DNBS / TNBS colitis biedt een alternatieve en goedkope methode om de pathobiology van ontstekingsdarmziekte bestuderen. Het protocol besproken in dit document schetst de succesvolle toepassing van DNBS om colitis te induceren bij muizen en ratten en maakt het mogelijk om grondig te bestuderen host-mediated intestinale reacties.
Inflammatoire darmziekten (IBD), zoals ziekte van Crohn en colitis ulcerosa, zijn lang geassocieerd met een genetische basis, en meer recent systeem immuunresponsen op microbiële en milieufactoren. Dinitrobenzeen sulfonzuur (DNBS)-geïnduceerde colitis maakt het mogelijk om de pathogenese van IBD bijbehorende milieu-triggers, zoals stress en voeding, de effecten van mogelijke therapieën, en de onderliggende mechanismen van darmontsteking en mucosale letsel bestuderen. In dit artikel, onderzochten we het effect van dieet n-3 en n-6-vetzuren aan de dikke mucosale ontstekingsreactie op DNBS-geïnduceerde colitis bij ratten. Alle ratten werden gevoed identieke dieet met uitzondering van verschillende vetzuren [saffloerolie (SO), canolaolie (CO) of visolie (FO)] gedurende drie weken voorafgaand aan blootstelling aan intrarectale DNBS. Controle ratten gegeven intrarectale ethanol bleef het verkrijgen van gewicht op de 5 daagse studie, terwijl, DNBS-behandelde ratten gevoed lipide diëten al lost gewicht met FO-en CO-gevoede ratten aantonen significant gewichtsverlies met 48 uur en ratten SO gevoed door 72 uur. Gewichtstoename hervat na 72 uur na DNBS en met 5 dagen na DNBS, de FO groep had een hoger lichaamsgewicht dan SO of CO-groepen. Colon secties verzameld 5 dagen na DNBS-behandeling bleek focale zweren, crypte vernietiging, drinkbeker cel depletie, en mucosale infiltratie van zowel acute als chronische inflammatoire cellen die verschilden in ernst tussen groepen dieet. De SO gevoed groep toonde de meest ernstige schade, gevolgd door de CO, en FO gevoed groepen die de mildste mate van weefselbeschadiging toonde. Evenzo colon myeloperoxidase (MPO)-activiteit, een marker van neutrofiel activiteit was significant hoger in SO gevolgd door CO gevoede ratten met FO gevoede ratten met significant lagere MPO activiteit. Deze resultaten tonen het gebruik van DNBS-geïnduceerde colitis, zoals beschreven in dit protocol, om de impact van voeding bij het ontstaan van IBD te bepalen.
Inflammatoire darmziekte (IBD) wordt gekenmerkt door chronische recidiverende ontsteking in de gastro-intestinale (GI) stelsel, waardoor de symptomen van diarree, gewichtsverlies en buikpijn. Colitis ulcerosa (UC) en de ziekte van Crohn (CD) zijn de twee belangrijkste vormen van IBD, en kan worden onderscheiden door de plaats van de ontsteking in het maagdarmkanaal. Bij UC patiënten, de ontsteking meestal gaat het rectum en strekt aansluitend de colon een variabele mate die slechts oppervlakkig slijmvlies. Daarentegen kan CD elk deel van het spijsverteringskanaal beïnvloeden, hoewel treft vooral het ileum en caecum. CD manifesteert vaak als transmurale ontsteking vaak geassocieerd met granulomen en leidt tot stricturing (fibrostenotic) en / of doordringen (fistels) ziekte. Hoewel de etiologie van IBD blijft ongrijpbaar, is het algemeen geaccepteerd dat IBD is multifactorieel, waarbij interacties tussen de gastheren immuunsysteem, genetische gevoeligheid en verantses om milieu-en microbiële factoren.
