Summary
DNBS / TNBS colitis inducida ofrece un método alternativo y barato para estudiar la patobiología de la enfermedad inflamatoria del intestino. El protocolo descrito en este documento se describen la aplicación exitosa de DNBS para inducir la colitis en ratones y ratas y permite estudiar a fondo las respuestas intestinales mediados por el huésped.
Abstract
Enfermedades inflamatorias del intestino (IBD), incluyendo enfermedad de Crohn y la colitis ulcerosa, se han asociado con una base genética, y más recientemente respuestas inmunes del huésped a los agentes microbianos y ambientales. Colitis Dinitrobenceno ácido sulfónico (DNBS) inducida permite estudiar la patogénesis de la EII desencadenantes ambientales asociados, tales como el estrés y la dieta, los efectos de las terapias potenciales, y los mecanismos de la inflamación de la mucosa intestinal y lesión subyacente. En este trabajo, hemos investigado los efectos de los ácidos n-3 y n-6 ácidos grasos de la dieta sobre la respuesta inflamatoria de la mucosa del colon a la colitis inducida por DNBS en ratas. Todas las ratas fueron alimentadas con dietas idénticas con la excepción de los diferentes tipos de ácidos grasos [aceite de cártamo (SO), aceite de canola (CO), o el aceite de pescado (FO)] durante tres semanas antes de la exposición a intrarrectal DNBS. Las ratas de control dadas etanol intrarectal continuaron ganando peso durante el estudio 5 días, mientras que, las ratas tratadas con dietas lipídicas DNBS alimentados todo el lost de peso con FO y CO alimentado ratas demuestra la pérdida de peso significativa en un 48 hr y las ratas alimentadas SO por 72 hr. El aumento de peso se reanuda a las 72 h después de DNBS, y por 5 días después DNBS, el grupo FO tenido un mayor peso corporal que los SO o grupos CO. Secciones del colon recogieron 5 días después de DNBS-tratamiento mostró ulceración focal, destrucción cripta, el agotamiento de células caliciformes, y la infiltración mucosa de células inflamatorias tanto agudas y crónicas que difieren en gravedad entre los grupos de la dieta. El grupo SO alimentado mostró el daño más severo seguido por el CO, y FO alimenta grupos que mostraron el grado más leve de lesión de los tejidos. Del mismo modo, la mieloperoxidasa del colon (MPO) la actividad, un marcador de la actividad de los neutrófilos fue significativamente mayor en SO seguido de ratas CO alimentados, con FO ratas alimentadas tener significativamente menor actividad de MPO. Estos resultados demuestran el uso de la colitis inducida por DNBS, tal como se describe en este protocolo, para determinar el impacto de la dieta en la patogénesis de la EII.
Introduction
La enfermedad inflamatoria intestinal (EII) se caracteriza por la inflamación crónica recidivante en el tracto gastro-intestinal (GI), que resulta en síntomas de la diarrea, la pérdida de peso y dolor abdominal. La colitis ulcerosa (CU) y la enfermedad de Crohn (CD) son las dos formas principales de la EII, y se pueden distinguir por la ubicación de la inflamación en el tracto GI. En los pacientes con CU, la inflamación suele afectar el recto y se extiende de forma contigua a los dos puntos por un grado variable que afecta sólo a la mucosa superficial. En contraste, el CD puede afectar cualquier parte del tracto GI, aunque afecta predominantemente el íleon y ciego. CD se manifiesta frecuentemente como inflamación transmural asocia a menudo con granulomas y que conduce a estenosante (fibroestenótica) y / o penetrante (fistulizante) enfermedad. Aunque la etiología de la EII sigue siendo difícil de alcanzar, es bien aceptado que la EII es multifactorial, que implica interacciones entre los hosts del sistema inmune, susceptibilidad genética y responses a los factores ambientales y microbianos.
