Summary
DNBS / TNBS colitis biedt een alternatieve en goedkope methode om de pathobiology van ontstekingsdarmziekte bestuderen. Het protocol besproken in dit document schetst de succesvolle toepassing van DNBS om colitis te induceren bij muizen en ratten en maakt het mogelijk om grondig te bestuderen host-mediated intestinale reacties.
Abstract
Inflammatoire darmziekten (IBD), zoals ziekte van Crohn en colitis ulcerosa, zijn lang geassocieerd met een genetische basis, en meer recent systeem immuunresponsen op microbiële en milieufactoren. Dinitrobenzeen sulfonzuur (DNBS)-geïnduceerde colitis maakt het mogelijk om de pathogenese van IBD bijbehorende milieu-triggers, zoals stress en voeding, de effecten van mogelijke therapieën, en de onderliggende mechanismen van darmontsteking en mucosale letsel bestuderen. In dit artikel, onderzochten we het effect van dieet n-3 en n-6-vetzuren aan de dikke mucosale ontstekingsreactie op DNBS-geïnduceerde colitis bij ratten. Alle ratten werden gevoed identieke dieet met uitzondering van verschillende vetzuren [saffloerolie (SO), canolaolie (CO) of visolie (FO)] gedurende drie weken voorafgaand aan blootstelling aan intrarectale DNBS. Controle ratten gegeven intrarectale ethanol bleef het verkrijgen van gewicht op de 5 daagse studie, terwijl, DNBS-behandelde ratten gevoed lipide diëten al lost gewicht met FO-en CO-gevoede ratten aantonen significant gewichtsverlies met 48 uur en ratten SO gevoed door 72 uur. Gewichtstoename hervat na 72 uur na DNBS en met 5 dagen na DNBS, de FO groep had een hoger lichaamsgewicht dan SO of CO-groepen. Colon secties verzameld 5 dagen na DNBS-behandeling bleek focale zweren, crypte vernietiging, drinkbeker cel depletie, en mucosale infiltratie van zowel acute als chronische inflammatoire cellen die verschilden in ernst tussen groepen dieet. De SO gevoed groep toonde de meest ernstige schade, gevolgd door de CO, en FO gevoed groepen die de mildste mate van weefselbeschadiging toonde. Evenzo colon myeloperoxidase (MPO)-activiteit, een marker van neutrofiel activiteit was significant hoger in SO gevolgd door CO gevoede ratten met FO gevoede ratten met significant lagere MPO activiteit. Deze resultaten tonen het gebruik van DNBS-geïnduceerde colitis, zoals beschreven in dit protocol, om de impact van voeding bij het ontstaan van IBD te bepalen.
Introduction
Inflammatoire darmziekte (IBD) wordt gekenmerkt door chronische recidiverende ontsteking in de gastro-intestinale (GI) stelsel, waardoor de symptomen van diarree, gewichtsverlies en buikpijn. Colitis ulcerosa (UC) en de ziekte van Crohn (CD) zijn de twee belangrijkste vormen van IBD, en kan worden onderscheiden door de plaats van de ontsteking in het maagdarmkanaal. Bij UC patiënten, de ontsteking meestal gaat het rectum en strekt aansluitend de colon een variabele mate die slechts oppervlakkig slijmvlies. Daarentegen kan CD elk deel van het spijsverteringskanaal beïnvloeden, hoewel treft vooral het ileum en caecum. CD manifesteert vaak als transmurale ontsteking vaak geassocieerd met granulomen en leidt tot stricturing (fibrostenotic) en / of doordringen (fistels) ziekte. Hoewel de etiologie van IBD blijft ongrijpbaar, is het algemeen geaccepteerd dat IBD is multifactorieel, waarbij interacties tussen de gastheren immuunsysteem, genetische gevoeligheid en verantses om milieu-en microbiële factoren.
Tot op heden zijn verschillende modellen van IBD voorgesteld dat verscheidene klinische, histologische en immuunresponsen kenmerkend UC en CD is. De meest gebruikte modellen zijn voorzien van genetisch gemodificeerde muizen (IL-2, IL-10, SAMP / Yit), infectie geïnduceerde modellen (Citrobacter rodentium, Salmonella typhimurium), adoptieve overdracht modellen (CD45 + RB Hoog, CD62L + cel overdracht in SCID muizen) en chemisch geïnduceerde colitis modellen (dextran natrium sulfaat (DSS), trinitrobenzeen sulfonzuur (TNBS) en Dinitrobenzeen sulfonzuur (DNBS)). Vanwege hun lage kosten en snelle aanvang van de ziekte, zijn chemische modellen van onschatbare waarde voor de studie van diverse aspecten van IBD overwogen. Elk van de chemische colitis modellen vermeld heeft voordelen en beperkingen in een aantal aspecten van hun klinische, immunologische en histopathologische relevantie voor IBD. DSS is een van de meest voorkomende chemische middelen om coli inducerentis bij knaagdieren 1. Toediening van 3-10% DSS (MW: 42 kDa) voor 7-10 dagen in het drinkwater van muizen kan symptomen van colitis, waaronder gewichtsverlies, diarree met bloed, colon verkorten, mucosale ulceratie en infiltratie van neutrofielen induceren. Dit model is vooral handig voor drug discovery studies, evenals het verkennen van de mechanismen van epitheliale regeneratie, de impact van aangeboren immuniteit op mucosale homeostase, en de rol van ontsteking in het bevorderen van intestinale dysplasie en adenocarcinoom ontwikkeling. Er zijn echter enkele nadelen aan de DSS-model, zoals variatie van de concentratie van DSS nodig colitis te induceren in verschillende dierlijke faciliteiten, en inconsistente wateropname bij muizen en dus niet verenigbaar blootstelling aan DSS, waardoor variatie in de mate, omvang en verdeling van mucosale schade en ulceratie van de colon. Al deze kenmerken leiden tot heterogeniteit van de resultaten en beperken het vermogen om resultaten te vergelijken tussen studies frOM verschillende onderzoeksgroepen.
