Summary
DNBS / TNBS 유도 대장염은 다른 염증성 장 질환의 한테 진찰 Pathobiology을 연구하는 저렴한 방법을 제공합니다. 이 문서에서 설명하는 프로토콜은 생쥐와 쥐 대장염을 유도하는 DNBS의 성공적인 응용 프로그램을 설명 하나는 철저하게 호스트 매개 장 반응을 연구 할 수 있습니다.
Abstract
크론 병 및 궤양 성 대장염 등의 염증성 장 질환 (IBD)는, 긴 유전 적 기초와 연결되었습니다, 그리고 더 최근의 미생물 및 환경 에이전트에 면역 반응을 개최했다. 디 니트로 벤젠 술폰산 (DNBS) 유도 성 대장염 하나는 스트레스와 다이어트, 잠재적 인 치료의 효과 및 기전 장내 염증과 점막 손상으로 IBD 관련 환경 트리거의 발병 기전을 연구 할 수 있습니다. 이 논문에서, 우리는 쥐의 DNBS 유도 대장염 대장 점막의 염증 반응에 대한식이 N-3, N-6 지방산의 효과를 조사 하였다. 모든 래트 [홍화유 (SO), 카놀라유 (CO), 또는 어유 (FO)], 셋째 주 전에 노광 DNBS을 직장 내하는 지방산의 다른 유형의 예외와 동일한 규정 식을 공급 하였다. 직장 내 에탄올 주어진 대조군은 DNBS 처리 쥐, 반면 공급 지질 다이어트 모든 로스, 5 일간의 공부에 무게를 얻고 계속FO 및 CO 쥐에 투여 한 48 시간과 72 시간으로 SO 쥐에 투여에 의해 유의 한 체중 감소를 보여 가진 t 무게. 체중 증가는 72 시간 포스트 DNBS 후 재개, 5 일 포스트 DNBS에 의해, FO 그룹은 SO 또는 CO 그룹보다 높은 체중을 가지고 있었다. 대장 섹션은 5 일 포스트 DNBS 처리가 초점 궤양, 토굴 파괴, 술잔 세포 고갈, 다이어트 그룹 사이 정도에 차이 급성 및 만성 염증 세포의 점막 침윤을 보였다 수집. SO 공급 그룹 CO 뒤에 가장 심각한 손상을 보였고, FO는 조직 손상의 온화한 정도를 보여 개 먹이. 마찬가지로, 대장 폐장 내 myeloperoxidase (MPO) 활동, 호중구 활동의 마커 FO 공급 쥐가 상당히 낮은 MPO 활성을 갖는, SO CO 먹인 쥐 다음에 유의하게 높았다. IBD의 병인에서 다이어트의 영향을 결정하기 위해,이 프로토콜에 기술 된 이러한 결과는, DNBS 유도 된 대장염의 사용을 보여준다.
Introduction
염증성 장 질환 (IBD)은 설사, 체중 감량 및 복부 통증의 증상의 결과, 위장 (GI) 관에 만성 재발 성 염증에 의해 특징된다. 궤양 성 대장염 (UC) 및 크론 병 (CD)은 IBD의 두 가지 주요 형태이며, 위장관 내에 염증의 위치에 의해 구별 될 수있다. UC 환자에서 염증은 일반적으로 항문을 포함하고 단지 표면 점막에 영향을 미치는 변수 범위에 대한 결장까지 연속적으로 연장된다. 그것은 주로 회장 및 맹장 영향을 미치지 만 대조적으로, CD는, GI 트랙트의 어떤 부분에 영향을 미칠 수있다. 전층 염증이 자주 육아종과 연관 (fistulizing) 질병을 협착 (fibrostenotic) 및 / 또는 관통 선도로 CD가 자주 나타난다. IBD의 원인이 애매 남아 있지만, 잘 IBD는 호스트 사이의 면역 체계, 유전 적 감수성과 respon을 상호 작용을 포함, 인성 것을 허용한다환경과 미생물 요인 SES.