Tot op heden zijn verschillende modellen van IBD voorgesteld dat verscheidene klinische, histologische en immuunresponsen kenmerkend UC en CD is. De meest gebruikte modellen zijn voorzien van genetisch gemodificeerde muizen (IL-2, IL-10, SAMP / Yit), infectie geïnduceerde modellen (Citrobacter rodentium, Salmonella typhimurium), adoptieve overdracht modellen (CD45 + RB Hoog, CD62L + cel overdracht in SCID muizen) en chemisch geïnduceerde colitis modellen (dextran natrium sulfaat (DSS), trinitrobenzeen sulfonzuur (TNBS) en Dinitrobenzeen sulfonzuur (DNBS)). Vanwege hun lage kosten en snelle aanvang van de ziekte, zijn chemische modellen van onschatbare waarde voor de studie van diverse aspecten van IBD overwogen. Elk van de chemische colitis modellen vermeld heeft voordelen en beperkingen in een aantal aspecten van hun klinische, immunologische en histopathologische relevantie voor IBD. DSS is een van de meest voorkomende chemische middelen om coli inducerentis bij knaagdieren 1. Toediening van 3-10% DSS (MW: 42 kDa) voor 7-10 dagen in het drinkwater van muizen kan symptomen van colitis, waaronder gewichtsverlies, diarree met bloed, colon verkorten, mucosale ulceratie en infiltratie van neutrofielen induceren. Dit model is vooral handig voor drug discovery studies, evenals het verkennen van de mechanismen van epitheliale regeneratie, de impact van aangeboren immuniteit op mucosale homeostase, en de rol van ontsteking in het bevorderen van intestinale dysplasie en adenocarcinoom ontwikkeling. Er zijn echter enkele nadelen aan de DSS-model, zoals variatie van de concentratie van DSS nodig colitis te induceren in verschillende dierlijke faciliteiten, en inconsistente wateropname bij muizen en dus niet verenigbaar blootstelling aan DSS, waardoor variatie in de mate, omvang en verdeling van mucosale schade en ulceratie van de colon. Al deze kenmerken leiden tot heterogeniteit van de resultaten en beperken het vermogen om resultaten te vergelijken tussen studies frOM verschillende onderzoeksgroepen.
Een alternatief voor de DSS-model is het hapteen-geïnduceerde DNBS of TNBS model van colitis. Dit model maakt gebruik van rectale toediening van de mucosale sensibiliserende stoffen DNBS of TNBS, verdund in wisselende concentraties van ethanol. De toediening van ethanol is een voorwaarde voor het colon mucosale barrière te breken om de penetratie van DNBS of TNBS toe in de lamina propria. DNBS / TNBS dan haptenize de gelokaliseerde dikke darm en microbiële eiwitten immunogeen worden, zodat daardoor de gastheer aangeboren en adaptieve immuunreacties. In het algemeen wordt dit model geassocieerd met ernstige en soms bloederige diarree, gewichtsverlies en darmwand verdikking echter symptomen variëren afhankelijk van het type van knaagdieren gebruikt, evenals de timing, dosering en de mate van blootstelling aan de DNBS of TNBS in de studie. Belangrijke verschillen tussen ratten en muizen dient te worden opgemerkt, met de voordelen van lagere kosten voor de aankoop en karton, alsmede Lower lichaamsmassa voor het verminderen van per-dier kosten van een behandeling in vivo. Dit moet worden afgezet tegen de meer snel en ernstig verloop van colitis in muizen, waar de meer kwetsbare en responsieve dieren snel een humaan eindpunt kan bereiken.
De intestinale ontsteking oorspronkelijk resultaten uit ethanol geïnduceerde beschadiging darmepitheelcellen, wat leidt tot verhoogde epitheliale permeabiliteit microbiële penetratie in de mucosa, haptenization van gastheereiwitten, dit alles leidt tot infiltratie van neutrofielen, macrofagen en T-lymfocyten Th1 naar de beschadigde mucosa. In vergelijking met DNBS, wordt TNBS beschouwd als een gevaarlijk chemisch vanwege de sterk oxidatieve eigenschappen die een gevaar voor ontploffing bij contact met basen zoals natrium en kalium hydroxide kan opleveren. Daarom DNBS wordt momenteel beschouwd als een voorkeur van chemische dan TNBS colitis veroorzaken. Bij knaagdieren DNBS colitis wordt beschouwd als een van de meest geschikte methoden om de vol bestuderenvleugel IBD geassocieerd modifiers van de ziekte:
In vergelijking met de DSS-model, de voordelen van DNBS en TNBS-geïnduceerde colitis zijn lage kosten, snelle ontwikkeling van colitis (vereist gewoonlijk 1-3 dagen reproduceerbare zweren en ontstekingen tonen) en consistent gelokaliseerde schade aan de distale colon. Maar de nadelen zijn een vereiste voor eenhoger niveau van technische expertise, optimalisering van DNBS / TNBS dosis, en de noodzaak voor anesthesie voor rectale toediening.