Een alternatief voor de DSS-model is het hapteen-geïnduceerde DNBS of TNBS model van colitis. Dit model maakt gebruik van rectale toediening van de mucosale sensibiliserende stoffen DNBS of TNBS, verdund in wisselende concentraties van ethanol. De toediening van ethanol is een voorwaarde voor het colon mucosale barrière te breken om de penetratie van DNBS of TNBS toe in de lamina propria. DNBS / TNBS dan haptenize de gelokaliseerde dikke darm en microbiële eiwitten immunogeen worden, zodat daardoor de gastheer aangeboren en adaptieve immuunreacties. In het algemeen wordt dit model geassocieerd met ernstige en soms bloederige diarree, gewichtsverlies en darmwand verdikking echter symptomen variëren afhankelijk van het type van knaagdieren gebruikt, evenals de timing, dosering en de mate van blootstelling aan de DNBS of TNBS in de studie. Belangrijke verschillen tussen ratten en muizen dient te worden opgemerkt, met de voordelen van lagere kosten voor de aankoop en karton, alsmede Lower lichaamsmassa voor het verminderen van per-dier kosten van een behandeling in vivo. Dit moet worden afgezet tegen de meer snel en ernstig verloop van colitis in muizen, waar de meer kwetsbare en responsieve dieren snel een humaan eindpunt kan bereiken.
De intestinale ontsteking oorspronkelijk resultaten uit ethanol geïnduceerde beschadiging darmepitheelcellen, wat leidt tot verhoogde epitheliale permeabiliteit microbiële penetratie in de mucosa, haptenization van gastheereiwitten, dit alles leidt tot infiltratie van neutrofielen, macrofagen en T-lymfocyten Th1 naar de beschadigde mucosa. In vergelijking met DNBS, wordt TNBS beschouwd als een gevaarlijk chemisch vanwege de sterk oxidatieve eigenschappen die een gevaar voor ontploffing bij contact met basen zoals natrium en kalium hydroxide kan opleveren. Daarom DNBS wordt momenteel beschouwd als een voorkeur van chemische dan TNBS colitis veroorzaken. Bij knaagdieren DNBS colitis wordt beschouwd als een van de meest geschikte methoden om de vol bestuderenvleugel IBD geassocieerd modifiers van de ziekte:
- Depressie en reactivering van colitis: Aangetoond is dat stress, angst en depressie bij IBD patiënten vaak geassocieerd met de ziekte terugval. DNBS colitis is een geschikt model om de rol van depressie en de gevolgen zijn op reactivering van colitis in muizen. Bij deze methode wordt meestal initiële inductie van colitis door DNBS, gevolgd door de resolutie van de colitis door het verlaten van de muizen gedurende 6-8 weken. De muizen worden vervolgens toegediend met een depressie veroorzaken van middelen zoals reserpine of door olfactorische bulbectomy tot depressie, gevolgd door het testen van hen voor reactivering van colitis door uitdaging met een subcolitic dosis DNBS 2 induceren.
- Stress en reactivering van colitis: Stress is andere omgevingsfactor die is verbonden met IBD pathogenese. Er is een groeiende hoeveelheid bewijsmateriaal dat een sterke associatie tussen chronische stress en het begin van de symptomen van UC en CD in knaagdieren suggereerts en bij mensen en niet-humane primaten 3. DNBS ulcerosa is een goed model om stress geassocieerd reactivering van colitis studeren in zowel muizen en ratten. De werkwijze wordt gewoonlijk in een soortgelijke wijze als hierboven voor depressie behalve in plaats van depressie, worden de dieren blootgesteld aan stressoren zoals sonische en onderdrukte stress 4.
- Neurogene ontsteking: Een aantal studies hebben ofwel tijdelijke of permanente wijzigingen beschreven in het enterische zenuwstelsel (ENS) structuur en functie, zoals te zien in weefselmonsters van diermodellen en patiënten met IBD. DNBS is een goed model om de gevolgen van ontsteking op de ENS 5 staand en zowel noradrenerge en cholinerge zenuwbanen 6 bestuderen.
- Letsel-herstelmechanismen: Tijdens IBD pathogenese, gastheer afkomstig schade mediatoren zoals reactieve zuurstofsoorten (ROS), stikstofoxide (NO), intercellulaire adhesie molecuul 3 (ICAM-3), en P-selectine zijn allemaal aangetoond dat plag een rol in het intestinale epitheliale verstoring. DNBS is een uitstekend model voor verwondingen veroorzaakt door de up-regulatie van deze mediatoren en mechanismen repareren die worden gereguleerd door het gebruik van selectieve geneesmiddelen of remmers 7,8 bestuderen.