현재까지, IBD의 다른 모델은 UC와 CD의 특성 다양한 임상 조직 학적 및 면역 반응을 표시하는 제안되었다. 가장 일반적으로 사용되는 모델은 유전자 변형 마우스 (IL-2, IL-10, SAMP / YIT), 감염에 의한 모델 (시트로 박터의 rodentium, 살모넬라 티피 뮤 리움), 입양 전송 모델 (CD45 + RB 고, SCID 마우스에 CD62L + 셀 전송)를 포함하고 화학적으로 유도 된 대장염 모델 (덱스 트란 황산 나트륨 (DSS), 트리니트로 벤젠 술폰산 (TNBS), 및 니트로 벤젠 설 폰산 (DNBS)). 그들의 낮은 비용과 질병의 급속한 발병으로 인해, 화학 모델은 IBD의 다양한 측면의 연구에 매우 중요한 것으로 간주됩니다. 열거 된 화학 대장염 모델의 각 IBD에 자신의 임상 면역 학적 및 조직 병리학 적 관련의 몇 가지 측면에서 이점뿐만 아니라 제한 사항이 있습니다. DSS는 대장균을 유도하기 위해 사용하는 가장 일반적인 화학적 방법 중 하나이다설치류 1 TIS. 3~10%의 DSS (MW : 42 kDa의)의 관리 생쥐의 마시는 물에 7 ~ 10 일 증상 및 체중 감소, 피로, 설사, 대장 단축, 점막 궤양 및 호중구의 침윤을 포함하여 대장염의 증상을 유도 할 수있다. 이 모델은 약물 검사 연구뿐만 아니라 상피 재생, 점막 항상성에 대한 선천성 면역의 영향과 장 발육과 선암의 개발을 촉진하는 염증의 역할의 메커니즘을 탐구에 특히 유용합니다. 약간의 정도, 범위의 변화의 결과로 다른 동물 시설 대장염을 유도하기 위해 필요한 DSS의 농도뿐만 아니라, 마우스로 일관성이 물을 흡수의 변화 및 DSS에 따라서 일관성 노출을 포함하여 DSS 모델과 단점, 그리고 그러나이있다 대장의 점막 손상과 궤양의 유통. 이러한 모든 기능은 결과의 이질성으로 이어질 연구 FR을 통해 결과를 비교 할 수있는 능력을 제한톰 다른 연구 그룹.
DSS 모델에 대한 대안은 대장염의 합텐 유도 DNBS 또는 TNBS 모델입니다. 이 모델은 점막이 에이전트 DNBS 또는 에탄올의 농도 변화에 희석 TNBS를, 민감의 직장 점안을 사용합니다. 에탄올의 투여는 고유 층에 DNBS 또는 TNBS의 침투를 허용하는 대장 점막 장벽을 깰 수있는 필수 조건이다. DNBS / TNBS는 이에 타고난 호스트 및 적응 면역 반응을 유발, 면역 원성이 될 지역화 대장과 장내 미생물의 단백질을 haptenize됩니다. 일반적으로,이 모델은 심각하고 때때로 혈변, 체중 감소 및 장 벽 비후 그러나 증상 사용 설치류의 종류뿐만 아니라, 타이밍, 도즈 및 DNBS 노출 또는 사용될 TNBS의 정도에 따라 변화와 관련된 연구. 쥐와 생쥐 사이에는 중요한 차이는 낮은 구매 및 보드에 대한 비용뿐만 아니라 로우의 장점과 함께 주목해야한다생체 내에서 치료의 당 동물의 비용을 절감하기위한 R 체질량. 이것은 더 연약하고 반응하는 동물은 신속하게 인도적인 엔드 포인트에 도달 할 수 있습니다 생쥐 대장염의보다 신속하고 심한 코스에 대해 설정해야합니다.
장 염증은 초기에 증가 된 상피 투과성, 점막에 미생물 침투, 호스트 단백질의 haptenization, 손상된 점막에 호중구, 대 식세포 및 TH1 T 림프구의 침윤의 결과로이 모든 선도, 장 상피 세포에 에탄올에 의한 손상을 초래한다. DNBS 비교하여, TNBS은 나트륨 및 수산화 칼륨 등의 염기와 접촉시 폭발의 위험을 초래할 수있는 고도의 산화 특성에 의한 유해 화학 물질로 간주된다. 따라서 DNBS 현재 대장염을 유도하는 TNBS를 통해 화학 물질의 선호하는 선택으로 간주된다. 설치류에서 DNBS 대장염은 FOLLO을 연구하는 가장 편리한 방법 중 하나로서 간주됩니다날개 IBD는 질병의 수정을 관련 :
- 우울증과 대장염의 재 활성화 : 그것은 IBD 환자의 스트레스, 불안과 우울증이 자주 질병의 재발과 연관된 것으로 나타났습니다. DNBS 대장염은 생쥐에서 대장염의 재 활성화에 우울증과 그 결과의 역할을 연구하기에 적합한 모델입니다. 이 방법은 일반적으로 6-8주에 마우스를 떠남 대장염의 해상도에 따라 DNBS하여 대장염의 초기 유도를 포함한다. 마우스는 다음 DNBS 2 subcolitic 용량과 도전을 통해 대장염의 활성화를 위해 그들을 테스트하여 다음에 우울증을 유발하는 등 레 세르 핀 우울증의 원인이 에이전트 또는 후각 bulbectomy에 의해 관리됩니다.
- 스트레스와 대장염의 재 활성화 : 스트레스는 IBD의 발병에 연결되어 있습니다 또 다른 일반적인 환경 요인이다. 만성 스트레스와 설치류의 UC 및 CD의 증상의 발병 사이에 강한 연관 관계를 제안 증거의 성장 몸이있다인간과 인간이 아닌 영장류 3뿐만 아니라의. DNBS 대장염은 마우스 및 쥐 모두에서 대장염의 스트레스 관련 재활을 연구하는 좋은 모델입니다. 방법은 일반적으로 우울증 대신 제외 우울증에 대한 전술 한 바와 같이 유사한 방식으로 사용되며, 동물 등 음파와 구속 스트레스 4와 같은 스트레스에 노출된다.
