Summary
DNBS / TNBS indüksiyonlu kolit bir alternatif ve iltihabik barsak hastalığı patobiyolojisini incelemek için pahalı olmayan yöntemi sunmaktadır. Bu yazıda tartışılan protokolü farelerde ve sıçanlarda kolit başlatmak için DNBS başarılı uygulama özetliyor ve bir iyice konak-aracılı bağırsak yanıtları çalışma sağlar.
Abstract
Crohn hastalığı ve ülseratif kolit de dahil olmak üzere inflamatuvar bağırsak hastalığı (IBD), ve uzun bir genetik olarak bağlantılı olmuştur ve daha yakın zamanda mikrobiyal ajanlara ve çevresel bağışıklık tepkileri barındırması. Dinitrobenzen sülfonik asit (DNBS) kaynaklı kolit böyle bir stres ve beslenme, potansiyel tedavilerin etkileri ve mekanizmaları yatan bağırsak iltihabı ve mukozal hasarı gibi IBD ilişkili çevresel tetikleyiciler patogenezi çalışma sağlar. Bu yazıda, sıçanlarda DNBS kaynaklı kolit kolon mukozal inflamatuar yanıt üzerine diyet, n-3 ve n-6 yağ asitlerinin etkileri araştırıldı. Bütün sıçanlar [aspur yağı (SO), kanola yağı (CO), ya da balık yağı (FO)] üç hafta önce, maruz kalma DNBS intrarektal için yağ asitlerinin farklı hariç aynı diyetler beslenmiştir. Intrarektal etanol verilen Kontrol sıçanları DNBS-muamele edilmiş fareler ise beslenen lipid diyetler tüm los, 5 günlük çalışma boyunca kilo almaya devam ettiFO ve CO beslenen fareler, 48 saat ve 72 saat SO beslenen fareler tarafından önemli kilo kaybı gösteren ile t ağırlık. Kilo alımı 72 saat sonrası DNBS sonra tekrar başladı ve 5 gün sonrası DNBS tarafından, FO grup SO veya CO grupları daha yüksek vücut ağırlığı vardı. Kolon kesitleri 5 gün sonrası DNBS tedavi fokal ülserasyon, crypt yıkım, goblet hücre tükenmesi ve diyet gruplar arasında şiddeti farklıydı hem akut ve kronik inflamatuar hücrelerin mukozal infiltrasyon toplandı. SO beslenen grup CO ardından en ağır hasarı gösterdi, ve FO doku hasarının hafif derecesini gösterdi grupları beslenir. Benzer şekilde, myeloperoksidaz (MPO) aktivitesi, nötrofil aktivite belirteci FO beslenen fareler anlamlı düşük MPO aktivitesi olan, SO CO beslenen farelerde, ardından anlamlı olarak yüksek bulundu. IBD patogenezinde diyetin etkisini belirlemek için, bu protokolde tarif edildiği gibi bu sonuçlar DNBS kaynaklı kolit kullanımını göstermektedir.
Introduction
İnflamatuar barsak hastalığı (IBD), ishal, kilo kaybı, ve karın ağrısı semptomları ile sonuçlanan, gastro-intestinal (GI) sistemi içinde, kronik tekrarlayan bir inflamasyon ile karakterize edilir. Ülseratif kolit (UC) ve Crohn Hastalığı (CD) IBD iki biçimleridir ve GI sistemi içinde inflamasyon konumu ile ayırt edilebilir. UC hastalarda, tipik olarak, rektum iltihabı içerir ve sadece yüzeysel mukozayı etkileyen değişken bir oranda için kolon kadar bitişik olarak uzanır. Bu ağırlıklı olarak ileum ve çekum etkiler, ancak aksine, CD, GI sisteminin herhangi bir kısmını etkileyebilir. Transmural inflamasyon sıklıkla granülomlar ile ilişkili ve (fistülizan) hastalığı striktüre (fibrostenotik) ve / veya delici lider olarak CD sık tezahür eder. IBD etiyolojisi zor olmakla birlikte, iyi İBH bilgisayarlar arasında bağışıklık sistemi, genetik yatkınlık ve yanıtlayanların etkileşimler içeren multifaktöriyel olduğu kabul edilmektedirçevre ve mikrobiyal faktörlerle için ses.