- Transmurale ontsteking: Naast de bovengenoemde toepassingen van DNBS het model kan ook worden toegepast op transmurale darm, een klassieke functie in patiënten met CD bestuderen. Zowel DNBS en TNBS-geïnduceerde colitis geassocieerd met significante infiltratie van lymfocyten in het colon mucosa waardoor deze modellen bijzonder bruikbaar voor T-cel afhankelijke immuun mechanismen te bestuderen.
In vergelijking met de DSS-model, de voordelen van DNBS en TNBS-geïnduceerde colitis zijn lage kosten, snelle ontwikkeling van colitis (vereist gewoonlijk 1-3 dagen reproduceerbare zweren en ontstekingen tonen) en consistent gelokaliseerde schade aan de distale colon. Maar de nadelen zijn een vereiste voor eenhoger niveau van technische expertise, optimalisering van DNBS / TNBS dosis, en de noodzaak voor anesthesie voor rectale toediening.
In deze methodologische paper bestudeerden we de effecten van verschillende concentraties van n-6 en n-3 meervoudig onverzadigde vetzuren op wijziging van de colon mucosale respons op DNBS-geïnduceerde colitis bij ratten met plantaardige oliën saffloerolie (SO) en canola-olie (CO) en visolie (FO). Het is aangetoond dat n-6 en n-3 vetzuren zijn belangrijke mediatoren van intestinale ontstekingsziekte door hun rol als acylgroepen van celmembraan phosopholipids 9. In tegenstelling tot de pro-inflammatoire potentieel van n-6-vetzuren, n-3-vetzuren bij voldoende hoge inname van zijn potentieel krachtige anti-inflammatoire middelen. De anti-inflammatoire werking van n-3 vetzuren rechtstreeks gemedieerd door vervanging van arachidonzuur als eicosanoïden substraat remmen arachidonzuurmetabolisme en indirect door wijziging van proinflammatory genexpressie en cell signaling. De n-3-vetzuren aanleiding geven ook resolvins, een familie van anti-inflammatoire mediatoren. Hoge inname van n-3-vetzuren is geassocieerd met een daling van de productie van pro-inflammatoire eicosanoïden, cytokinen, chemokinen, reactieve zuurstofspecies en expressie van adhesiemoleculen. In dit onderzoek werden ratten ad libitum diëten identiek in alle nutriënten behalve vetzuren, met als percentage energie uit vet, 20% SO, 20% CO, 18% visolie plus 2% saffloerolie (FO) 10-11 . Als percentage van de dagelijkse energiebehoefte, de SO dieet verstrekt 15% linolzuur (LA), met <0,06% α-linoleenzuur (ALA) en geen eicosapentaeenzuur (EPA) en docosahexaeenzuur (DHA), de CO dieet had 4,2 LA% en 1,9% ALA zonder EPA of DHA, en de FO dieet verstrekt 1.4% EPA, DHA 4,9%, 0,32% LA, en 0,12% ALA. Drie weken na aanvang van de lipide diëten werden de muizen waaraan intrarectale DNBS of 50% ethanol en 5 dagen later opgeofferd. De inflammatory respons werd geëvalueerd door beoordeling van gewichtsverlies, histologische beschadiging scores en weefsel myeloperoxidase activiteit.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Procedures waarbij proefdieren volgen dierverzorging richtlijnen door de Institutional Animal Care en gebruik Comite (IACUC) aan de Universiteit van British Columbia geschetst.
In dit protocol genoemde procedures worden beschreven voor zowel ratten als muizen, terwijl de representatieve resultaten van Sprague-Dawley ratten worden gepresenteerd.
1. Voorbereiding van DNBS en intrarectale Administration
- Voor rectale indruppelen van DNBS bij ratten, vers bereiden 15-30 mg DNBS/250 ul van 50% ethanol. Voor muizen, bereiden 2-6 mg DNBS/100 pl 50% ethanol. Opmerking: Optimaliseer de exacte DNBS concentratie bij elke faciliteit te worden toegediend. Mannelijke Sprague-Dawley ratten, en C57BL / 6 muizen hebben de voorkeur voor inductie van DNBS colitis, maar andere muis en rat stammen kunnen worden gebruikt. Muizen en ratten behandeld met alleen 50% ethanol kan als controlegroepen gegeven maar de effecten van ethanol zijn mild of afwezig zijn, kan omit de opneming van deze groep voor een studie 12.
- Bevestig een 1 ml spuit met een 19 G naald die een polyethyleen katheter (PE-90 - ratten of PE-50 - muizen) bevestigd aan het einde.
- Licht verdoven de rat of muis rusten op een verwarmingselement (bijvoorbeeld door het toedienen van 1,5% isofluraan via neuskegel, moeten de dieren nog steeds knipperen en slikken reflexen en weer regelmatig ademhaling). Solliciteer traan gel om de ogen voor de ogen te vermijden uitdrogen.
- Voorzichtig passen druk met de vingertoppen op het achterste uiteinde van het dier aan een kruk die in de distale dikke darm te verwijderen.