- 신경성 염증 : 다수의 연구는 동물 모델에서와 IBD 환자에서 조직 샘플에서 볼 수있는 것처럼 장용 신경계 (ENS)의 구조와 기능에 일시적 또는 영구적 인 변화 중 하나를 설명했다. DNBS는 ENS 5에 염증의 효과를 탐구 및 노르 아드레날린 및 콜린성 신경 경로 6을 모두 연구하는 좋은 모델입니다.
- 부상 복구 메커니즘 : IBD 병인 동안, 반응성 산소 종 (ROS), 산화 질소 (NO), 간 부착 분자 3 (ICAM-3), 및 P-셀렉틴과 같은 숙주 유래 부상 매개체는 모두 P 보여왔다장 상피 중단하는 역할을 놓는다. DNBS은 이러한 매개체의 최대 규제뿐만 아니라 선택적인 약물이나 억제제 7,8를 사용하여 규제 수리 메커니즘에 의한 부상을 연구 할 수있는 좋은 모델입니다.
- 전층 염증 : DNBS의 상술 한 애플리케이션 외에, 모델은 창자의 전층 염증, CD 환자에서 발견 고전 기능을 연구하기 위해 적용될 수있다. DNBS 및 TNBS 유도 대장염은 모두 T 세포 의존성 면역 메커니즘을 연구하는이 모델은 특히 유용하고 대장 점막에, 림프구의 중요한 침투와 연관되어 있습니다.
DSS 모델과 비교, DNBS 및 TNBS 유도 대장염의 장점은 저렴한 비용으로, 대장염의 급속한 발전 (일반적으로 재현 궤양과 염증을 보여 1-3 일이 필요) 원위 결장 일관성 지역화 손상이 (가) 있습니다. 그러나 단점에 대한 요구 사항입니다전문 기술, DNBS / TNBS 투여 량의 최적화 및 직장 투여에 대한 마취의 필요성을 높은 수준.
이 방법론 논문에서는 (SO) 식물성 오일 잇꽃 오일을 사용한 쥐 DNBS 유도 대장염 결장 점막 반응을 변화에 N-10 및 N-3 고도 불포화 지방산의 다양한 농도의 효과를 연구 및 카놀라유 (CO) , 생선 오일 (FO). 그것은 N-10 및 N-3 지방산은 세포막의 인지질 9의 아실 잔기로서의 역할을 통해 장 염증성 질환의 중요한 매개체임을 보여왔다. N-6 지방산의 염증성 전위 달리, 충분히 높은 흡기에서 N-3 지방산은 잠재적으로 강력한 항 - 염증제이다. N-3 지방산의 항염증제 동작은 proinfl의 변조를 통해 간접적으로 아라키돈 산 대사 억제, 코사 노이드 기질로서 아라키돈 산의 보충을 통해 직접 매개 아르ammatory 유전자 발현 및 세포 신호. N-3 지방산은 또한, resolvins에 항 염증 매개체의 가족을 일으키다. N-3 지방산의 섭취는 염증성 에이코 사 노이드, 사이토 카인, 케모카인, 반응성 산소 종 및 부착 분자의 발현의 생산량의 감소와 연관된다. 이 연구에서, 쥐와, 지방산을 제외한 모든 영양소에서 동일 임의로 사료를 먹였다 지방 20 %, SO, 20 % CO, 또는 18 %의 생선 기름 플러스 2 % 홍화 오일 (FO) 10-11에서 %의 에너지로 . 매일 에너지의 비율로, SO 식단 <0.06 %의 α-리놀렌산 (ALA)없이 에이코 사 펜타 엔 산 (EPA) 또는 도코 사 헥사 엔 산 (DHA)으로, 15 % 리놀레산 (LA)를 제공, CO 다이어트 4.2했다 % LA 1.9 % ALA없는 EPA 또는 DHA와, 그리고 FO 다이어트 1.4 % EPA, DHA 4.9 %, 0.32 % LA, 0.12 % ALA를 제공했다. 3 주 지질 다이어트의 개시 후, 마우스는 직장 내 DNBS 또는 50 % 에탄올을 투여 5 일 후 희생되었다. inflammatory 응답은 체중 감소, 조직 학적 손상 점수 및 티슈 마이 엘 로퍼 옥시 다제 활성의 평가에 의해 평가 하였다.
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Protocol
동물을 대상으로 한 절차 브리티시 컬럼비아 대학의 기관 동물 케어 및 사용위원회 (IACUC)에 의해 설명 동물 관리 지침을 따르십시오.
대표적인 결과는 흰쥐에서 제출 될 것입니다 동안이 프로토콜에 언급 된 절차는 쥐와 생쥐 모두에 대해 설명한다.