Bugüne kadar, IBD farklı model UC ve CD karakteristik çeşitli klinik ve histolojik bağışıklık tepkilerini gösterdikleri önerilmiştir. En yaygın olarak kullanılan model, genetik olarak tadil edilmiş farelerin (IL-2, IL-10, SAMP / Yit), enfeksiyon kaynaklı modelleri (Citrobacter rodentium, Salmonella typhimurium), adoptif transfer modeller (CD45 + RB yüksek, SCID farelere CD62L + hücre transferi) içerir ve kimyasal olarak indüklenen kolit modeli (Dekstran Sülfat Sodyum (DSS), trinitrobenzen sülfonik asit (TNBS) ve dinitrobenzen sülfonik asit (DNBS)). Düşük maliyet ve hastalıkların hızlı başlaması nedeniyle, kimyasal modeller IBD çeşitli yönlerini çalışma için çok değerli olarak kabul edilir. Listelenen kimyasal kolit modellerin her İBH onların, klinik immünolojik ve histopatolojik alaka bazı yönlerden avantajları yanı sıra sınırlamaları vardır. DSS coli ikna etmek için kullanılan en yaygın kimyasal yöntemlerden biridirkemirgenlerde 1 tis. % 3-10 DSS (MW: 42 kDa) uygulanması farelerin içme suyu içinde 7-10 gün boyunca semptom ve kilo kaybı, kan ishal, kolon kısalması, mukozal ülserasyon ve nötrofil infiltrasyon dahil kolit belirtileri neden olabilir. Bu model, ilaç tarama çalışmaları, hem de epitelyal rejenerasyon, mukozal homeostazı ile ilgili bağışıklık sisteminde etki ve bağırsak displazi ve adenokarsinoma gelişimi teşvik inflamasyonun rolünü mekanizmalarını için özellikle yararlıdır. Bazı derecesi ölçüde değişim ile sonuçlanan, farklı hayvan tesislerinde kolit başlatmak için gerekli DSS konsantrasyonu yanı sıra, fareler tarafından tutarsız su emme varyasyon ve DSS böylece tutarsız maruz kalma gibi DSS modeline dezavantajları, ve söz konusudur kolonda mukozal hasar ve ülserasyon dağıtımı. Tüm bu özellikler sonuçların heterojen yol ve çalışmalar fr çapında sonuçlarını karşılaştırmak yeteneğini sınırlayabilirom farklı araştırma grupları.
DSS modele alternatif kolit hapten kaynaklı DNBS veya TNBS modelleri. Bu model, mukozal maddeleri DNBS ya da etanol içinde değişen konsantrasyonlarda seyreltildi TNBS, duyarlı rektal instilasyon kullanmaktadır. Etanol idaresi lamina propria içine DNBS veya TNBS'nin nüfuz sağlamak için kolon mukoza engelini kırmak için bir ön koşuldur. DNBS / TNBS ardından böylece doğuştan gelen ev sahibi ve adaptif bağışıklık tepkileri tetikleyen İmmünojenik haline lokalize kolon ve bağırsak mikrobiyal proteinlerin haptenize olacaktır. Genel olarak, bu model şiddetli ve bazen kanlı ishal, kilo kaybı ve bağırsak duvarı kalınlaştırmanın ancak belirtileri kullanılan kemirgen türü, hem de zamanlaması, doz ve DNBS maruz kalma veya kullanılan TNBS derecesine bağlı olarak değişiklik ile ilişkili çalışma. Sıçanlar ve fareler arasında önemli ayrımlar daha düşük satın alma ve yönetim kurulu için maliyet yanı sıra Lowe faydaları ile dikkat edilmelidirin vivo tedavinin başına hayvan maliyetlerin düşürülmesi için r beden kitle. Bu daha kırılgan ve duyarlı hayvanlar hızlı bir şekilde insani bir son nokta ulaşabilir farelerde kolit daha hızlı ve şiddetli tabii ki, karşı koymak gerekir.
Bağırsak iltihabı, ilk artan epitel geçirgenliği, mukoza içine nüfuz mikrobiyal konak proteinlerin haptenization, hasarlı mukoza içine nötrofil, makrofaj ve Th1 T lemfositlerinin infiltrasyonu ile sonuçlanan tüm bu yol açan, bağırsak epitelial hücrelerine etanol neden olduğu hasarların sonuçları. DNBS ile karşılaştırıldığında, TNBS örneğin sodyum ve potasyum hidroksit gibi bazlar ile temas üzerine, bir patlama riski teşkil edebilir, son derece oksidatif özellikleri nedeniyle tehlikeli bir kimyasal olarak kabul edilmektedir. Bu nedenle DNBS anda kolit başlatmak için TNBS'nin üzerinde kimyasal bir tercih edilen seçenek olarak kabul edilir. Kemirgenlerde, DNBS kolit Follo çalışma için en uygun yöntemlerden biri olarak kabul edilirkanat İBH hastalığı nitelemeler ilişkili:
- Depresyon ve kolit reaktivasyonu: Bu İBH hastalarında stres, anksiyete ve depresyon sıklıkla hastalığın nüks ile ilişkili olduğu gösterilmiştir. DNBS kolit farelerde kolit yeniden aktive edilmesi üzerine, depresyon ve sonuçları rolünü incelemek için uygun bir modeldir. Bu yöntem, genellikle 6-8 hafta içinde fareler bırakarak kolit çözünürlüğü ardından DNBS kolitin ilk uyarılmasını içerir. Daha sonra fareler DNBS 2 bir subcolitic doz ile yükleme yoluyla kolit yeniden aktivasyonu için bunların test edilmesi, ardından depresyon oluşturmak için bu tip rezerpin gibi depresyon neden olan ajanlar ile ya da koku bulbectomy ile tatbik edilmektedir.