Hasta la fecha, se han propuesto diferentes modelos de IBD que mostrar varias respuestas clínicas, histológicas e inmunológicas propias de CU y EC. Los modelos más utilizados son ratones modificados genéticamente (, IL-10, SAMP / Yit IL-2), modelos inducidos infección (rodentium Citrobacter, Salmonella typhimurium), modelos de transferencia adoptiva (CD45 + RB altos, de transferencia de células CD62L + en ratones SCID) y modelos de colitis inducida químicamente (dextrán sulfato sódico (DSS), ácido sulfónico trinitrobenceno (TNBS), y ácido sulfónico dinitrobenceno (DNBS)). Debido a su bajo coste y rápida aparición de la enfermedad, los modelos químicos se consideran de gran valor para el estudio de diversos aspectos de la EII. Cada uno de los modelos de colitis químicos enumerados tienen ventajas y limitaciones en algunos aspectos de su clínica, inmunológica e histopatológico relevancia para la EII. DSS es uno de los métodos químicos más comunes empleadas para inducir coliTIS en los roedores 1. Administración de 3-10% de DSS (PM: 42 kDa) durante 7-10 días en el agua de bebida de los ratones puede inducir síntomas y signos de colitis incluyendo pérdida de peso, diarrea con sangre, acortamiento del colon, ulceración de la mucosa y la infiltración de neutrófilos. Este modelo es particularmente útil para los estudios de cribado de fármacos, así como explorar los mecanismos de regeneración epitelial, el impacto de la inmunidad innata en la homeostasis de la mucosa, y el papel de la inflamación en la promoción de la displasia intestinal y el desarrollo de adenocarcinoma. Sin embargo, hay algunos inconvenientes a la modelo DSS, incluyendo la variación en la concentración de DSS es necesario para inducir la colitis en diferentes instalaciones de los animales, así como la captación de agua está irregular por los ratones y la exposición tanto, contrarios al DSS, lo que resulta en la variación en el grado, la extensión y distribución de lesión de la mucosa y ulceración en el colon. Todas estas características dan lugar a la heterogeneidad de los resultados y limitan la capacidad para comparar los resultados entre los estudios frdiferentes grupos de investigación de la OM.
Una alternativa al modelo DSS es los DNBS inducida hapteno-o modelos de colitis TNBS. Este modelo emplea la instilación rectal de la mucosa sensibilizar a agentes DNBS o TNBS, diluido en diferentes concentraciones de etanol. La administración de etanol es un requisito previo para romper la barrera de la mucosa del colon para permitir la penetración de DNBS o TNBS en la lámina propia. DNBS / TNBS entonces haptenize las proteínas del colon y del intestino microbianos localizados a ser inmunogénica, iniciando así el anfitrión innata y la respuesta inmune adaptativa. En general, este modelo se asocia con graves y algunas veces diarrea con sangre, pérdida de peso y engrosamiento de la pared intestinal sin embargo los síntomas varían dependiendo del tipo de roedor utilizado, así como el tiempo, la dosis y el grado de exposición a la DNBS o TNBS utilizado en la estudio. Distinciones importantes entre las ratas y ratones deben tenerse en cuenta, con las ventajas de menor costo para la compra y comida, así como lower de masa corporal para la disminución de los costos por los animales del tratamiento in vivo. Esto debe situarse en el curso más rápido y severo de colitis en ratones, donde los animales más frágiles y sensibles pueden llegar rápidamente a un punto final de la integridad personal.
La inflamación intestinal inicialmente resulta de etanol daño inducido a las células epiteliales intestinales, dando lugar a aumento de la permeabilidad epitelial, la penetración microbiana en la mucosa, haptenización de proteínas del huésped, todo esto resulta en la infiltración de neutrófilos, macrófagos y linfocitos T Th1 en la mucosa dañada. En comparación con DNBS, TNBS se considera una sustancia química peligrosa, debido a sus propiedades altamente oxidantes que pueden suponer un riesgo de explosión en contacto con bases, tales como el sodio y el hidróxido de potasio. Por lo tanto DNBS es considerada actualmente como una opción preferente de productos químicos sobre TNBS para inducir colitis. En los roedores, DNBS colitis es considerado como uno de los métodos más convenientes para estudiar los siguienala IBD modificadores de la enfermedad asociada:
- La depresión y la reactivación de la colitis: Se ha demostrado que el estrés, la ansiedad y la depresión en los pacientes con EII son frecuentemente asociados con la recaída de la enfermedad. DNBS colitis es un modelo adecuado para estudiar el papel de la depresión y sus consecuencias sobre la reactivación de la colitis en ratones. El método implica típicamente la inducción inicial de la colitis por DNBS, seguido por la resolución de la colitis por dejando los ratones durante 6-8 semanas. Los ratones se administran entonces con agentes depresión causando tales como reserpina o por bulbectomy olfativa para inducir depresión seguido por pruebas de ellos para la reactivación de la colitis través de desafío con una dosis subcolitic de DNBS 2.
- El estrés y la reactivación de la colitis: El estrés es otro factor ambiental común que se ha vinculado a la patogénesis de la EII. Hay un creciente cuerpo de evidencia que sugiere una fuerte asociación entre el estrés crónico y la aparición de los síntomas de la UC y la CD en roedoress, así como en los seres humanos y los primates no humanos 3. DNBS la colitis es un buen modelo para estudiar la reactivación de estrés asociada de la colitis en ratones y ratas. El método se emplea generalmente en una manera similar como se mencionó anteriormente para la depresión, excepto en el lugar de la depresión, los animales están expuestos a factores de estrés tales como Sonic y tensión de restricción 4.