1. DNBS 및 직장 내 관리의 준비
- 쥐 DNBS의 직장 점안를 들어, 갓 50 % 에탄올 DNBS/250 μL의 15 ~ 30 밀리그램을 준비합니다. 마우스의 경우, 50 % 에탄올 DNBS/100 μL의 2-6 밀리그램을 준비합니다. 참고 : 각 시설에서 관리 할 수있는 정확한 DNBS 농도를 최적화합니다. 수컷 스프 라그 - 돌리 래트 및 C57BL / 6 마우스, 그러나 다른 마우스 및 래트 균주 사용될 수는 DNBS 대장염의 유도를 위해 바람직하다. 대조군은 단 하나, OMI 수를 에탄올의 효과를 관련 경증 또는 결석으로 50 % 에탄올로 처리 한 마우스 및 래트가 사용될 수있다연구 12이 그룹의 포함을 t.
- 끝으로 고정 (마우스 - - 쥐 또는 PE-50 PE-90) 폴리에틸렌 카테 테르가 19 G 바늘로 1 ML의 주사기를 연결합니다.
- 가볍게 가열 패드에 쥐 또는 마우스 휴식 마취 (코 콘을 통해 1.5 %의 이소 플루 란을 투여하여 예를 들면, 동물들은 여전히 깜짝 연하 반사 신경을 가지고 정기적으로 호흡을 표시해야합니다.) 건조 눈을 피하기 위해 눈에 눈물 젤을 적용합니다.
- 부드럽게 원위부 대장에 존재할 수있는 모든 의자를 제거하기 위해 동물의 후방 끝에 손가락 끝의 압력을 적용합니다.
- 부드럽게 마우스의 경우 쥐, 또는 3~4센티미터의 항문에 약 8cm의 근위부에 도달하는 카테터, 직장 내 카테터를 삽입합니다. 쉽게 삽입을 허용 윤활 카테터를 삽입하는 동안 용액을 소량 주입. 주 : 카테터를 삽입하는 동안 어떤 저항이 느껴지는 경우,이 천공으로 이어질 수 있으므로 삽입하기 위하여 계속하지 않는다장벽. 카테터를 제거하고 다시 진행하기로 대장을 윤활, 부드럽게 삽입을 시도.
- 천천히 250 (쥐) 또는 100 (쥐) DNBS ㎕의, 또는 컨트롤 같은 부피의 50 % 에탄올을 주입. DNBS을 주입 한 후, DNBS의 손실을 방지하기 위해 90 초 동안 동물 머리 아래로 놓습니다.
- DNBS 관리 후 첫 주 동안 탈수를 방지하기 위해 0.2 %의 식염수에 동물에게 8 % 자당의 물을 공급.
- 조심스럽게 체중 감소와 실험 기간 동안 탈수의 증세 매일 모니터링과 함께 동물을 관찰합니다. 주 : 체중 감소가 급속히 최대 허용 체중 감소 CCAC 권장 접근있다. 이것은 주로 탈수 유래하기 때문에, 체중 감소는 탈수를 제한하는 락 테이트 화 링거액을 관리하기위한 지표로 사용한다. 적절한 건강 문제에 대한 시설의 수의사와 상담하시기 바랍니다.
2. 공동조직을 llecting 및 DNBS 장애인 마우스의 조직 학적 손상을 평가
- DNBS와 공격 후 원하는 시점에 충분한 산소를 보충 마취 챔버에서 이소 플루 란과 했나봐 동물을 안락사. 더 상승 또는 가슴의 하락을 볼되지 않을 때까지 동물을 관찰하고 더 만져서 알 수있는 심장 박동이 없습니다. 확인 동물은 제대로 자궁 경부 전위 다음에 발가락 끼거나 각막의 접촉에 대한 응답의 부재로 안락사되었습니다.
- 복강을 열고 전체 대장을 제거합니다. 길이 방향으로 장을 열고, 거시적 점막 궤양은 쥐의 대장 (마우스 2 ~ 3 CM)의 선단에서 약 5-6센티미터 근위를 관찰해야한다. 주의 : 원하는 경우 대장을 제거한 후에 거시적 손상 점수를 평가. 대조군에서의 해부학 적 위치를 대응에서 결장의 세그먼트를 수집합니다. 참고 : 매크로 손상 점수에 대한 조직을 처치 개인해야처리 군의 신원을 멀게 할. 심각도 및 궤양의 범위 (0-10), 결석 또는 설사의 존재 (0 또는 1), 유착 (0, 1, 또는 2)와 최대 결장 벽 두께에 대한 점수와 합산 : 다음과 유사한 조건을 사용하여 조직 섹션을 점수 밀리미터 11.
- 0.5 cm 섹션이 최대 거시적 인 손상의 사이트에 인접 수집합니다. 스냅 후 폐장 내 myeloperoxidase (MPO) 활동 (호중구 침투의 측정)를 평가하고, 조직 학적 분석을 위해 10 % 중성 포르말린의 다른 섹션을 배치하는 액체 질소 한 0.5 cm 섹션을 동결. 참고 : 폐장 내 myeloperoxidase 분석은 최대 1 개월 -80 ° C에 저장할 수 있습니다 냉동 조직을 스냅.