- Duw de katheter intrarectaal, met de catheter bereiken ongeveer 8 cm proximaal van de anus voor ratten, of 3-4 cm voor muizen. Injecteer een kleine hoeveelheid van de oplossing bij het inbrengen van de katheter te smeren, waardoor gemakkelijker inbrengen. Opmerking: Als een weerstand voelt bij het inbrengen van de katheter, ga dan niet verder in te voegen, omdat dit kan leiden tot perforatie vande darmwand. Verwijder de katheter en probeer er zachtjes teruggeplaatst, opnieuw smeren van de dikke darm als procedure.
- Injecteer langzaam 250 (ratten) of 100 (muizen) gl DNBS, of een gelijk volume of 50% ethanol controles. Na het injecteren van de DNBS, plaatst het dier hoofd naar beneden gedurende 90 seconden om het verlies van de DNBS voorkomen.
- Na DNBS administratie, voeren van de dieren 8% sucrose water in 0,2% zoutoplossing om uitdroging tijdens de eerste week te voorkomen.
- Let zorgvuldig op de dieren, met dagelijkse controle voor gewichtsverlies en uitdrogingsverschijnselen of nood voor de duur van het experiment. Opmerking: Gewichtsverlies kan snel naderen de CCAC aanbevelingen van het maximaal toegestane gewicht te verliezen. Aangezien dit meestal afkomstig van uitdroging, gewichtsverlies moet worden gebruikt als een indicator voor het toedienen van Ringer lactaat om uitdroging te beperken. Zorg ervoor dat u overleggen met de faciliteit dierenarts over gezondheidskwesties als passend.
2. Collecting Weefsels en beoordelen van histologische schade in DNBS Uitgedaagd Muizen
- Op het gewenste tijdstip na challenge met DNBS, euthanaseren dieren door overdosering met isofluraan in een verdovingsmiddel kamer aangevuld met voldoende zuurstof. Observeer het dier tot er geen stijgende of dalende van de borst wordt gezien en er is geen tastbaar hartslag. Bevestig het dier correct is gedood door de afwezigheid van een respons op teen knijpen of aanraken van het hoornvlies, gevolgd door cervicale dislocatie.
- Open de buikholte en verwijder de gehele dikke darm. Open de darm longitudinaal; macroscopische mucosale ulcus ongeveer 5-6 cm proximaal van het distale einde van de dikke darm bij ratten (2-3 cm in muizen) worden waargenomen. Opmerking: Na het verwijderen van de dikke darm, macroscopische schade scores beoordelen indien gewenst. Verzamel segmenten van de dikke darm van overeenkomstige anatomische locatie van controle dieren. Opmerking: De personen scoren het weefsel voor macroscopische schade scores moetenverblind de identiteit van de behandelingsgroepen. Score weefselsecties met de volgende of soortgelijke criteria: ernst en omvang van ulceratie (0-10), gesommeerd met scores of afwezigheid van diarree (0 of 1), adhesies (0, 1, of 2) en maximaal dikke wanddikte in millimeters 11.
- Verzamel 0,5 cm gedeelten proximaal van de plaats van maximale macroscopische schade. Snap een 0,5 cm doorsnede in vloeibare stikstof te bevriezen om later te beoordelen myeloperoxidaseactiviteit (MPO) (een maat voor de infiltratie van neutrofielen), en plaats de andere afdeling in 10% neutraal gebufferde formaline voor histologische analyse. Opmerking: snel bevroren weefsel voor myeloperoxidase test kan worden opgeslagen bij -80 ° C gedurende 1 maand.
- Laat de verzamelde voor histologische analyse in stap 2.3 weefsels te repareren in formaline s nachts, en daarna wassen met 70% ethanol. Embed weefsels in paraffine en gesneden tot de gewenste dikte (3-5 micrometer), vlek met hemotoxyline en eosine (HE) voor histologische scoren. Hebben twee waarnemers scoren ten minste drie coupes uit elk dier onder een lichtmicroscoop het histologische schade scores voor elke groep te bepalen. Opmerking: De personen maken het weefsel op histologische schade scores worden verblind de identiteit van de behandelingsgroepen. Score weefselsecties met de volgende of soortgelijke criteria: omvang van ontstekingscelinfiltraat (0 = afwezig, 3 = transmurale), verlies van mucosale architectuur (0 = afwezig, 3 = ernstig), aanwezigheid of afwezigheid van crypte abcessen (0-1) , en beker cel depletie (0-3). Bepaal histologische schade score als de som van deze scores 11.
3. Het uitvoeren Myeloperoxidase (MPO) Assay op DNBS Uitgedaagd darmweefsel
- Assay MPO activiteit in de 0,5 cm dikke segmenten verkregen in stap 2.3. Homogeniseer weefsel in MPO homogenisatiebuffer (0,5% hexadecyltrimethyl ammonium bromide in 50 mM kaliumfosfaatbuffer (pH 6,0)) naar 50 mg colon segme gevennt / ml homogenisatiebuffer suspensie.
- Aliquot de gehomogeniseerde oplossing in 1 ml porties en centrifugeer bij 4 ° C gedurende 2 min bij 10.000 x g.
- Meng 100 pl elk aliquot 2,9 ml 50 mM fosfaatbuffer (pH 6,0) die 0.167 mg / ml o-dianisidinedihydrochloride en 0,0005% waterstofperoxide in een cuvet.