- La inflamación neurogénica: Un número de estudios han descrito ya sea alteraciones transitorias o permanentes en el sistema nervioso entérico (ENS) estructura y la función, como se ve en muestras de tejido de modelos animales y de pacientes con EII. DNBS es un buen modelo para estudiar los efectos de la inflamación en la ENS 5 y estudiar tanto noradrenérgica y vías neuronales colinérgicas 6.
- Los mecanismos de lesión-reparación: Durante la EII patogénesis, mediadores de lesiones derivadas del huésped tales como especies de oxígeno reactivo (ROS), óxido nítrico (NO), molécula de adhesión intercelular 3 (ICAM-3), y P-selectina se han mostrado a Psentar un papel en las alteraciones del epitelio intestinal. DNBS es un excelente modelo para estudiar las lesiones causadas por la sobre regulación de estos mediadores, así como los mecanismos de reparación que se regulan mediante el uso de fármacos selectivos o inhibidores de 7,8.
- Inflamación transmural: Además de las aplicaciones de DNBS mencionados anteriormente, el modelo también se puede aplicar para estudiar la inflamación transmural del intestino, una característica clásica encontrado en pacientes con EC. Ambos DNBS y la colitis inducida por TNBS se asocian con la infiltración significativa de linfocitos, en la mucosa del colon haciendo estos modelos particularmente útiles para estudiar los mecanismos inmunes dependientes de células T.
En comparación con el modelo de DSS, las ventajas de DNBS y la colitis inducida por TNBS incluyen bajo costo, el rápido desarrollo de la colitis (por lo general requiere de 1-3 días para mostrar ulceración reproducible y la inflamación) y daños localizados consistente para el colon distal. Sin embargo, los inconvenientes son un requisito para unamayor nivel de conocimientos técnicos, la optimización de la dosis DNBS / TNBS, y la necesidad de anestesia para la administración rectal.
En este trabajo metodológico se estudiaron los efectos de diferentes concentraciones de n-6 y n-3 ácidos grasos poliinsaturados en la alteración de la respuesta de la mucosa del colon a la colitis inducida por DNBS en ratas mediante el aceites vegetales aceite de cártamo (SO) y el aceite de canola (CO) , y aceite de pescado (FO). Se ha demostrado que los ácidos n-6 y n-3 grasos son importantes mediadores de la enfermedad inflamatoria intestinal a través de su papel como restos acilo de fosfolípidos de la membrana celular 9. En contraste con el potencial proinflamatorio de los ácidos grasos n-6, ácidos grasos n-3 en suficientemente alta ingesta son potencialmente agentes anti-inflamatorios potentes. Las acciones antiinflamatorias de los ácidos grasos n-3 están mediados directamente a través de la sustitución de ácido araquidónico como un sustrato de eicosanoides, inhibiendo el metabolismo del ácido araquidónico y indirectamente a través de la alteración de proinflla expresión génica proinflamatoria y la señalización celular. Los ácidos grasos n-3 también dan lugar a resolvinas, una familia de mediadores antiinflamatorios. La alta ingesta de ácidos grasos n-3 se asocia con una disminución en la producción de eicosanoides proinflamatorios, citocinas, quimiocinas, especies reactivas de oxígeno y la expresión de moléculas de adhesión. En este estudio, las ratas fueron alimentadas con dietas ad libitum idénticos en todos los nutrientes, excepto ácidos grasos, con una energía como por ciento de grasa, 20% de SO, 20% de CO, o 18% de aceite de pescado más 2% de aceite de cártamo (FO) 10-11 . Como porcentaje de la energía diaria, la dieta SO proporciona 15% de ácido linoleico (LA), con <0,06%-α-linolénico (ALA) y no el ácido eicosapentaenoico (EPA) o el ácido docosahexaenoico (DHA), la dieta CO tenía 4,2 % LA y ALA 1,9% sin la EPA o DHA, y la dieta FO proporcionaron 1,4% de EPA, DHA 4,9%, 0,32% LA, y el 0,12% de ALA. Tres semanas después de la iniciación de las dietas de lípidos, los ratones se les administró DNBS intrarrectal o etanol al 50% y se sacrificaron 5 días después. La inflrespuesta amatorio se evaluó mediante la evaluación de la pérdida de peso, los resultados histológicos de daño y la actividad mieloperoxidasa de tejido.
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Protocol
Los procedimientos que implican sujetos animales siguen las pautas de cuidado de animales expuestos por el Cuidado de Animales y el empleo Comisión Institucional (IACUC) de la Universidad de British Columbia.
Procedimientos mencionados en este protocolo se describen para ratas y ratones, mientras que los resultados representativos se presentarán a partir de ratas Sprague-Dawley.