- 2.3 단계에서 조직 학적 분석을 위해 수집 된 조직이 하룻밤 포르말린에 고정하고 70 % 에탄올로 세척 할 수 있습니다. 파라핀 조직을 포함하고 원하는 두께 (3 ~ 5 μm의), 조직 학적 채점 hemotoxylin과 에오신 (HE)와 얼룩을 잘라. 이 관찰자가 각 그룹에 대한 조직 학적 손상 점수를 결정하기 위해 광학 현미경으로 각 동물로부터 적어도 세 조직 섹션을 점수를 가지고. 참고 : 조직 학적 손상의 점수에 대한 조직을 처치 개인이 치료 그룹의 정체성에 눈을 멀게한다. 염증 세포 침윤의 정도 (0 = 결석, 3 = 전층), 점막 구조의 손실 (0 = 결석, 3 = 중증), 존재 토굴 농양의 부재 (0-1) : 다음 또는 이와 유사한 기준을 사용하여 조직 섹션 점수 , 술잔 세포 고갈 (0-3). 이러한 점수 (11)의 합으로 조직 학적 손상의 점수를 결정합니다.
3. DNBS에 폐장 내 myeloperoxidase (MPO) 분석을 수행하는 장애인 창자 조직
- 2.3 단계에서 얻어진 0.5 cm 결장 세그먼트 분석 MPO 활동. MPO 균질화 완충액에서 조직 50 밀리그램 결장 segme을 얻었다 (50 mM의 인산 칼륨 완충액에서 0.5 %의 헥사 데실 - 암모늄 브로마이드 (산도 6.0)) 균질화균질화 버퍼 정지 NT는 / ㎖.
- X g 만에 2 분 동안 4 ° C에서 1 ㎖ 부분과 원심 분리기에 균질화 된 솔루션을 나누어지는.
- O-dianisidinedihydrochloride의 0.167 ㎎ / ㎖와 큐벳에 0.0005 %의 과산화수소를 함유하는 2.9 ml의 50 mM의 인산염 완충액 (pH 6.0)으로 각각 나누어지는을 100 μl를 섞는다.
- 460 nm에서 분광 광도계를 사용하여 흡광도의 비율을 측정한다. 참고 : MPO 활동은 실온에서 H 2 O에 H 2 O 2의 1 μmol / 분 분해 효소의 양으로 정의하고, 조직의 MG 당 단위로 표현된다.
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Representative Results
DNBS 쥐 (스프 라그 - 돌리) 또는 마우스 (C57BL / 6)의 도전은 일반적으로 때로는 대변에 혈액의 존재와, 일시적인 체중 감소와 설사가 발생합니다. 그러나, 유전,식이 요법과 장내 미생물 등의 요인이 DNBS 유도 성 대장염에 대한 감수성을 수정할 수 있습니다. 따라서 동물 실험에 포함 된 로컬 파생 또는 동물의 공급 업체로부터의 주문도, 같은 기관에서해야한다. 모든 동물은 신중하게 체중 감량 및 대장염 동안 고통을 고통의 증상의 정도에 대해 모니터링해야한다.
홍화유, 캐놀라 유 및 어유 DNBS 대장염의 결과 심각도에 평가되었다 :도 1-4에 제시된 결과는 세 식물 오일의 효과가있는 실험을 나타낸다. 군 간의 통계적 차이는 데이터 분석 소프트웨어 프로그램을 사용하여, 사후 Tukey의 테스트 하였다 ANOVA를 사용하여 측정 하였다. <0.05의 AP 값 consi이었다중요한 dered.
DNBS (50 % 에탄올 ㎕의 20 밀리그램 DNBS/250)와 직장 내 반칙으로 상당한 체중 감소는 SO (P <0.05)로 보충 된 쥐에서 FO 및 CO 보충 쥐와 72 시간에서 48 시간으로 관찰되었다. 최대 무게 손실은 CO 보충 쥐와 SO FO 보충 쥐에서 72 시간으로 48 시간에 볼 수 있습니다. 체중 증가는 72 시간 후 재개, 그리고 오일 포스트 DNBS, FO에 의해 그룹 기준 값과 비슷한 체중을 보여줍니다. 다이어트 보충 및 직장 내 에탄올로 도전 대조군은 5 주 연구 기간 동안 체중이 증가하는 것을 계속한다.
DNBS에 의한 장 손상이 광범위하지만 최대 피해 지역은 일반적으로 쥐의 결장의 말단 6cm로 지역화하고, 쥐의 말초 3cm가 될 수 있습니다. 거시적으로이 대장 벽의 비후, 점막 궤양, 그리고 DIST 가끔 부착으로 관찰 할 수있다이러한 방광 등의 인접 장기에 알 결장. 궤양, 면역 세포 침윤 (주로 호중구와 림프구), cryptitis, 점액 고갈, 부종의 형성을 선도하는 일부 지역에서 가까운 조직 학적 평가, 광범위한 상피 손상은 관찰에. 염증과 조직 손상이 조직 학적 징후 DNBS과 도전에 따라 세 가지 식물 오일 보충 그룹에 분명하지만 생선 기름 그룹의 쥐가 보여 반면, 가장 심한 손상, 카놀라 기름 그룹 다음에 잇꽃 오일 그룹에서 볼 수있다 최소한의 상피 손상과 점막에 염증 세포의 침윤 제한 (그림 2).