- Meet de snelheid van absorptie met behulp van een spectrofotometer bij 460 nm. Opmerking: MPO activiteit gedefinieerd als de hoeveelheid enzym afbrekende 1 umol / min H 2 O 2 H 2 O bij kamertemperatuur en wordt uitgedrukt in eenheden per mg weefsel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Uitdaging van ratten (Sprague-Dawley) of muizen (C57BL / 6) met DNBS resulteert typisch in voorbijgaande gewichtsverlies en diarree, soms met bloed in de ontlasting. Echter, factoren zoals genetica, dieet en de darmflora gevoeligheid wijzigen om DNBS geïnduceerde colitis. Daarom dieren opgenomen in de experimenten moet worden van dezelfde instelling, ofwel afgeleid lokaal of besteld bij een dier leverancier. Alle dieren moeten zorgvuldig worden gecontroleerd op de mate van gewichtsverlies en verschijnselen van ongerief tijdens colitis.
De in figuren 1-4 resultaten vormen een experiment waarin het effect van dieet drie oliën: saffloerolie, canolaolie, visolie en de resulterende ernst van DNBS colitis werden beoordeeld. Statistische verschillen tussen groepen werden bepaald met behulp van ANOVA gevolgd door post hoc Tukey's test, met behulp van een data-analyse software programma. AP waarde van <0,05 werd consischouwd significant.
Na intrarectale provocatie met DNBS (20 mg DNBS/250 pl 50% ethanol) werd significant gewichtsverlies waargenomen met 48-uur in ratten aangevuld met FO en CO en 72 uur bij ratten aangevuld met SO (P <0,05). Maximaal gewichtsverlies wordt gezien bij 48 uur bij ratten aangevuld met FO en door 72 uur bij ratten aangevuld met CO en SO. Gewichtstoename hervat na 72 uur, en met 5 dagen na DNBS, FO en SO groepen tonen lichaamsgewicht gelijk aan de uitgangswaarden. Controle ratten aangevuld met de diëten en uitgedaagd met intrarectale ethanol blijven om gewicht te krijgen over de 5 dagen studieperiode.
De intestinale schade door DNBS kan gebruikt is maar het gebied van maximale schade algemeen gelokaliseerd aan de distale 6 cm van de dikke darm bij ratten, en het distale 3 cm bij muizen zijn. Macroscopisch kan worden waargenomen als dikke verdikking, mucosale ulceratie en occasionele hechting van de distal colon naar aangrenzende organen, zoals de blaas. Bij nadere histologische evaluatie, uitgebreide epitheliale letsel, in sommige gebieden leiden tot de vorming van maagzweren, immuun cel infiltratie (voornamelijk neutrofielen en lymfocyten), cryptitis, slijm uitputting, en oedeem is waargenomen. Hoewel deze histologische tekenen van ontsteking en weefselbeschadiging zijn duidelijk in alle drie dieet olie aangevuld groepen op provocatie met DNBS, de meest ernstige schade gezien in de saffloerolie groep, gevolgd door de canolaolie groep, terwijl ratten in de visolie groep tonen minimale epitheliale schade en een beperkte infiltratie van inflammatoire cellen in de mucosa (figuur 2).
Verschillen in histologische schade kan worden gekwantificeerd, zodat een betere vergelijking tussen de groepen. Criteria voor histologische schade te beoordelen onder meer de omvang van ontstekingscelinfiltraat, verlies van mucosale architectuur, drinkbeker cel depletie, en de aanwezigheid van crypt abcessen. Figuur 3 zijn de histologische schade scores voor de drie groepen voeding olie tijdens DNBS colitis. Zoals wordt gezien in de H & E gekleurde coupes in figuur 2, het saffloerolie aangevuld groep de grootste omvang van de schade, gevolgd door de canolaolie groep, terwijl de visolie weergeven niet de minste beschadiging.
De omvang van ontstekingscelinfiltraat, met name neutrofielen, kan verder door het uitvoeren van een myeloperoxidase (MPO)-activiteit assay onderzocht. MPO wordt beschouwd als een marker van ontsteking, zoals een enzym dat in de granules van neutrofiele granulocyten en andere cellen van myeloïde afkomst. Beoordeling van MPO-activiteit in de dikke darmen ratten op dag 5 na blootstelling DNBS onthult een toename van de activiteit in alle drie groepen (figuur 4). Het grootste MPO activiteit waargenomen in de saffloerolie groep, gevolgd door de canolaolie groep, terwijl de laagste MPO activiteit gezien in devisolie groep corresponderend met de histologische scores schade beoordeeld in figuur 3.
Figuur 1. Veranderingen in lichaamsgewicht (% van de uitgangswaarde) na intrarectale toediening van 50% ethanol (controle) of dinitrobenzeen sulfonzuur (DNBS) bij volwassen vrouwelijke Sprague-Dawley ratten (250-500 g) gevoed SO, CO, of FO. De ratten zijn vervolgens gecontroleerd voor het verlies van lichaamsgewicht van dag 1 tot dag 5 na de behandeling. De procentuele verlies van het lichaamsgewicht is uitgezet tegen dagen na DNBS behandeling. Waarden zijn gemiddelden ± SEM, n = 5 / groep. In vergelijking met niet-DNBS behandelde tegenhangers, ratten gevoed met CO en FO een significante vermindering van hun oorspronkelijke lichaamsgewicht al op dag 1 na behandeling DNBS dat op dag 3 alle drie groepen ratten gesnificant gewichtsverlies betrekking tot basislijn gewicht (P <0.01). Alle colitis groepen demonstreren gewichtstoename na 72 uur, met het gewicht terug te keren naar de uitgangssituatie in de FO en SO gevoed groepen. Ratten in de ethanol controlegroepen aantonen gewichtstoename over de 5 dagen studieperiode. Klik hier voor grotere afbeelding .