- Stres ve kolit reaktivasyonu: Stres İBH patogenezinde bağlantılı olan diğer bir önemli çevresel faktör olduğunu. Kronik stres ve kemirgen Yeryüzündeki semptomların başlangıcı arasında güçlü bir ilişki olduğunu kanıtlar giderek artan bir vücut varinsan ve insan olmayan primatlarda 3 yanı sıra var. DNBS kolit fareler ve sıçanlarda kolit stres ilişkili reaktivasyonunu çalışmak için iyi bir modeldir. Yöntem, genellikle depresyon yerine dışında depresyon için yukarıda belirtildiği gibi benzer bir şekilde kullanılır, hayvanlar ve bu gibi sonik sınırlandırılmış stres 4 gibi stres maruz kalmaktadır.
- Nörojenik iltihap: Bazı çalışmalar hayvan modellerinde ve IBD olan hastalardan alınan doku örneklerinde görüldüğü gibi enterik sinir sistemi (ENS) yapısı ve fonksiyonu, geçici veya kalıcı değişiklikler ya tanımlamışlardır. DNBS ENS 5 üzerinde iltihaplanma etkilerini araştırmak ve noradrenerjik ve kolinerjik sinir yolları 6 hem de çalışmak için iyi bir modeldir.
- Yaralanma tamir mekanizmaları: IBD patogenezi sırasında, bu reaktif oksijen türleri (ROS), nitrik oksit (NO), hücreler arası yapışma molekülü 3 (ICAM-3) ve P-selektin gibi ev sahibi türevli yaralanma aracılar tüm p gösterilmiştirbağırsak epitel bozulması bir rol yatıyordu. DNBS bu aracıların up-regülasyonu yanı sıra seçici uyuşturucu veya inhibitörleri 7,8 ile düzenlenir onarım mekanizmaları nedeniyle yaralanmalara incelemek için mükemmel bir model.
- Transmural enflamasyon: DNBS yukarıda belirtilen uygulamalara ilave olarak, model aynı zamanda bağırsak transmural enflamasyon, CD'li hastalardan bulunan klasik bir özelliği çalışma uygulanabilir. DNBS ve TNBS ile indüklenen kolit, her ikisi de T-hücresi bağımlı bağışıklık mekanizmaları incelemek için, bu model, özellikle faydalı bir hale getirir kolon mukozası içine, lenfositlerin önemli bir infiltrasyonu ile ilişkilidir.
DSS modeli ile karşılaştırıldığında, DNBS ile TNBS ile indüklenen kolit avantajlar arasınnda, düşük maliyet, kolit hızlı bir gelişme (ülser çoğunlukla yeniden üretilebilmekte ve iltihap göstermek için 1-3 gün gerektirir) ve distal kolon tutarlı lokalize hasar bulunmaktadır. Ancak sakıncaları bir için bir gereklilikteknik uzmanlık, DNBS / TNBS dozunun optimizasyonu, ve rektal uygulama için anestezi için ihtiyaç daha yüksek düzeyde.
Bu metodolojik yazıda (SO) bitkisel yağlar, papağanyemi yağı kullanılarak sıçanlarda DNBS indüklediği kolit için kolon mukoza yanıtı değiştiren on n-6 ve n-3 çoklu doymamış yağ asitlerinin değişik konsantrasyonlarda etkilerini inceledi ve kanola yağı, (CO) ve balık yağı (FO). Bu, n-6 ve n-3 yağ asitleri, hücre zarı phosopholipids 9 asil parçalar olarak oynadıkları rol bağırsak iltihaplı hastalıkların önemli aracılar olduğu gösterilmiştir. N-6 yağ asitleri proenflamatuar potansiyel aksine, yeterince yüksek alımı, n-3 yağ asitleri, potansiyel olarak güçlü anti-enflamatuar maddelerdir. N-3 yağ asitlerinin anti-inflamatuar etkileri proinfl değiştirilmesi yoluyla dolaylı olarak arakidonik asit metabolizma ve önleme, bir alt-tabaka olarak eicosanoid arakidonik asit yerine doğrudan aracılık ederammatory gen ekspresyon ve hücre sinyal. N-3 yağ asitleri, aynı zamanda, resolvins anti-iltihap aracılarının bir aile neden olmaktadır. N-3 yağ asitlerinin yüksek alımı proenflamatuar eikosanoidler, sitokinler, kemokinler, reaktif oksijen türleri ve yapışma moleküllerinin ifade üretiminde bir azalma ile ilişkilidir. Bu çalışmada fareler ile, yağ asitleri dışındaki tüm besinler aynı ad libitum diyetler beslenmiştir yağ,% 20 SO, 20% CO veya% 18 balık yağı artı% 2 aspur yağı (FO) 10-11 bir yüzde enerji olarak . Günlük enerjisinin bir yüzdesi olarak, SO diyet <% 0,06 α-linolenik asit (ALA) ve hiçbir eikosapentaenoik asit (EPA) ve dokosaheksaenoik asit (DHA) olan,% 15 linoleik asit (LA) sağlanan, CO diyet 4.2 oldu % LA ve ALA% 1.9 no EPA veya DHA ile ve FO diyet% 1.4 EPA, DHA% 4.9,% 0.32 LA, ALA ve% 0.12 verdi. Üç hafta lipid diyetler başlandıktan sonra, fareler, intrarektal DNBS ya da% 50 etanol verilir ve 5 gün sonra kurban edilmiştir. Inflammatory tepki kilo kaybı, histolojik hasar skorları ve doku myeloperoksidaz aktivitesinin değerlendirilmesi ile değerlendirildi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Hayvan denekleri prosedürleri British Columbia Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından açıklanan hayvan bakım yönergeleri izleyin.