조직 학적 손상의 차이는 그룹 사이에 더 나은 비교를 위해 정량화 될 수있다. 조직 학적 손상을 평가하는 데 사용되는 기준은 염증 세포 침윤, 점막 구조의 손실, 술잔 세포 고갈 및 CRYP의 존재의 정도를 포함T 농양. DNBS 대장염 동안 세식이 석유 그룹의 조직 학적 손상 점수는 그림 3에 표시됩니다. 생선 기름 그룹은 피해의 최소 금액을 표시하면서 그림 2의 H & E 염색 부분에서 알 수있는 바와 같이, 잇꽃 오일 보충 그룹, 카놀라유 그룹 뒤에 손상의 가장 큰 범위를 가지고 있습니다.
특히 호중구 염증 세포 침윤의 정도는, 상기 마이 엘 로퍼 옥시 다제 (MPO) 활성 분석을 수행하여 조사 할 수있다. 이 호중구 과립구와 골수 혈통의 다른 세포의 과립에있는 효소로 MPO는 염증의 마커로 간주됩니다. 5 일 후 DNBS 노출에서 쥐 콜론의 MPO 활동의 평가는 세 가지 그룹 활동의 증가 (그림 4)를 보여준다. 최저 MPO 활성을 보이는 반면 최대 MPO 활성은, 카놀라유 그룹이어서 홍화유 그룹에서 관찰그림 3에서 평가 조직 학적 손상 점수에 해당하는 생선 기름 그룹.
그림 1. 50 % 에탄올 (제어) 또는 SO, CO, 또는 FO 공급 성인 여성의 흰쥐에 디 니트로 벤젠 술폰산 (DNBS) (2백50~5백g)의 직장 내 투여 후 체중의 변화 (기준의 %). 쥐가 있습니다 다음 5 일 후 처리까지 1 일에서 체중의 손실을 감시. 체중의 비율 손실은 DNBS 치료 후 일에 그려집니다. 값은 ± SEM 수단, N = 5 / 그룹. 대응을 처리 비 DNBS에 비해 3 일에서 쥐의 모든 세 그룹이 SIG했다 반면, CO 및 FO와 쥐에 투여 한 일찍 하루 1 개의 게시물 DNBS 치료로 초기 체중의 상당한 감소했다초기 중량 (P <0.01)까지으로 유의 한 체중 감소 상대. 모든 대장염 그룹은 무게가 FO의 기준에 돌려 SO 공급 그룹으로, 72 시간 후 체중 증가를 보여줍니다. 에탄올 대조군 쥐들은 5 일간의 연구 기간 동안 체중 증가를 보여줍니다. 더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오 .
그림 2. 오일 직장 내 50 %의 에탄올을 투여 (CTL) 또는 성인 여성의 쥐에 DNBS 후 대표 H & E 염색 대장 조직 절편의 조직 학적 모습은 SO, CO, 또는 FO를 공급. 조직을 10 % 포르말린에 수집 최소 고정 할 수 있습니다 24 시간의 조직 절편 이어 그는 염색.쥐에서 조직 섹션은 SO 공급 및 CO 상피 손상의 다양한 학위를 가진 상피 무결성의 중요한 중단을 보여, 토굴은 SO와 함께 볼 더 표시 변경, 궤양 형성과 전층 면역 세포 침투를 놓습니다. CO 먹인 쥐에서 상피 재생 및 손해 배상의 기록을 볼 수 있습니다. 반면, 쥐 FO 상피 무결성을 유지 공급과 고유 층에 국한 염증 세포의 침윤을 제한했다. (M-점막, SM-서브 점막 및 U-궤양, 원래 배율 100 배, 스케일 바 : 100 μm의). 더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오 .
그림 3. 대장 조직의 조직 학적 손상 점수 5 일50 % 에탄올 (일반 바) 또는 DNBS 성인 여성의 쥐에 (고체 막대)의 따고 직장 내 투여는 SO, CO, 또는 FO를 공급. 조직 섹션은 조직 학적 기반으로 일련의 기준을 사용하여, 치료에 눈을 멀게 경험이 풍부한 수사관에 의해 채점됩니다 손상. 본 연구에 사용 된 기준은 다음을 포함한다 : 염증 세포의 침윤 (0 = 결석, 3 = 전층), 점막의 무결성의 손실 (0 = 결석, 3 = 중증), 토굴 농양 형성 (0 = 결석 1 = 현재) 술잔 세포 고갈을 (0 = 결석, 3 = 높음). 조직 학적 손상 평가 점수는 각 동물로부터 3 조직 섹션의 최소 기록하여 얻어지는 점수의 합으로 결정된다. SO와 CO 공급 래트에 비해 결과 깨끗이 FO 공급 래트에서 조직 학적 손상 감소를 보여준다. 값은 ± SEM 수단, N = 5 / 그룹. 각각의 에탄올 대조군과 비교, DNBS 관리가 손상 점수 (P <0.05)에서 유의 한 증가와 연관되고, 다른 기호와 함께 그룹을 대장염하는 유의 한 차이 (P <;. 0.01) 더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오 .