Figuur 2. Histologische verschijning van representatieve H & E gekleurde dikke coupes 5 dagen na intrarectale toediening van 50% ethanol (CTL) of DNBS om volwassen vrouwelijke ratten gevoed SO, CO, of FO. Het weefsel wordt in 10% formaline verzameld en toegestaan om vast te stellen voor een minimum van 24 uur gevolgd door weefsel snijden en HE kleuring. Decoupes van ratten SO gevoed en CO tonen significante verstoring van epitheliale integriteit met variërende mate van epitheliale schade, crypte drop-out, de vorming van maagzweren en transmurale immuun cel infiltratie, met meer uitgesproken veranderingen gezien met SO. In CO gevoede muizen, is het bewijs van epitheliale regeneratie en herstel gezien. Daarentegen ratten gevoed FO onderhouden epitheliale integriteit en had beperkte infiltratie van ontstekingscellen beperkt tot de lamina propria. (M-slijmvlies, SM-sub-slijmvlies en U-zweren; oorspronkelijke vergroting 100X; schaal bar: 100 pm). Klik hier voor grotere afbeelding .
Figuur 3. Histologische schade score van colon weefsels 5 dagen perfter intrarectale toediening van 50% ethanol (clear bar) of DNBS (vaste bar) tot volwassen vrouwelijke ratten gevoed SO, CO, of FO. Weefselsecties worden gescoord door een ervaren onderzoeker, blind voor de behandelingen, met behulp van een reeks criteria, gebaseerd op histologische beschadiging. De in deze studie gebruikte criteria omvat: infiltratie van ontstekingscellen (0 = afwezig, 3 = transmurale), verlies van mucosale integriteit (0 = afwezig, 3 = ernstig), crypte abcesvorming (0 = afwezig, 1 = aanwezig) beker celdepletie (0 = afwezig, 3 = hoog). De histologische schade score wordt bepaald als de som van de scores verkregen door het scoren van een minimum van drie coupes van elk dier. De resultaten tonen duidelijk aan een verminderde histologische schade in FO-gevoede ratten in vergelijking met SO-en CO-gevoede ratten. Waarden zijn gemiddelden ± SEM, n = 5 / groep. Vergeleken met respectieve controles ethanol wordt DNBS toediening gepaard met een aanzienlijke toename van de schade score (p <0,05), colitis groepen met verschillende symbolen zijn significant verschillend (P <;. 0.01) Klik hier voor grotere afbeelding .
Figuur 4. MPO activiteit in colon weefsel 5 dagen na intrarectale toediening van 50% ethanol (clear bar) of DNBS (vaste bar) aan volwassen vrouwelijke ratten gevoed SO, CO of FO. Ontstoken colon weefsels worden snel bevroren in vloeibare stikstof en geanalyseerd op myeloperoxidase activiteit , als een index van granulocyten infiltratie. Colitic ratten gevoed FO tonen verkorte MPO activiteit vergeleken met SO en CO Waarden zijn gemiddelden ± SEM, n = 5 / groep. Vergeleken met respectieve controles ethanol wordt DNBS toediening gepaard met een aanzienlijke toename van MPO-activiteit (p <0,001), colitis groepen met verschillende symbolen significantly verschillend (P <0,05). Klik hier voor grotere afbeelding .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De DNBS model beschreven in dit protocol is een waardevol, goedkoop en reproduceerbaar colitis model dat kan worden gebruikt om verschillende aspecten van IBD bestuderen. Wanneer intrarectaal toegediend aan ratten of muizen, DNBS induceert een aanzienlijke mate van ontsteking en weefselbeschadiging in de dikke darm, de ziekte lijkt op humane Crohn in termen van verschillende histologische kenmerken zoals transmurale infiltratie van polymorfonucleaire cellen en overheersende NF-kB-afhankelijke activatie Th1.
Dit model is gebruikt om verschillende factoren gedacht beïnvloeden IBD zoals stress, depressie en voeding, en zich verbindt enterische zenuwstelsel, schade-herstelmechanismen, transmurale ontsteking en preklinische therapieën bestuderen. Het DNBS model is ook geschikt alternatief voor TNBS-geïnduceerde ontsteking bij muizen en ratten en een minder duur alternatief voor andere algemeen gebruikte chemische modellen van colitis zoals DSS. De stappen in dit pROTOCOL zal mogelijk maken om dit model succesvol uit te voeren.
Consistent met andere experimentele modellen van colitis 13-16, de huidige studie versterkt de variabele effecten van vet in de voeding op de intestinale mucosale immuunrespons waar hoge inname van EPA en DHA verbruikt voorafgaand aan en na de blootstelling DNBS verzwakt, terwijl de hoge inname van ARA met minimale n -3 vetzuren verergert de colitis. De gunstige effecten van dieet n-3-vetzuren in deze studie zijn deels te wijten aan n-3-vetzuren effectief onderste weefsel fosfolipide ARA zowel door remming van synthese van ARA van LA en ARA te vervangen door EPA en DHA. Deze verandering verschuift de vetzuursubstraat beschikbaar voor release en de daarna eicosanoïde synthese naar een minder pro-inflammatoire omgeving. Daarentegen is de hoge inname van n-6-vetzuren met een hoog colon ARA latere synthese van pro-inflammatoire mediatoren die mucosale immuunrespons verergeren. In keepinG met onze recente studie Citrobacter rodentium colitis, ratten koolzaadolie met minder dan ARA saffloerolie, maar met n-3 ALA en geen EPA of DHA had een tussenproduct ontstekingsreactie 16.