Temsilci sonuçlar Sprague-Dawley sıçanlarından sunulacak ise bu protokolde belirtilen prosedürler, sıçanlar ve fareler hem de tarif edilecektir.
1.. DNBS ve intrarektal İdaresi hazırlanması
- Sıçanlarda DNBS rektal damlatılması için, taze% 50 etanol DNBS/250 ul 15-30 mg hazırlar. Fareler için,% 50 etanol DNBS/100 ul 2-6 mg hazırlar. Not: Her bir tesiste uygulanacak kesin DNBS konsantrasyonunu optimize. Erkek Sprague-Dawley sıçanları ve C57BL / 6 fareleri, ancak diğer fare ve sıçan suşları kullanılabilir DNBS kolit indüksiyonu için tercih edilir. Kontrol grupları, ancak bir Omi olabilir etanolün etkilerini verilen hafif ya da mevcut olmadığı gibi sadece% 50 etanol ile muamele edilmiş fareler ve sıçanlar kullanılabilirbir çalışma 12 için bu grubun dahil t.
- Sonuna bağlanmış (farenin - - sıçan ya da PE-50 PE-90), bir polietilen kateter sahip olan bir 19 G iğne ile bir 1 ml şırınga takın.
- Hafif bir ısıtma yastığı sıçan veya fare istirahat uyutmak (burun konisi üzerinden% 1.5 izofluran verilerek, örneğin hayvanlar yine göz kırpma ve yutma refleksleri var ve düzenli solunum göstermelidir). Kurumasını önlemek için gözlerini onun gözlerine gözyaşı jeli uygulayın.
- Yavaşça uzak kolonda mevcut olabilecek herhangi bir dışkı çıkarmak için hayvanın arka ucuna parmak uçları ile basınç uygulanır.
- Yavaşça fareler için sıçan, veya 3-4 cm için anüs için yaklaşık 8 cm proksimal ulaşan kateter ile, intrarektal kateter yerleştirin. Kolay sokulmasına izin veren, yağlamak için kateteri sokulurken çözeltinin küçük bir miktar enjekte edilir. Not: kateterin yerleştirilmesi sırasında herhangi bir direnç hissedilir ise, bu delinmesi yol açabilir olarak eklemek devam etmeyinbağırsak duvarı. Kateteri çıkarın ve tekrar işlem olarak kolon yağlama, yavaşça yeniden takın girişimi.
- Yavaş yavaş 250 (sıçan) ya da 100 (fare) DNBS ul ya da kontroller için eşit hacimde% 50 etanol ya da enjekte edilir. DNBS enjekte ettikten sonra, DNBS kaybını önlemek için 90 saniye boyunca hayvan baş aşağı yerleştirin.
- DNBS verilmesinden sonra, ilk hafta boyunca su kaybını önlemek için% 0.2 tuzlu su içinde% 8 sükroz hayvanların suya doyurmaya.
- Dikkatle kilo kaybı ve deney süresince dehidratasyon veya rahatsızlığı işaretleri için günlük izleme ile, hayvanlar dikkat edin. Not: Kilo kaybı hızla maksimum izin verilen ağırlık kaybı CCAC öneriler yaklaşım olabilir. Bu çoğunlukla dehidratasyon türetilmiş için, kilo kaybı dehidratasyon sınırlamak laktatlanmış Ringer çözeltisi uygulanması için bir gösterge olarak kullanılır. Uygun olarak sağlık sorunları üzerinde tesis veteriner danışın emin olun.
2. CoDokular llecting ve DNBS Engelliler Fareler histolojik hasarı değerlendirilmesi
- DNBS ile denemeden sonra arzu edilen bir zaman noktasında, yeterli oksijen ile takviye edilmiş bir anestezi bölmesi içerisinde izofluran ile doz aşımı ile hayvanlar ötenazi. Hiçbir yükselen veya göğüs düşen görüldüğü kadar hayvan gözlemlemek ve palpe kalp atışı var. Onay hayvan doğru servikal dislokasyon ayak tutam veya korneanın dokunma için bir yanıt, yokluğu ile kurban edilmiştir.
- Karın boşluğu açın ve tüm kalın bağırsak kaldırın. Uzunlamasına bağırsak açın, makroskopik mukozal ülser farelerde kolon (farelerde 2-3 cm) en uzak ucundan itibaren yaklaşık olarak 5-6 cm proksimal dikkat edilmelidir. Not: İsterseniz kalın bağırsak çıkardıktan sonra, makroskopik hasar puanları değerlendirmek. Kontrol hayvanların anatomik konuma karşılık gelen kolon segmentleri toplayın. Not: makroskopik hasar puanları için doku puanlama bireyler olmalıdırTedavi gruplarının kimliğine kör. Şiddeti ve ülserasyon ölçüde (0-10), ya da yokluğunda ishal varlığında (0 ya da 1), adezyonlar (0, 1, ya da 2) ve maksimal kolonik duvar kalınlığı için puan ile özetlenebilir: Aşağıdaki veya benzer kriterler kullanılarak doku bölümleri Skor 11 milimetre.
