroskop. Den Quellung reaksjonen er forholdsvis enkel å utføre, og kan anvendes overalt hvor en egnet mikroskop og antisera er tilgjengelige.
Streptococcus pneumoniae (den pneumococcus) er ansvarlig for drapet på anslagsvis 800 000 barn under fem år hvert år, med byrden av sykdommen faller hovedsakelig i ressursfattige land en. Pneumokokk-sykdommer varierer i alvorlighetsgrad fra lokaliserte infeksjoner som akutt mellomørebetennelse til alvorlige livstruende infeksjoner som blodforgiftning, hjernehinnebetennelse og lungebetennelse to. Over 90 kapsulære serotyper av pneumokokker, er beskrevet 3, 4. Nåværende pneumokokkvaksiner gir beskyttelse mot serotyper som er ansvarlig for de fleste av invasiv sykdom 5, 6. Imidlertid har utstrakt bruk av vaksiner vært forbundet med utskifting av serotypene som er inkludert i vaksinen etter nonvaccine serotyper, både in nasopharyngeal vognen og invasiv sykdom 7, 8. Dette understreker viktigheten av serotyping for epidemiologiskovervåking og langsiktig vaksine konsekvensutredninger ni.
Gullet standardmetoden for pneumokokk skrive er det kapsulære reaksjons test, kjent som Quellung reaksjon, først beskrevet av Neufeld i 1902 (se østerriksk 10). En høy grad av concordance ble funnet mellom laboratorier og mellom Quellung reaksjonen og andre serotyping metoder 11-13. Det er flere variasjoner av Quellung reaksjons 10, 14-16. Metoden som beskrives her ikke krever bruk av en teller flekk eller olje nedsenking linse, snarere er en dråpe og prøven blandet med skrivemaskin serum og umiddelbart undersøkt under 400X forstørrelse.
Den Quellung reaksjonen utføres vanligvis ved hjelp av kommersielt tilgjengelig antisera. Metoden som beskrives her, bruker mindre antisera sammenlignet med noen andre metoder for 16, 17, noe som gjør det mer kostnadseffektivt. Når en isolspiste er identifisert som en pneumococcus, er det i rekkefølge testet med antisera bassengene frem til en positiv reaksjon blir observert. Hver pool antiserum inneholder ulike blandinger av antisera reist mot 91 pneumokokkserotypene 18. Når bassenget er etablert, blir den enkelte type og gruppe-antisera som er inkludert i den reaktive bassenget testet individuelt i rekkefølge. Type antisera vanligvis reagere med en enkelt serotype (f.eks Type 1 antiserum reagerer med serotype 1), mens gruppe-antisera reagerer med alle serotypene i en bestemt gruppe (f.eks gruppe 22 antiserum reagerer med serotype 22F og 22A). Noen serotyper innenfor gruppene er videre differensiert ved hjelp av faktor antisera (som serotype 22F reagerer med faktor 22b, men ikke 22c). I dette tilfelle testing fortsettes med alle relevante faktor antisera til serotype bestemmes 19, 20.. Den Quellung reaksjonen er enkel og rask, og 14 kan utføres i en hvilken som helst laboratory som er utstyrt med en god kvalitet mikroskop og hensiktsmessig sett av antisera.