1. Preparación de DNBS y administración intrarrectal
- Para la instilación rectal de DNBS en ratas, recién preparar 15-30 mg de DNBS/250 l de etanol al 50%. Para los ratones, prepare 2-6 mg de DNBS/100 l de etanol al 50%. Nota: Optimizar la concentración exacta DNBS para ser administrado en cada instalación. Ratas macho Sprague-Dawley, y C57BL / 6 ratones se prefieren para la inducción de la colitis con DNBS, sin embargo otras cepas de ratón y de rata se pueden utilizar. Los ratones y las ratas tratadas sólo con etanol al 50% se pueden utilizar como grupos de control sin embargo, dados los efectos de etanol son leves o ausente, se puede OMIt la inclusión de este grupo de estudio 12.
- Conecte una jeringa de 1 ml con una aguja 19 que tiene un catéter de polietileno (PE-90 - ratas o PE-50 - ratones) fijado a su fin.
- Ligeramente anestesiar la rata o el ratón que descansa sobre una almohadilla eléctrica (por ejemplo, mediante la administración de 1,5% de isoflurano a través de cono de la nariz, los animales deben tener todavía un abrir y cerrar y los reflejos de deglución y mostrar la respiración regular). Aplique el gel lágrima a sus ojos para evitar los ojos se sequen.
- Suavemente aplique presión con los dedos para el extremo posterior del animal para eliminar cualquier materia fecal que puede estar presente en el colon distal.
- Introduzca suavemente el catéter por vía rectal, con el catéter alcanza aproximadamente 8 cm proximal al ano para las ratas, o 3-4 cm para ratones. Inyectar una pequeña cantidad de la solución mientras se inserta el catéter para lubricar, lo que permite una inserción más fácil. Nota: Si se siente resistencia al insertar el catéter, no continúe para insertar ya que esto puede conducir a la perforación dela pared intestinal. Retire el catéter e intentar volver a insertar suavemente, de nuevo lubricante del colon como proceder.
- Lentamente inyectar 250 (ratas) o 100 (ratones) l de DNBS, o un volumen igual o etanol al 50% para los controles. Después de inyectar la DNBS, coloque el animal cabeza abajo durante 90 segundos para evitar la pérdida de la DNBS.
- Después de la administración DNBS, alimentar a los animales 8% de agua de sacarosa en 0,2% de solución salina para prevenir la deshidratación durante la primera semana.
- Observe cuidadosamente a los animales, con un seguimiento diario de la pérdida de peso y signos de deshidratación o malestar durante la duración del experimento. Nota: La pérdida de peso puede acercarse rápidamente las recomendaciones del CCPA de la pérdida de peso máximo autorizado. Desde esta mayoría deriva de la deshidratación, pérdida de peso debe ser utilizado como un indicador para la administración de solución de Ringer lactato para limitar la deshidratación. Por favor, asegúrese de consultar con el veterinario instalación en temas de salud, según proceda.
2. Collecting tejidos y Evaluación de daño histológico en DNBS ratones retados
- En el punto de tiempo deseado después del desafío con DNBS, la eutanasia a los animales por sobredosis de isoflurano en una cámara de anestesia suplementado con suficiente oxígeno. Observar el animal hasta que se vea ninguna subida o de bajada del pecho y no hay latidos cardiacos palpable. Confirme que el animal ha sido sacrificado correctamente por la ausencia de una respuesta a pizca dedo del pie o conmovedora de la córnea, seguido por dislocación cervical.
- Abra la cavidad abdominal y eliminar todo el intestino grueso. Abra el intestino longitudinalmente; úlceras de la mucosa macroscópicas deben ser observados aproximadamente 5-6 cm proximal desde el extremo distal del colon en ratas (2-3 cm en ratones). Nota: Después de retirar el intestino grueso, evaluar puntuaciones de daño macroscópico si se desea. Introducir las secciones de colon desde correspondiente localización anatómica de los animales de control. Nota: Las personas que califican el tejido para las puntuaciones de daño macroscópico debeser cegados a la identidad de los grupos de tratamiento. Puntuación secciones de tejido usando las siguientes o similares criterios: gravedad y el alcance de la ulceración (0-10), sumadas las puntuaciones de la ausencia o presencia de diarrea (0 ó 1), adherencias (0, 1, o 2) y el espesor de la pared del colon máxima en milímetros 11.
- Recoger 0,5 cm secciones proximal al sitio de daño macroscópico máxima. Snap congelar una sección de 0,5 cm en nitrógeno líquido para evaluar posteriormente la actividad mieloperoxidasa (MPO) (una medida de la infiltración de neutrófilos), y coloque la otra sección en el 10% formalina tamponada neutra para el análisis histológico. Nota: Encajar tejidos congelados para el ensayo de mieloperoxidasa se puede almacenar a -80 ° C durante un máximo de 1 mes.