- 0.5 cm bölümler maksimal makroskopik hasar sitesine proksimaline toplayın. Daha sonra ek bileşen miyeloperoksidaz (MPO) aktivitesi (nötrofil infiltrasyonu bir ölçüsü) değerlendirmek ve histolojik analiz için% 10 nötr tamponlu formalin içinde diğer bölümü yerleştirmek için sıvı azot içinde bir 0.5 cm bölüm dondurma. Not: miyeloperoksidaz deney kadar 1 ay boyunca -80 ° C 'de muhafaza edilebilir için donmuş dokular çekin.
- Adım 2.3 histolojik analiz için toplanan dokular gecede formalin düzeltmek ve daha sonra% 70 etanol ile yıkayın izin verin. Parafin dokuları embed ve istenilen kalınlıkta (3-5 mikron), histolojik puanlama için hemotoksilinle ve eozin (HE) ile leke kesilir. Iki gözlemci, her bir grup için histolojik hasarı puanları belirlemek için, bir ışık mikroskobu altında, her bir hayvandan en az üç doku bölümleri puan yazıldı. Not: histolojik hasar skorları için doku puanlama bireylerin tedavi gruplarının kimliğine kör olmalıdır. Enflamatuar hücre infiltratın ölçüde (0 = yok, 3 = Transmural), mukozal mimari kaybı (0 = yok, 3 = şiddetli), varlığı ya da crypt apseler yokluğu (0-1): Aşağıdaki veya benzer kriterler kullanılarak doku bölümleri Puan ve goblet hücre tükenmesi (0-3). Bu puan 11 toplamı olarak histolojik hasar puanı belirler.
3. DNBS üzerine Miyeloperoksidaz (MPO) Tahlili Sahne Engelliler Bağırsak Dokusu
- Adım 2.3 'de elde edilen 0.5 cm kolon segmentlerinde Deneyi MPO aktivitesi. MPO homojen hale getirme tamponunda dokular 50 mg kolon segme vermek üzere (50 mM potasyum fosfat tamponu içinde% 0.5 heksadesiltrimetil-amonyum bromür (pH 6.0)) homojenizehomojenizasyon tamponu süspansiyonu nt / ml.
- 10,000 x g, 2 dakika boyunca 4 ° C 'de 1 ml kısımlar ve santrifüj içine homojenize çözeltisi kısım.
- O-dianisidinedihydrochloride 0.167 mg / ml ve bir küvet içinde,% 0.0005, hidrojen peroksit içeren 2.9 ml 50 mM fosfat tampon maddesi (pH 6.0) ile her bir kısım 100 ul karıştırın.
- 460 nm'de bir spektrofotometre kullanılarak emme oranını ölçmek. Not: MPO aktivitesi, oda sıcaklığında, 2 H, H 2 O O 2 1 umol / dak bozundurucu enzim miktarı olarak tanımlanır ve doku mg başına birim olarak ifade edilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
DNBS ile sıçan (Sprague-Dawley) veya farelerde (C57BL / 6) Challenge tipik bazen dışkıda kan varken, geçici kilo kaybı ve ishal sonuçları. Ancak, bu tür genetik, beslenme ve intestinal mikrobiyota gibi faktörler DNBS indüklenen duyarlılık değiştirebilir. Bu nedenle, hayvan deneylerinde dahil lokal olarak türetilmiş ya da bir hayvan tedarikçiden sipariş ya da, aynı kurumdan olmalıdır. Tüm hayvanlar dikkatle kilo kaybı ve kolit sırasında uğradığı sıkıntı belirtilerinin derecesi için izlenmelidir.
Aspur yağı, kanola yağı, balık yağı ve DNBS kolit edilen şiddetine değerlendirildi: Şekiller 1-4 de sunulan sonuçlar, üç besin yağlarının etkisi bir deney temsil eder. Grupları arasındaki fark istatistiksel olarak bir veri analiz yazılım programı kullanılarak, post hoc Tukey testi ile takip edilen ANOVA kullanılarak belirlenmiştir. <0.05 AP değeri consi olduönemli dered.
DNBS (% 50 etanol içinde 20 mg DNBS/250 ul) ile meydan okuma intrarektal sonra, belirgin bir kilo kaybı SO (p <0.05) ile takviye edilmiş sıçanlarda FO ve CO ile takviye edilmiş farelerde ve 72 saat ile 48-saat gözlenmiştir. Maksimum kilo kaybı CO ile takviye edilmiş farelerde ve SO FO ile takviye edilmiş farelerde ve 72 saat ile 48 saat sonra görülmektedir. Kilo alımı 72 saat sonra yeniden ve SO 5 gün sonrası DNBS, FO tarafından gruplar bazal değerlere benzer vücut ağırlıkları göstermektedir. Diyetler ile desteklenmiş ve entrarektal etanol ile meydan kontrol fareleri 5 günlük çalışma süresi boyunca kilo almaya devam ediyor.