Er zijn een aantal cruciale stappen die gevolgen kunnen hebben voor de succesvolle implementatie van de DNBS model. Verschillende studies hebben verschillende concentraties van DNBS variërend gebruikte 3-6 mg / muis of 15-30 mg / rat aan colitis vestigen. Daarom is het belangrijk dat individuele onderzoekers de dosering van DNBS optimaliseren hun studie, omdat de optimale dosering kan variëren van een dierenverblijf naar de andere. Het is ook belangrijk op te merken dat de concentratie van DNBS zal verschillen afhankelijk van het type en de soort dier dat een onderzoeker wordt gebruikt (bijv. bepaalde stammen kunnen gevoeliger en anderen beter bestand tegen DNBS). Men dient ervoor te zorgen dat de concentratie van DNBS niet te hoog Dit kan het snelle dood van de dieren automalting van darmperforatie en sepsis. Een andere belangrijke stap om middels dit model ontwikkelt de juiste methode voor intrarectale katheter ingebracht in het distale colon van het dier. De aanwezigheid van ontlasting in de dikke darm tijdens instillatie voldoende inbrengen van de katheter te voorkomen. Om dit te vermijden, oefen zachtjes druk uit op het achterste einde van de anus van lichtjes verdoofd muizen aan een krukje in het distale colon / rectum te verwijderen. Het wordt aanbevolen om de katheter ongeveer 3-4 cm van de anus in te voegen, hoewel het kan worden verlengd tot een maximum van 6-8 cm bij ratten tot de milt buiging (een scherpe bocht tussen dwars-en colon descendens) 7. Het is belangrijk op te merken dat tijdens de instillatie procedure smeren de katheter door het injecteren DNBS / ethanol in kleine volumes gemakkelijker inbrengen van de katheter mogelijk. Om de retrograde reflux van DNBS uit de anus voorkomen, is het essentieel om de dieren te houden op een hoofd omlaag voor 90 seconden of anders demuizen kunnen gedurende 15 minuten worden bewaard in de Trendelenburg positie (een liggende positie waar de voeten hoger dan het hoofd worden geplaatst door 15-30 °).
Weefsels kan worden verzameld op geselecteerde tijdstippen, afhankelijk van de belangen van de onderzoeker en of de studie is gericht op acute of chronische ontsteking. Bovendien kan het weefsel ook worden gebruikt om de intestinale ENS en aangeboren en adaptieve immuunsysteem bestuderen. Het is echter essentieel dat weefsels goed worden bemonsterd. Het wordt aanbevolen om de weefsels in een ruime hoeveelheid 10% formaline verzamelen in een 5 ml flacons tegenover kleiner volume flacons voor een goede bevestiging te garanderen. Geschikte fixatie van monsters is een belangrijk zowel de histopathologische schade en visualisatie van doelmoleculen in weefsels door H & E en immunokleuring respectievelijk bestuderen. Histologische scoren van weefsels moeten worden uitgevoerd door ervaren mensen die verblind om de experimentele omstandigheden, met behulp van vastgestelde criteria door t ingesteldhij individuele onderzoeker 11,17. Myeloperoxidase (MPO) dient als een goede marker van ontsteking, weefselbeschadiging en neutrofiele infiltratie in gastrointestinale weefsel 11. De MPO assays, wordt voorgesteld om snap bevriezen de weefsels in vloeibare stikstof en op de dag van de analyse, wordt aanbevolen om met vers bereide buffers en oplossingen voor de beste en meest nauwkeurige resultaten te verkrijgen. Dit model kan ook worden gebruikt om inflammatoire cellen die de darm infiltreren, betrokken bij chemotaxis en transmigratie van ontstekingscellen en de verschillende wegen betrokken bij de activering en afgifte van andere pro-inflammatoire mediatoren betrokken bij weefselbeschadiging als mediatoren betrokken zijn bij het moduleren ondrzoeken de ontstekingsreactie en weefselherstel.