- Permita que los tejidos recogidos para el análisis histológico en el paso 2.3 para fijar en formol durante la noche, y luego se lavan con etanol al 70%. Incrustar tejidos en parafina y corte con el espesor deseado (3-5 micras), tinción con hematoxilina y eosina (HE) para la puntuación histológica. Haga que dos observadores anotan al menos tres secciones de tejido de cada animal bajo un microscopio óptico para determinar las puntuaciones de los daños histológicos para cada grupo. Nota: Las personas que califican el tejido para las puntuaciones de los daños histológicos deben ser cegados a la identidad de los grupos de tratamiento. Puntuación secciones de tejido usando los siguientes o similares criterios: Extensión de infiltrado de células inflamatorias (0 = ausente, 3 = transmural), pérdida de la arquitectura de la mucosa (0 = ausente, 3 = grave), la presencia o ausencia de abscesos en las criptas (0-1) , y el agotamiento de las células caliciformes (0-3). Determinar puntaje daño histológico como la suma de estas puntuaciones 11.
3. Realización de mieloperoxidasa (MPO) Ensayo sobre DNBS Desafiado tejido intestinal
- Actividad MPO ensayo en los 0,5 cm segmentos colónicos obtenidos en la etapa 2.3. Homogeneizar los tejidos en tampón de homogeneización MPO (0,5% de bromuro de hexadeciltrimetil-amonio en tampón fosfato de potasio 50 mM (pH 6,0)) para dar un SEGME de colon 50 mgnt / ml de tampón de homogeneización suspensión.
- Alícuota de la solución homogeneizada en porciones de 1 ml y centrifugar a 4 ° C durante 2 min a 10.000 x g.
- Mezclar 100 l de cada alícuota con 2,9 ml de 50 mM de tampón de fosfato (pH 6,0) que contienen 0,167 mg / ml de o-dianisidinedihydrochloride y peróxido de hidrógeno 0,0005% en una cubeta.
- Medir la tasa de absorbancia utilizando un espectrofotómetro a 460 nm. Nota: la actividad de MPO se define como la cantidad de enzima que degrada 1 mol / min de H 2 O 2 a H 2 O a temperatura ambiente y se expresa en unidades por mg de tejido.
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Representative Results
Desafío de ratas (Sprague-Dawley) o ratones (C57BL / 6) con DNBS típicamente resulta en la pérdida de peso transitoria y diarrea, a veces con sangre presente en las heces. Sin embargo, factores como la genética, la dieta y la microbiota intestinal puede modificar la susceptibilidad a la colitis inducida DNBS. Por lo tanto, incluso con los animales en los experimentos deben ser de la misma institución, ya sea derivado de forma local o pedir en un solo proveedor animal. Todos los animales deben ser controlados cuidadosamente para el grado de pérdida de peso y síntomas de angustia sufrida durante la colitis.
Los resultados presentados en las figuras 1 a 4 representan un experimento en el que los efectos de los tres aceites dietéticos: Se evaluaron aceite de cártamo, aceite de canola y aceite de pescado en la gravedad resultante de DNBS colitis. Las diferencias estadísticas entre grupos se determinaron usando ANOVA seguido por el test de Tukey post hoc de, utilizando un programa de software de análisis de datos. Un valor de p <0,05 fue consimolidos significativa.
Después de la exposición intra-rectal con DNBS (20 mg DNBS/250 l de etanol al 50%), pérdida de peso significativa se observó en un 48-hr, en ratas suplementadas con FO y CO y por 72 horas, en ratas suplementadas con SO (P <0,05). La máxima pérdida de peso se ve a las 48 h, en ratas suplementadas con FO y por 72 horas, en ratas suplementadas con CO y SO. El aumento de peso se reanudó después de 72 h, y por 5 días DNBS correos, FO y así los grupos muestran los pesos corporales similares a los valores basales. Control de ratas suplementadas con las dietas y desafiados con etanol intrarectal continúan aumentando de peso durante el período de estudio de 5 días.
El daño intestinal causado por DNBS puede ser generalizada, sin embargo, el área de daño máxima generalmente se localiza en los distales 6 cm del colon en ratas, y los distales 3 cm de los ratones. Macroscópicamente esto se puede observar como el engrosamiento de la pared del colon, ulceración de la mucosa, y la adhesión ocasional de la distal colon para órganos adyacentes, tales como la vejiga. En la evaluación se observó más cerca histológico, extensa lesión epitelial, en algunas áreas que conducen a la formación de úlceras, la infiltración de células inmunes (predominantemente neutrófilos y linfocitos), criptitis, el agotamiento de moco, y el edema. Aunque estos signos histológicos de inflamación y daño tisular son evidentes en todos los tres grupos de aceite complementado en la dieta a partir del desafío con DNBS, el daño más grave se observó en el grupo de aceite de cártamo, seguido por el grupo de aceite de canola, mientras que las ratas en el grupo de aceite de pescado demuestran lesión epitelial mínima y una infiltración limitada de células inflamatorias en la mucosa (Figura 2).