DNBS neden olduğu bağırsak hasarı, ancak yaygın bir maksimal hasar alanı genellikle farelerde kolon merkezden uzaklığı 6 cm lokalize edilir ve farelerde distal 3 cm kadar olabilir. Makroskopik olarak bu kolon duvar kalınlaşması, mukozal ülserasyon ve dist zaman zaman yapışması olarak görülebilir, mesane gibi bitişik organlara al kolon,. Ülser, immün hücre infiltrasyonu (esas olarak nötrofiller ve lenfositler), kriptit mukus tükenmesi ve ödem oluşumuna yol açan bazı alanlarda daha yakın histolojik değerlendirme, geniş epitel hasarı gözlenir üzerinde. Enflamasyon ve doku hasarının bu histolojik bulgular DNBS ile karşı karşıya bırakılan her üç diyet yağ ilave grupta belirgin olmasına rağmen, balık yağı grubundaki farelere göstermektedir, öte yandan, en ciddi hasar, kanola yağı grubunun takip aspur yağı grubu görülür minimal epitel yaralanması ve mukoza içine inflamatuar hücrelerin sınırlı infiltrasyon (Şekil 2).
Histolojik hasar farklılıklar grupları arasında daha iyi bir karşılaştırma sağlamak için tayin edilebilir. Histolojik hasarı değerlendirmek için kullanılan kriterler inflamatuar hücre infiltrasyonu, mukozal mimari zarar, goblet hücresi alınmış ve CRYP varlığı ölçüde dahilt apseler. DNBS kolit esnasında üç beslenme yağ grupları için histolojik hasarı puanları, Şekil 3'te gösterilmiştir. Balık yağı grubu hasarın en az miktarda gösterirken, Şekil 2 'de, H & E boyalı kesitlerde görüldüğü gibi, yalancı safran yağı takviye grubu, kanola yağı grubunun takip hasarın büyük ölçüde sahiptir.
Özellikle nötrofillerin enflamatuar hücre infiltrasyonu derecesi, bundan başka, bir miyeloperoksidaz (MPO) aktivitesi deneyi gerçekleştirerek kontrol edilebilir. Bu nötrofil granülositler ve myeloid diğer hücrelerinin granülleri içinde bulunan bir enzim olduğu MPO, enflamasyonun bir markörü olduğu kabul edilir. Gün 5 post-DNBS maruz de sıçan kolonlarında MPO aktivitesinin değerlendirilmesi her üç grupta aktivitesinde bir artış (Şekil 4) ortaya koymaktadır. Düşük MPO aktivitesi görülür ise büyük MPO aktivitesi, kanola yağı grubunun takip aspur yağı grubu görülmektedirŞekil 3'te değerlendirilen histolojik skorlar zarar tekabül eden balık yağı grubudur.
Şekil 1. % 50 etanol (kontrol) ya da SO, CO veya FO beslenen yetişkin dişi Sprague-Dawley farelerinde dinitrobenzen sülfonik asit (DNBS) (250-500 g) intrarektal uygulandıktan sonra vücut ağırlığındaki değişiklikler (taban çizgisinin%). Fareleridir Daha sonra 5 gün sonra muamele kadar günde 1 vücut ağırlığı kaybı için izlenir. Vücut ağırlığının yüzdesi kaybı DNBS tedavi sonrası gününe karşı çizilir. Değerler ortalama ± SEM araçlardır, n = 5 / grup. Meslektaşları tedavi olmayan DNBS karşılaştırıldığında günde 3 sıçanların her üç grup sig vardı oysa, CO ve FO ile beslenen fareler gibi erken gün 1 mesaj DNBS tedavi olarak onların ilk vücut ağırlıklarında anlamlı bir azalma vardıbaşlangıç ağırlığı (p <0.01) anlamlı kilo kaybı göreceli. Tüm kolit gruplarının ağırlık FO başlangıca dönen ve SO beslenen grupları ile, 72 saat sonra kilo göstermektedir. Etanol kontrol grubundaki sıçanlara 5 günlük çalışma süresi boyunca kilo kazancı göstermek. resmi büyütmek için buraya tıklayın .
Şekil 2. 5 gün rektum,% 50 etanol içinde verilmesinden (CTL) veya yetişkin dişi farelere DNBS sonra Örnek H & E boyanmış kolon dokusu bölümleri histolojik görünümü SO, CO veya FO beslenir. Doku% 10 formalin içinde toplanmış ve en az düzeltmek bırakılır 24 saat doku kesit ardından HE ve boyama.sıçanlardan doku bölümleri SO beslenen ve CO epitel hasarı değişen derecesi ile epitel bütünlüğünün önemli kesintileri göstermek, crypt SO ile görülen daha belirgin değişiklikler ile, ülser oluşumunu ve transmu immün hücre infiltrasyonu dışarı bırakın. CO beslenen farelerde, epitel rejenerasyon ve restitüsyon kanıtlar görülmektedir. Bunun aksine, fareler FO epitel entegriteyi muhafaza beslenir ve lamina propria ile sınırlı inflamatuar hücrelerin infiltrasyonunu sınırlı vardı. (M-mukoza, SM-sub-mukoza ve U-ülser; orijinal büyütme 100X; ölçek çubuğu: 100 mikron). resmi büyütmek için buraya tıklayın .