De klinische nadelen nog gezien met behulp immunosuppressiva of gericht op een pro-inflammatoire cytokine zoals TNF-α moet investig bevorderenATORS tot betere therapeutische strategieën om patiënten met IBD te beheren. Modellen, zoals de DNBS model, kunnen onderzoekers inzicht in de pathogenese van IBD verhogen, mogelijk de identificatie van nieuwe therapeutische targets en het ontwikkelen / verbeteren van strategieën om ontsteking te controleren door het gebruik van nieuwe ontstekingswegen en nieuwe therapieën.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door exploitatiesubsidies voor KJ van het Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC) en de Crohn en Colitis Foundation of Canada (CCFC). VM wordt ondersteund door een CFRI Fellowship en GB een afgestudeerde studententijd van de Canadese Institutes for Health Research (CIHR). BAV is een Kinderen met darm-en leveraandoeningen Foundation (KIND) voorzitter van Pediatric IBD Research en de Canada Research Chair in Pediatric Gastroenterology en KJ is een Senior Scientist clinicus ondersteund door Kind en Kind en Gezin Research Institute (CFRI) clinicus Scientists Award Program , University of British Columbia.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 ml Syringe | BD Biosciences | 309659 | |
| 19 G Needle | BD Biosciences | 305187 | |
| Polyethylene tubing PE-50 | BD Biosciences | 427517 | for intrarectal administration in mice |
| Polyethylene tubing PE-90 | BD Biosciences | 427519 | for intrarectal administration in rat |
| DNBS | MP Bio | 150959 | |
| Tear gel | Novartis | 63601662596 | |
| 10% Formalin | Fisher | 5F93-4 | |
| Warming pad | Kent Scientific | TPZ-0510 | |
| Ethanol | Fisher | A-962.4 | |
| Hexadecyltrimethyl-ammonium bromide | Sigma-Aldrich | H5882 | |
| Potassium phosphate buffer solution | Sigma-Aldrich | 79628- | |
| o-Dianisidine dihydrochloride | Sigma-Aldrich | D3252 | |
| 30% H2O2 | Sigma-Aldrich | 31642 | hydrogen peroxide |
| Spectrophotometer | BioRad | Benchmarker Plus | |
| Light Microscope | Zeiss | Axio Image.Z1 | |
| Data analysis software program | GraphPad Software | GraphPad Prism Software Version 4.00 | www.graphpad.com |
References
- Perše, M., Cerar, A. Dextran sodium sulphate colitis mouse model: traps and tricks. Biotechnol, J. . B. iomed , (2012).
- Ghia, J. E., Blennerhassett, P., Deng, Y., Verdu, E., Khan, W., Collins, S. Reactivation of inflammatory bowel disease in a mouse model of depression. Gastroenterology. 136 (7), 2280-2288 (2009).
- Reber, S. Stress and animal models of inflammatory bowel disease-an update on the role of the hypothalamo-pituitary-adrenal axis. Psychoneuroendocrinology. 37 (1), 1-19 (2012).
- Qiu, B., Vallance, B., Blennerhassett, P., Collins, S. The role of CD4+ lymphocytes in the susceptibility of mice to stress-induced reactivation of experimental colitis. Nat. Med. 5 (10), 1178-1182 (1999).
- Boyer, L., et al. Myenteric plexus injury and apoptosis in experimental colitis. Auto. Neurosci. Basic Clin. 117 (1), 41-53 (2005).
- Saunders, P., et al. Noradrenergic and cholinergic neural pathways mediate stress-induced reactivation of colitis in the rat. Auto. Neurosci. Basic Clin. 124 (1-2), 56-68 (2006).
- Cuzzocrea, S., et al. Calpain inhibitor I reduces colon injury caused by dinitrobenzene sulphonic acid in the rat. Gut. 48 (4), 478-488 (2001).
- Cuzzocrea, S., et al. Melatonin reduces dinitrobenzene sulfonic acid-induced colitis. J. Pineal Res. 30 (1), 1-12 (2001).
- Innis, S., Jacobson, K. Dietary lipids in early development and intestinal inflammatory disease. Nutr. Rev. 65, S188-S193 (2007).
- Innis, S. M., de La Presa Owens, S. Dietary fatty acid composition in pregnancy alters neurite membrane fatty acids and dopamine in newborn rat brain. J. Nutr. 131 (1), 118-122 (2001).
- Jacobson, K. Mundra H.,Innis S.M. Intestinal responsiveness to experimental colitis in young rats is altered by maternal diet. Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 289, 13-20 (2005).
- Sanovic, S., Lamb, D. P., Blennerhassett, M. G. Damage to the enteric nervous system in experimentalcolitis. Am. J. Pathol. 155 (4), 1051-107 (1999).
- Vilaseca, J., Salas, A., Guarner, F., Rodriguez, R., Martinez, M., Malagelada, J. R. Dietary fish oil reduces progression of chronic inflammatory lesions in a rat model of granulomatous colitis. Gut. 31, 539-544 (1990).
- N-3 fatty acid-rich diet prevents early response of interleukin-6 elevation in trinitrobenzene sulfonic acid-induced enteritis. Int. J. Mol. Med. Andoh, A., Tsujikawa, T., Ishizuka, I., Araki, Y., Sasaki, M., Koyama, S., Fujiyama, Y. 12, 721-725 (2003).
- Barros, K. V., Xavier, R. A., Abreu, G. G., Martinez, C. A., Ribeiro, M. L., Gambero, A., Carvalho, P. O., Nascimento, C. M., Silveira, V. L. Soybean and fish oil mixture increases IL-10, protects against DNA damage and decreases colonic inflammation in rats with dextran sulfate sodium (DSS) colitis. Lipids Health Dis. 9, 68 (2010).
- Hekmatdoost, A., Wu, X., Morampudi, V., Innis, S. M., Jacobson, K. Dietary oils modify the host immune response and colonic tissue damage following Citrobacter rodentium infection in mice. Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 304 (10), 917-928 (2013).
- Innis, S. M., Dai, C., Wu, X., Buchan, A. M., Jacobson, K. Perinatal lipid nutrition alters early intestinal development and programs the response to experimental colitis in young adult rats. Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 299 (6), 1376-1385 (1152).