Et kritisk punkt i denne teknikken er å sikre en ren kultur brukes til å tilberede suspensjonen sammen med tilsetning av et egnet antall bakterieceller til vekstmediet. Det bør bemerkes at kolonivekst og morfologi på agarplater varierer fra pneumokokk isolater. Noen produserer tørr og ru kolonier, som kan være vanskelig å plukke ut med en løkke, og ikke bland godt i suppen. På grunn av dette kan et større sveip av bakterier være nødvendig ved fremstilling av cellesuspensjonen. I alle fall er det viktig at de enkelte celler, og ikke aggregater, er åpenbare i den negative kontrollen, slik at deres relative størrelse kan sammenlignes med celler med antisera tilsatt. I tillegg kan for mange bakteriecellene resultere i en falsk negativ reaksjon, hvor et overskudd av capsular antigen kan hemme Quellung reaksjonen 10.. Av denne grunn er det viktig å skape en bakteriell suspensjon med en passende celletetthet (figur 1). Den suspensjon kan bli bevart i flere måneder ved tilsetning av flere dråper konsentrert formalin. Dette gjør det enklere å batch testing og også steriliserer suppen redusere risikoen for laboratorieinfeksjoner, selv om dette må veies opp mot risikoen sikkerhet for håndtering av formalin, som er giftig, etsende, kreftfremkallende, allergifremkallende, og brannfarlig. Videre har vi observert at noen isolater viser svakere reaksjoner i nærvær av formalin (data ikke vist).
Quellung reaksjoner er undersøkt ved hjelp av et mikroskop. Bruken av fasekontrast forbedrer synligheten av kapselen. I noen laboratorier blir reaksjonen vises ved hjelp av olje-neddykking ved 1000 X forstørrelse 14, 16. I tillegg er noen laboratorier bruke en teller flekk (metylenblått) for ytterligere å øke synligheten av en positiv reaksjon 10, 16, 22. Metoden som presenteres her er sett uten olje-immersion og under 400X forstørrelse 15, 17. Denne metoden er rask, enkel og forholdsvis lett å lese 23.
Det er viktig å opprettholde gode interne kvalitetskontroller for å sikre de immunsera og testprosedyrer er i orden. Deltakelse i et eksternt kvalitetssikringsprogram er ofte gunstig.
En viktig begrensning av Quellung reaksjon for serotyping av pneumokokker er den høye kostnaden av antisera nødvendig. Dette er imidlertid minimalisert i den ovennevnte protokoll på grunn av den lille mengden av antiserum brukes for hver reaksjon. Flere andre fremgangsmåter er blitt beskrevet for serotyping pneumokokker 23, 24. Men fortsatt Quellung gullstandarden og utvikling av nye metoder krever standardisering mot Quellung reaksjon 23. Ved å bruke passende antisera kan Quellung reaksjonen også bli anvendt for å identifisere og skriv andre hetterule produserende bakterier 25. Den Quellung reaksjonen er instrumental i karakterisering av dagens og fremtidens pneumokokkserotypene, samt gi informasjon om vaksinens effekt og den langsiktige effekten av vaksinering på vogn og sykdom.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av Bill og Melinda Gates Foundation (PneuCarriage prosjektet, Grant 52099) og den viktorianske regjeringens Operasjonell Infrastruktur Support Program. Takk til Eileen Dunne, Janet Strachan, og Kim Hare for kritisk lesing av manuskriptet.
Pneumococcus (Neufeld) antisera | SSI Diagnostica | http://www.ssi.dk/ssidiagnostica Bring all antisera to room temperature before use |
|
Pneumococcus (Omni) antiserum | SSI Diagnostica | 2438 | Bring all antisera to room temperature before use |
Optical Microscope | Leica Microsystems | Leica DML | |
Calibrated Disposable Inoculating Loops 1 µl | Copan | CD175S01 | |
Horse Blood Agar (HBA) plates | Thermo Fisher Scientific | PP2001 | http://www.thermofisher.com.au/ Bring to room temperature before use |
Heart Infusion (HI) broth | Media Preparation Unit (MPU), The University of Melbourne | 40HIN | Bring to room temperature before use |
Glass microscope slides 76 mm x 26 mm | Lomb Scientific | 7101 | Sharps hazard: Dispose in a biohazard sharps container |
Circular glass coverslips | NeuVitro | GG-5 | |
*Excluding the antisera, all other materials can be purchased from alternative suppliers | |||
*Plates prepared from defibranated sheep blood are suitable but blood plates prepared from citrated blood or human blood are not |