Las diferencias en el daño histológico pueden cuantificarse para permitir una mejor comparación entre los grupos. Los criterios utilizados para evaluar el daño histológico incluyen el grado de infiltrado inflamatorio celular, pérdida de la arquitectura de la mucosa, el agotamiento de las células caliciformes, y la presencia de crypt abscesos. Se muestra en la figura 3 son las puntuaciones de los daños histológicos para los tres grupos petroleros dietéticos durante DNBS colitis. Como se ve en las secciones teñidas con H & E en la Figura 2, el grupo de aceite de cártamo suplementado tiene la mayor extensión del daño, seguido por el grupo de aceite de canola, mientras que el grupo de aceite de pescado muestran la menor cantidad de daños.
El grado de infiltrado de células inflamatorias, en particular de los neutrófilos, puede ser examinado aún más mediante la realización de una mieloperoxidasa (MPO) ensayo de actividad. MPO se considera un marcador de la inflamación, ya que es una enzima que se encuentra en los gránulos de los granulocitos neutrófilos y otras células de linaje mieloide. Evaluación de la actividad MPO en el colon de la rata en el día 5 después de la exposición-DNBS revela un aumento de la actividad en los tres grupos (Figura 4). La mayor actividad de MPO se observó en el grupo de aceite de cártamo, seguido por el grupo de aceite de canola, mientras que la actividad de MPO más bajo se ve en lagrupo de aceite de pescado, que corresponden a las puntuaciones de los daños histológicos evaluados en la Figura 3.
Figura 1. Los cambios en el peso corporal (% del valor inicial) después de la administración intra-rectal de 50% de etanol (control) o dinitrobenceno ácido sulfónico (DNBS), en ratas hembras Sprague-Dawley (250-500 g) alimentados SO, CO, o FO. Las ratas son se controlará su pérdida de peso corporal desde el día 1 hasta el día 5 post-tratamiento. El porcentaje de pérdida de peso corporal se representa frente a días después del tratamiento DNBS. Los valores son medias ± SEM, n = 5 / group. Cuando se compara con la no tratada con DNBS homólogos, las ratas alimentadas con CO y FO tenido una reducción significativa en sus pesos corporales iniciales tan pronto como 1 día después del tratamiento DNBS mientras que en el día 3 todos los tres grupos de ratas tenían SIGsignificativa pérdida de peso relativo al peso de línea de base (p <0,01). Todos los grupos de la colitis demuestran el aumento de peso después de 72 horas, con un peso de regresar a la línea de base en el FO y grupos SO alimentados. Ratas en los grupos de control de etanol demuestran el aumento de peso durante el período de estudio de 5 días. Haga clic aquí para ver la imagen más grande .
Figura 2. Aspecto histológico de secciones de tejido de colon de H & E manchadas representativas 5 días después de la administración intrarrectal de etanol al 50% (CTL) o DNBS a ratas hembras adultas alimenta SO, CO, o FO. El tejido se recoge en 10% de formalina y se dejó fijar durante un mínimo de 24 horas seguido de seccionar los tejidos y tinción HE. Lasecciones de tejido de las ratas alimentadas con SO y CO demuestran interrupción significativa de la integridad epitelial con diferentes grados de lesión epitelial, cripta de abandono, la formación de úlceras y transmural infiltración de células inmunes, con cambios más marcados se observan con SO. En los ratones alimentados con CO, se observa evidencia de regeneración epitelial y la restitución. En contraste, las ratas alimentadas con FO mantiene la integridad epitelial y tenía la infiltración de células inflamatorias limitada confinados a la lámina propia. (M-mucosa, SM-sub-mucosa y U-ulceración, magnificación original 100X; barra de escala: 100 micras). Haga clic aquí para ver la imagen más grande .
Figura 3. Puntuación daños histológico de los tejidos del colon 5 días a laespués de la administración intra-rectal de 50% de etanol (barra clara) o DNBS (barra sólida) a ratas hembras adultas alimenta SO, CO, o FO. Las secciones de tejido son calificadas por un investigador experimentado, cegado a los tratamientos, el uso de criterios de un sistema basado en las respuestas histológica daños. Los criterios utilizados para este estudio incluyen: la infiltración de células inflamatorias (0 = ausente, 3 = transmural), pérdida de integridad de la mucosa (0 = ausente, 3 = grave), la formación de abscesos cripta (0 = ausente, 1 = presente) el agotamiento de las células caliciformes (0 = ausente, 3 = alto). La puntuación de daño histológico se determina como una suma de puntuaciones obtenidas al anotar un mínimo de tres secciones de tejido de cada animal. Los resultados demuestran claramente un daño histológico reducida en ratas alimentadas FO, en comparación con SO y CO ratas alimentadas. Los valores son medias ± SEM, n = 5 / group. En comparación con los controles respectivos de etanol, la administración DNBS se asocia con un aumento significativo en la puntuación de daño (P <0,05); colitis grupos con diferentes símbolos son significativamente diferentes (P <;. 0,01) Haga clic aquí para ver la imagen más grande .