In deze methodologische paper bestudeerden we de effecten van verschillende concentraties van n-6 en n-3 meervoudig onverzadigde vetzuren op wijziging van de colon mucosale respons op DNBS-geïnduceerde colitis bij ratten met plantaardige oliën saffloerolie (SO) en canola-olie (CO) en visolie (FO). Het is aangetoond dat n-6 en n-3 vetzuren zijn belangrijke mediatoren van intestinale ontstekingsziekte door hun rol als acylgroepen van celmembraan phosopholipids 9. In tegenstelling tot de pro-inflammatoire potentieel van n-6-vetzuren, n-3-vetzuren bij voldoende hoge inname van zijn potentieel krachtige anti-inflammatoire middelen. De anti-inflammatoire werking van n-3 vetzuren rechtstreeks gemedieerd door vervanging van arachidonzuur als eicosanoïden substraat remmen arachidonzuurmetabolisme en indirect door wijziging van proinflammatory genexpressie en cell signaling. De n-3-vetzuren aanleiding geven ook resolvins, een familie van anti-inflammatoire mediatoren. Hoge inname van n-3-vetzuren is geassocieerd met een daling van de productie van pro-inflammatoire eicosanoïden, cytokinen, chemokinen, reactieve zuurstofspecies en expressie van adhesiemoleculen. In dit onderzoek werden ratten ad libitum diëten identiek in alle nutriënten behalve vetzuren, met als percentage energie uit vet, 20% SO, 20% CO, 18% visolie plus 2% saffloerolie (FO) 10-11 . Als percentage van de dagelijkse energiebehoefte, de SO dieet verstrekt 15% linolzuur (LA), met <0,06% α-linoleenzuur (ALA) en geen eicosapentaeenzuur (EPA) en docosahexaeenzuur (DHA), de CO dieet had 4,2 LA% en 1,9% ALA zonder EPA of DHA, en de FO dieet verstrekt 1.4% EPA, DHA 4,9%, 0,32% LA, en 0,12% ALA. Drie weken na aanvang van de lipide diëten werden de muizen waaraan intrarectale DNBS of 50% ethanol en 5 dagen later opgeofferd. De inflammatory respons werd geëvalueerd door beoordeling van gewichtsverlies, histologische beschadiging scores en weefsel myeloperoxidase activiteit.
De DNBS model beschreven in dit protocol is een waardevol, goedkoop en reproduceerbaar colitis model dat kan worden gebruikt om verschillende aspecten van IBD bestuderen. Wanneer intrarectaal toegediend aan ratten of muizen, DNBS induceert een aanzienlijke mate van ontsteking en weefselbeschadiging in de dikke darm, de ziekte lijkt op humane Crohn in termen van verschillende histologische kenmerken zoals transmurale infiltratie van polymorfonucleaire cellen en overheersende NF-kB-afhankelijke activatie Th1.
<p class…The authors have nothing to disclose.
Dit werk werd ondersteund door exploitatiesubsidies voor KJ van het Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC) en de Crohn en Colitis Foundation of Canada (CCFC). VM wordt ondersteund door een CFRI Fellowship en GB een afgestudeerde studententijd van de Canadese Institutes for Health Research (CIHR). BAV is een Kinderen met darm-en leveraandoeningen Foundation (KIND) voorzitter van Pediatric IBD Research en de Canada Research Chair in Pediatric Gastroenterology en KJ is een Senior Scientist clinicus ondersteund door Kind en Kind en Gezin Research Institute (CFRI) clinicus Scientists Award Program , University of British Columbia.
1 mL syringe | BD Biosciences | 309659 | |
19 gauge needle | BD Biosciences | 305187 | |
Polyethylene tubing PE-50 | BD Biosciences | 427517 | for intra-rectal administration in mice |
Polyethylene tubing PE-90 | BD Biosciences | 427519 | for intra-rectal administration in rat |
DNBS | MP Bio | 150959 | |
tear gel | Novartis | 63601662596 | |
10% Formalin | Fisher | 5F93-4 | |
warming pad | Kent Scientific | TPZ-0510 | |
Ethanol | Fisher | A-962.4 | |
hexadecyltrimethyl-ammonium bromide | Sigma-Aldrich | H5882 | |
Potassium phosphate buffer solution | Sigma-Aldrich | 79628- | |
O-dianisidine dihydrochloride | Sigma-Aldrich | D3252 | |
30% H2O2 | Sigma-Aldrich | 31642 | hydrogen peroxide |
Spectrophotometer | BIORAD | Benchmarker Plus | |
Light Microscope | Zeiss | Axio Image.Z1 | |
Data analysis software program | GraphPad Software | GraphPad Prism Software Version 4.00 | San Diego California USA, www.graphpad.com |