Şekil 3,. Kolonik dokuların histolojik hasar skoru 5 gün% 50 etanol (net bar) veya DNBS yetişkin dişi farelere (katı bar) ürkiye'de entrarektal idaresi SO, CO, veya FO beslenir. Doku kesitleri histolojik dayalı bir dizi kriterler kullanarak, tedavilere kör deneyimli bir araştırmacı tarafından puanlanır hasar. Bu çalışma için kullanılan kriterler içermektedir: iltihabi hücre infiltrasyonu (0 = yok, 3 = Transmural), mukozal bütünlük kaybı (0 = yok, 3 = şiddetli), crypt apse oluşumu (0 = yok, 1 = var) goblet hücresi kaybı (0 = yok, 3 = yüksek). Histolojik hasar skoru her hayvandan üç doku bölümleri en az bir puanlama ile elde edilen skorlar, bir toplamı olarak belirlenmiştir. SO ve CO beslenen fareler ile karşılaştırıldığında sonuçlar, FO beslenen sıçanlarda azalmış bir histolojik hasarı göstermektedir. Değerler ortalama ± SEM araçlardır, n = 5 / grup. Ilgili etanol kontrol grubu ile karşılaştırıldığında, DNBS yönetim hasar skoru (P <0.05) önemli bir artış ile ilişkilidir, farklı simgelerle gruplar kolit olan anlamlı bir fark (P <,. 0.01) büyük resmi görebilmek için buraya tıklayın .
Şekil 4. 5 gün% 50 etanol SO, CO veya FO beslenen yetişkin dişi farelere (açık çubuk) veya DNBS (katı bar) intrarektal uygulanmasından sonra kolon dokularında MPO aktivitesi. Iltihaplı bağırsak doku sıvı nitrojen içinde dondurulur ve miyeloperoksidaz faaliyet için tahlil oturmaktadırlar , granülosit infiltrasyon bir göstergesi olarak. Kolitik sıçan SO ve A.Ş. Değerler ± SEM araçlarıdır göre FO gösteri azaltılmış MPO aktivitesi beslenen, n = 5 / grup. İlgili etanol kontrolleri ile karşılaştırıldığında, DNBS yönetim MPO aktivitesi (p <0.001) önemli bir artış ile ilişkilidir; farklı semboller ile gruplar kolit significantl vardır(p <0.05) farklı y. resmi büyütmek için buraya tıklayın .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu protokol açıklanan DNBS IBD modeli çeşitli yönlerini incelemek için kullanılabilir değerli, ucuz ve tekrarlanabilir kolit modelidir. Sıçan veya intrarektal farelere verildiği zaman, DNBS polimorfonükleer hücrelerin infiltrasyonu transmural ve baskın NF-KB-bağımlı Th1 aktivasyonu dahil, çeşitli histolojik özellikleri açısından insan Crohn hastalığı benzeyen, kolon enflamasyonun ve doku hasarının önemli bir derecede neden olur.
Bu model, stres, depresyon, ve diyet, hem de enterik sinir sistemi tutulumu, yaralanma-onarım mekanizmaları, transmural inflamasyon ve klinik öncesi tedaviler gibi İBH üzerinde etkisi olduğu düşünülen çeşitli faktörleri incelemek için kullanılır olmuştur. DNBS modeli aynı zamanda farelerde ve sıçanlarda TNBS kaynaklı inflamasyon için uygun bir alternatif olduğu ve bu DSS kolit gibi diğer yaygın olarak kullanılan kimyasal modelleri için daha ucuz bir alternatif sunmaktadır. Bu p özetlenen adımlarotokol bir başarıyla bu modeli çalıştırmak için izin verecektir.
Kolit 13-16 diğer deneysel modelleri ile tutarlı, mevcut çalışmada, EPA ve DHA yüksek alımı öncesinde zayıflatır ve DNBS maruz kalma aşağıdaki tüketilmesi bağırsak mukozal immün sistem üzerine diyet yağ değişken etkilerini güçlendirmektedir ise minimal n ile ARA yüksek alımı -3 yağ asitleri kolit şiddetlendirir. Bu çalışmada gözlenen diyet n-3 yağ asitleri yararlı etkileri kısmen etkin bir şekilde düşük doku fosfolipid ARA LA, ARA sentezini inhibe ederek ve EPA ve DHA ile ARA değiştirerek hem de n-3 yağ asitleri kaynaklanmaktadır. Bu değişiklik, daha az proinflamatuvar çevreye karşı sürümün ve sonraki eicosanoid sentezi için kullanılabilir yağ asidi tabakayı kaydırır. Aksine, n-6 yağ asitleri, yüksek emme mukozal bağışıklık tepkisini arttırabilir proenflamatuar aracıların daha sonra sentezi ile yüksek kolon ARA ile ilişkilidir. Keepin yılındaCitrobacter rodentium indüklenen bizim son çalışma ile g, sıçanlar aspir yağı daha az ARA ile kanola yağı ile beslenen, ancak n-3 ALA ve hiçbir EPA veya DHA ile bir ara inflamatuar yanıtı 16 vardı.