Figura 4. La actividad MPO en los tejidos del colon 5 días después de la administración intrarrectal de 50% de etanol (barra clara) o DNBS (barra sólida) a ratas hembras adultas alimentadas SO, CO, o FO. Tejidos del colon inflamadas se congelaron rápidamente en nitrógeno líquido y se ensayaron para determinar la actividad de la mieloperoxidasa , como un índice de la infiltración de granulocitos. Ratas con colitis alimentados FO muestran reducción de la actividad MPO en comparación con el SO y Valores CO son medias ± SEM, n = 5 / group. En comparación con los controles respectivos de etanol, la administración DNBS se asocia con un aumento significativo en la actividad de MPO (P <0,001); colitis grupos con diferentes símbolos son significantly diferente (P <0.05). Haga clic aquí para ver la imagen más grande .
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Discussion
El modelo DNBS se describe en este protocolo es un modelo de colitis valiosa, de bajo costo, y reproducible que puede ser utilizado para estudiar diversos aspectos de la EII. Cuando se administra por vía rectal para ratas o ratones, DNBS induce un importante grado de inflamación y lesión tisular en el colon, se asemeja a la enfermedad de Crohn humana en términos de sus diferentes características histológicas que incluyen la infiltración transmural de polimorfonucleares y la activación de Th1 NF-kB dependiente predominante.
Este modelo ha sido utilizado para estudiar diversos factores que se cree un impacto en la EII, tales como el estrés, la depresión, y la dieta, así como la afectación del sistema nervioso entérico, los mecanismos de lesión-reparación, la inflamación transmural, y terapias preclínicos. El modelo DNBS es también una alternativa adecuada a la inflamación inducida por TNBS en ratones y ratas y ofrece una alternativa menos costosa a otros modelos químicos comúnmente empleados de la colitis, tales como DSS. Los pasos descritos en este protocol permitirá una para ejecutar con éxito este modelo.
De acuerdo con otros modelos experimentales de colitis 13-16, el estudio actual refuerza los efectos variables de grasas en la dieta sobre la respuesta inmune de la mucosa intestinal donde la alta ingesta de EPA y DHA consume antes y después de la exposición DNBS atenúa, mientras que la alta ingesta de ARA con un mínimo de N -3 ácidos grasos exacerba la colitis. Los efectos beneficiosos de los ácidos grasos n-3 en la dieta observados en este estudio se deben en parte a la n-3 los ácidos grasos de manera efectiva más baja del tejido fosfolípido ARA tanto inhibiendo la síntesis de ARA de LA y sustituyendo ARA con EPA y DHA. Este cambio se desplaza el sustrato de ácido graso disponible para la liberación y la síntesis de eicosanoides posterior hacia un entorno menos proinflamatoria. Por el contrario, el alto consumo de ácidos grasos n-6 se asocia con un alto ARA colónica con la posterior síntesis de mediadores proinflamatorios que exacerban la respuesta inmune de la mucosa. En Keeping con nuestro estudio reciente en Citrobacter inducida rodentium colitis, las ratas alimentadas con aceite de canola con menos ARA que el aceite de cártamo, pero con n-3 ALA y EPA o DHA no tenía una respuesta inflamatoria intermedio 16.
Hay varios pasos críticos que pueden repercutir en la aplicación exitosa del modelo DNBS. Diferentes estudios han utilizado diferentes concentraciones de DNBS van 3-6 mg / ratón o 15-30 mg / rata de establecer colitis. Por lo tanto, es importante para los investigadores individuales para optimizar la dosis de DNBS por sus estudios, ya que las dosis óptimas pueden variar de una instalación de animales a la otra. También es importante tener en cuenta que la concentración de DNBS será diferente de acuerdo con el tipo y especie de animal que un investigador está utilizando (Ex: ciertas cepas pueden ser más susceptibles que otros y más resistente a la DNBS). Se debe tener cuidado para asegurar que la concentración de DNBS no es demasiado alta ya que esto puede causar la rápida muerte de los animales resUlting de perforación intestinal y sepsis. Otro paso fundamental para el uso de este modelo se está desarrollando el método apropiado para la inserción del catéter intra-rectal en el colon distal del animal. La presencia de heces en el colon puede impedir la inserción adecuada del catéter durante la instilación. Para evitar esto, aplicar suavemente la presión en el extremo posterior del ano de ratones ligeramente anestesiados para eliminar cualquier materia fecal en el extremo distal de colon / recto. Se recomienda para insertar el catéter aproximadamente 3-4 cm del ano, aunque puede ampliarse a un máximo de 6-8 cm en ratas hasta el ángulo esplénico (una curva cerrada entre el colon transverso y descendente) 7. Es importante señalar que durante el procedimiento de instilación, la lubricación del catéter mediante la inyección de DNBS / etanol en pequeños volúmenes permitirá la inserción más fácil del catéter. Con el fin de evitar el reflujo retrógrado de DNBS fuera del ano, es fundamental para mantener a los animales en una posición con la cabeza hacia abajo durante 90 segundos o, alternativamente, lalos ratones se pueden mantener durante 15 min en la posición de Trendelenburg (una posición supina donde los pies se colocan más altos que la cabeza por 15-30 °).