그림 4. 오일 50 % 에탄올 SO, CO, 또는 FO 공급 성인 여성의 쥐에 (일반 바) 또는 DNBS (고체 막대)의 직장 내 투여 후 대장 조직에서 MPO 활동. 염증이 대장 조직을 액체 질소에 냉동 및 폐장 내 myeloperoxidase 활동을 분석 스냅됩니다 , 과립구 침윤의 인덱스로. 대장염 쥐 SO 및 주식 값이 ± SEM 수단에 비해 FO 쇼 감소 MPO 활동을 공급, N = 5 / 그룹. 각각의 에탄올 대조군과 비교, DNBS 관리가 MPO 활동 (P <0.001)의 유의 한 증가와 연관되고, 다른 기호와 함께 그룹을 대장염은 significantl 있습니다(P <0.05) 다른 예. 더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오 .
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Discussion
이 프로토콜에서 설명 DNBS 모델은 IBD의 다양한 양상을 연구하기 위해 이용 될 수있는 귀중한 저렴하고 재현성 대장염 모델이다. 쥐나 생쥐로 직장 내 투여시, DNBS는 다형 핵 세포의 전층 침투하고 지배적 인 NF-κB 의존 TH1 활성화 등의 다양한 조직 학적 기능의 측면에서 인간의 크론 병을 닮은, 대장에 염증과 조직 손상의 상당한 정도를 유도한다.
이 모델은 스트레스, 우울증, 다이어트뿐만 아니라, 장용 신경계의 참여, 부상 - 수리 메커니즘, 전층 염증 및 임상 치료로 IBD에 영향을 미칠 것으로 생각 다양한 요인을 연구하는 데 사용되었습니다. DNBS 모델은 마우스 및 쥐에서 TNBS에 의한 염증에 대한 적절한 대안과 같은 DSS로 대장염의 다른 일반적으로 사용되는 화학 모델보다 저렴한 대안을 제공합니다. 이 P에 설명 된 단계rotocol 하나는 성공적으로이 모델을 실행 할 수 있습니다.
대장염 13-16의 다른 실험 모델과 일치, 현재의 연구는 EPA와 DHA의 섭취 전에 감쇠하고 DNBS 노출에 따라 소비 장내 점막 면역 반응에식이 지방의 변수 효과를 강화하는 동안 최소한의 N와 ARA의 섭취 -3 지방산은 대장염을 악화시킨다. 이 연구에서 관찰 된 식물 N-3 지방산의 유익한 효과는 일부에 효과적으로 하부 티슈 인지질 ARA LA에서 ARA의 합성을 억제함으로써 및 EPA와 DHA와 ARA를 대체하여 두 N-3 지방산에 기인한다. 이러한 변경은 이하 염증성 환경 향하여 방출하고 후속 코사 노이드 합성 가능하고 지방산 기판을 이동. 대조적으로, N-6 지방산의 섭취는 점막 면역 반응을 더욱 심하게 염증성 매개체의 후속 합성과 높은 결장 ARA와 연관된다. 키울에서시트로 박터의 rodentium 유도 성 대장염에있는 우리의 최근의 연구로 G, 쥐가 홍화 오일보다 ARA와 카놀라 기름을 공급하지만, N-3 ALA없이 EPA 또는 DHA와 중간 염증 반응 (16)을했다.
DNBS 모델의 성공적인 구현에 영향을 미칠 수있는 몇 가지 중요한 단계가 있습니다. 다른 연구에 이르기까지 DNBS 다양한 농도를 사용하고 3 ~ 6 ㎎ / 마우스 나 대장염을 설정하는 15 ~ 30 ㎎ / 쥐에서. 최적 투여 한 동물 시설에서 다른 다를 수 있기 때문에 개별 연구자가 자신의 연구에 DNBS의 용량을 최적화 할 따라서, 중요합니다. 그것은 DNBS의 농도가 조사가 (: 특정 균주 DNBS에 저항 더 민감하고 다른 사람이 될 수 있습니다 예)를 사용하고있는 동물의 종류와 종류에 따라 다를 수 있음을주의하는 것도 중요하다. 용품이 동물의 급속한 죽음 열매 일으킬 수 DNBS의 농도가 너무 높게되지 않도록주의해야한다장 천공과 패혈증에서 lting. 이 모델을 사용하는 또 다른 중요한 단계는 동물의 원위 결장로 직장 내 카테터 삽입을위한 적절한 방법을 개발하고있다. 대장에있는 의자의 존재는 점안시 카테터의 적절한 삽입을 방지 할 수 있습니다. 이를 방지하기 위해 조심스럽게 말초 대장 / 직장에서 어떤 의자를 제거하기 위해 가볍게 마취 쥐의 항문의 뒤쪽 끝 부분에 압력을 적용합니다. 그것은 비만 곡 (가로과 하행 결장 사이의 급 커브) 7 일까지 쥐 6-8 cm의 최대로 확장 할 수 있지만 그것은 카테터 항문에서 약 3 ~ 4 센티미터 삽입하는 것이 좋습니다. 그것은 카테터를 쉽게 삽입을 허용합니다 작은 볼륨에서 DNBS / 에탄올을 주입하여 카테터를 윤활, 점안 절차를 수행하는 동안 점에 유의하는 것이 중요합니다. 항문 밖으로 DNBS의 역행 역류를 방지하기 위해서는, 별도로 90 초간 헤드 아래 위치에 동물을 길게하거나하는 것이 중요마우스는 Trendelenburg 위치 (피트가 15 ~ 30 °에 의해 머리보다 높은 배치 앙와위)에서 15 분 동안 유지 될 수있다.
조직은 연구자의 관심과 연구는 급성 또는 만성 염증에 초점을 맞추고있다 여부에 따라 선택한 시점에서 수집 할 수 있습니다. 또, 조직은 또한 장내 ENS 및 선천성 및 적응성 면역계를 연구하기 위해 사용될 수있다. 그러나, 조직이 제대로 샘플링되는 것을 보장하기 위해 필수적이다. 그것은 적절한 고정을 보장하기 위해 작은 부피 튜브 반대로 5 ㎖ 튜브에 10 % 포르말린 충분한 체적 조직을 수집하는 추천. 샘플의 적절한 고정은 조직 병리학 적 손상 및 시각화 표적 분자의 조직에서 H & E에 의해 면역 염색, 각각을 모두 연구하는 열쇠입니다. 조직의 조직 학적 점수는 t에 의해 설정된 고정 된 기준을 사용하여, 실험 조건에 멀게되는 숙련 된 사람에 의해 수행되어야그는 개인 탐정 (11, 17). 폐장 내 myeloperoxidase (MPO)는 위장 조직 (11)에 염증, 조직 손상 및 호중구 침투의 좋은 마커 역할을합니다. MPO의 분석을 수행하기 위해, 액체 질소 및 분석의 날에 조직을 동결 스냅하는 것이 좋습니다, 그것은 최고의 그리고 가장 정확한 결과를 얻기 위해 새로 제조 된 버퍼와 솔루션을 사용할 것을 권장합니다. 이 모델은 또한 소장에 침투 염증 세포, 염증 세포의 활성화 및 기타 염증성 조직 손상에 관여 매개뿐만 아니라 조절에 관여 중재자의 릴리스에 관련된 다양한 경로의 화성과 윤회에 관련된 메커니즘을 연구하는 데 사용할 수 있습니다 염증 반응과 조직의 수리.
현재와 같은 TNF-α로 한 염증성 사이토 카인 면역 억제제를 사용하거나 대상으로 볼 임상 단점은 investig을 장려해야한다ators는 IBD 환자를 관리하는 더 나은 치료 전략을 개발할 수 있습니다. 이러한 DNBS 모델과 모델, 수사관들이 잠재적으로 새로운 치료 표적을 식별하고 새로운 염증 경로와 새로운 치료의 사용을 통해 염증을 제어하는 전략을 개선 / 개발, IBD의 병인에 대한 우리의 이해를 향상시킬 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다.
Acknowledgments
이 작품은 캐나다 자연 과학 및 공학 연구위원회 (NSERC)과 크론과 캐나다의 대장염 재단 (CCFC)에서 KJ로 운영 교부금에 의해 지원되었다. VM은 CFRI 친목 및 GB 건강 연구의 캐나다 연구소 (CIHR)에서 대학원 재학에 의해 지원됩니다. BAV는 창자와 간 장애 소아 소화기 및 KJ의 소아 IBD 연구 및 캐나다 연구 의자 재단 (CHILD) 의자는 어린이와 어린이 및 가족 연구소 (CFRI) 임상 과학자 상 프로그램에서 지원하는 수석 임상 과학자와 어린이입니다 브리티시 컬럼비아 대학.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 ml Syringe | BD Biosciences | 309659 | |
| 19 G Needle | BD Biosciences | 305187 | |
| Polyethylene tubing PE-50 | BD Biosciences | 427517 | for intrarectal administration in mice |
| Polyethylene tubing PE-90 | BD Biosciences | 427519 | for intrarectal administration in rat |
| DNBS | MP Bio | 150959 | |
| Tear gel | Novartis | 63601662596 | |
| 10% Formalin | Fisher | 5F93-4 | |
| Warming pad | Kent Scientific | TPZ-0510 | |
| Ethanol | Fisher | A-962.4 | |
| Hexadecyltrimethyl-ammonium bromide | Sigma-Aldrich | H5882 | |
| Potassium phosphate buffer solution | Sigma-Aldrich | 79628- | |
| o-Dianisidine dihydrochloride | Sigma-Aldrich | D3252 | |
| 30% H2O2 | Sigma-Aldrich | 31642 | hydrogen peroxide |
| Spectrophotometer | BioRad | Benchmarker Plus | |
| Light Microscope | Zeiss | Axio Image.Z1 | |
| Data analysis software program | GraphPad Software | GraphPad Prism Software Version 4.00 | www.graphpad.com |
References
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