Los tejidos se pueden recoger en los puntos de tiempo seleccionados en función de los intereses del investigador y si el estudio se centra en la inflamación aguda o crónica. Además, los tejidos también pueden ser utilizados para estudiar los ENS intestinal y el sistema inmune innato y adaptativo. Sin embargo, es esencial para asegurar que los tejidos están adecuadamente muestreados. Se recomienda para recoger los tejidos en un amplio volumen de 10% de formalina en un viales de 5 ml en oposición a viales de menor volumen para asegurar una fijación adecuada. La fijación adecuada de la muestra es clave para estudiar tanto el daño histopatológico y la visualización de moléculas diana en los tejidos por H & E y la inmunotinción, respectivamente. De puntuación histológico de tejidos debe ser realizado por personas con experiencia que están cegados a las condiciones experimentales, el uso de criterios fijos establecidos por tél 11,17 investigador individual. Mieloperoxidasa (MPO) sirve como un buen marcador de la inflamación, la lesión tisular y la infiltración de neutrófilos en los tejidos gastrointestinales 11. Para llevar a cabo los ensayos de MPO, se sugiere para romper congelar los tejidos en nitrógeno líquido y en el día del análisis, se recomienda trabajar con tampones y soluciones recién preparadas para obtener los mejores y más precisos resultados. Este modelo también se puede utilizar para estudiar las células inflamatorias que se infiltran en el intestino, los mecanismos implicados en la quimiotaxis y la transmigración de las células inflamatorias y las diversas vías que participan en la activación y liberación de otros mediadores proinflamatorios implicados en la lesión de tejidos, así como mediadores implicados en la modulación la respuesta inflamatoria y en la reparación tisular.
Las desventajas clínicas actualmente observados con el uso de fármacos inmunosupresores o cuyo objetivo era uno de citoquinas proinflamatorias como el TNF-α deberían alentar investigdores a desarrollar mejores estrategias terapéuticas para tratar a los pacientes con EII. Los modelos, como el modelo DNBS, permite a los investigadores para aumentar nuestra comprensión de la patogénesis de la EII, potencialmente identificar nuevas dianas terapéuticas y desarrollar / mejorar las estrategias para controlar la inflamación a través de la utilización de nuevas vías inflamatorias y terapias nuevas.
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Disclosures
Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.
Acknowledgments
Esta labor fue apoyada por subvenciones de funcionamiento a KJ de las Ciencias Naturales e Ingeniería de Investigación de Canadá (NSERC) y la enfermedad de Crohn y Colitis Foundation of Canada (CCFC). VM es apoyado por una beca de CFRI y GB una beca de posgrado de los Institutos Canadienses de Investigación en Salud (CIHR). BAV es una Niños con Intestinal y Trastornos hepáticos Foundation (CHILD) Cátedra de Pediatría IBD Investigación y la Cátedra de Investigación de Canadá en Gastroenterología Pediátrica y KJ es un senior Clínico Científico apoyado por el Instituto de Investigación de la Familia Programa Clínico científicos Premio (CFRI) niño y el niño y de la Universidad de Columbia Británica.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 ml Syringe | BD Biosciences | 309659 | |
| 19 G Needle | BD Biosciences | 305187 | |
| Polyethylene tubing PE-50 | BD Biosciences | 427517 | for intrarectal administration in mice |
| Polyethylene tubing PE-90 | BD Biosciences | 427519 | for intrarectal administration in rat |
| DNBS | MP Bio | 150959 | |
| Tear gel | Novartis | 63601662596 | |
| 10% Formalin | Fisher | 5F93-4 | |
| Warming pad | Kent Scientific | TPZ-0510 | |
| Ethanol | Fisher | A-962.4 | |
| Hexadecyltrimethyl-ammonium bromide | Sigma-Aldrich | H5882 | |
| Potassium phosphate buffer solution | Sigma-Aldrich | 79628- | |
| o-Dianisidine dihydrochloride | Sigma-Aldrich | D3252 | |
| 30% H2O2 | Sigma-Aldrich | 31642 | hydrogen peroxide |
| Spectrophotometer | BioRad | Benchmarker Plus | |
| Light Microscope | Zeiss | Axio Image.Z1 | |
| Data analysis software program | GraphPad Software | GraphPad Prism Software Version 4.00 | www.graphpad.com |
References
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