DNBS modelinin başarılı bir şekilde uygulanması üzerinde etkili olabilecek birkaç önemli adım vardır. Farklı çalışmalar arasındaki DNBS değişen konsantrasyonlar adres 3-6 mg / fare veya kolit kurmak için 15-30 mg / sıçan. Optimal doz, bir hayvan tesisinden diğer değişebilir bu yana araştırmacılar tek tek, kendi çalışmaları için DNBS dozajını optimize etmek için Bu nedenle, bu önemlidir. Bu DNBS konsantrasyonu bir araştırmacı (: Bazı suşlar DNBS daha dayanıklı daha duyarlı ve diğerleri olabilir Ex) kullandığı hayvanın türüne ve türlere göre farklılık göstereceğini dikkat etmek de önemlidir. Care bu hayvanların ölümü hızlı resu neden olabilir DNBS konsantrasyonu çok yüksek olmadığından emin olmak için dikkat edilmelidirbarsak perforasyonu ve sepsis lting. Bu modeli kullanarak başka kritik adım hayvanın distal kolon içine entrarektal kateter yerleştirilmesi için uygun yöntem geliştiriyor. Kolonda dışkının varlığı instilasyon sırasında kateterin yeterli sokulmasını önleyebilir. Bunu önlemek için, hafifçe distal kolon / rektum herhangi bir dışkı çıkarmak için hafifçe anestezi farelerin anüs arka sonunda basınç uygulayın. Bu, dalak eğme (enine ve inen kolon arasında keskin bir viraj) 7 kadar farelerde 6-8 sm bir maksimum uzatılabilir olsa da, kateter makattan yaklaşık 3-4 cm eklenmesi önerilir. Bu kateterin daha kolay sokulmasını sağlayacak küçük hacimlerde DNBS / etanol enjekte edilerek kateteri yağlama, instilasyon işlem sırasında dikkat etmek önemlidir. Anüs üzerinden DNBS retrograd reflü önlemek için, bu, alternatif olarak 90 saniye boyunca bir baş aşağı konumda tutmak ya da hayvanlar için çok önemlidirfareler Trendelenburg pozisyonunda (ayaklar 15-30 ° kafa daha yüksek yerleştirilir yatar pozisyon) 15 dakika boyunca muhafaza edilebilir.
Dokular araştırmacının ilgi ve çalışma akut veya kronik inflamasyon üzerinde duruluyor olup olmadığını bağlı olarak seçilen zaman noktalarında toplanabilir. Buna ek olarak, dokular aynı zamanda bağırsak MBA ve doğal ve adaptif bağışıklık sistemi incelemek için kullanılabilir. Bununla birlikte, örneklenen doku doğru olduğundan emin olmak için gereklidir. Bu, uygun bir tespit sağlamak için daha küçük hacimli şişeler karşıt olarak bir 5 ml şişeler içinde% 10 formalin içinde bol hacmindeki dokuları toplamak için tavsiye edilir. Numunelerin uygun sabitleme histopatolojik hasar ve görselleştirme hedef moleküllerin dokularda H & E ile ve immün, sırasıyla her iki çalışma için bir anahtardır. Dokuların histolojik skorlama t tarafından belirlenen sabit kriterleri kullanarak, deneysel koşullara kör deneyimli kişiler tarafından yapılmalıdırO bireysel araştırmacı 11,17. Miyeloperoksidaz (MPO), gastrointestinal dokularda 11 içine enflamasyon, doku hasarı ve nötrofil infiltrasyonu iyi bir belirteç olarak hizmet vermektedir. MPO deneyler gerçekleştirmek için, sıvı azot içinde ve analiz gününde doku dondurma ek önerilmektedir, bu en iyi ve en doğru sonuçlar elde etmek için taze hazırlanmış tampon ve çözümleri ile çalışmak için tavsiye edilir. Bu model aynı zamanda bağırsak sızmak iltihaplı hücreler, enflamatuar hücrelerin aktivasyonu ve proenflamatuar ve diğer doku hasarı dahil arabulucu hem de modüle dahil aracıların serbest bırakılması ile ilgili çeşitli yolların kemotaksisi ve göçü ile ilgili mekanizmaları incelemek için kullanılabilir inflamatuvar yanıt ve doku onarımı.
Şu anda böyle TNF-α gibi bir proinflamatuar sitokin bastırıcı ilaçlar kullanarak veya hedefleme ile görülen klinik dezavantajları Investig teşvik etmelidirators IBD'li hastaları yönetmek için daha iyi tedavi stratejileri geliştirmek. Böyle DNBS modeli gibi modeller, araştırmacılar potansiyel yeni tedavi hedefleri belirlenmesi ve yeni enflamatuar yollar ve yeni tedavilerin kullanımı yoluyla iltihabı kontrol etmek için stratejiler geliştirmek / geliştirilmesi, patogenezde anlayışımızı artırmak için olanak sağlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar, hiçbir rakip mali çıkarlarını olmadığını beyan ederim.
Acknowledgments
Bu çalışma, Fen Bilimleri ve Kanada'nın Mühendislik Araştırma Konseyi (NSERC) ve Crohn ve Kanada Kolit Vakfı (CCFC) den KJ için faaliyet hibe tarafından desteklenmiştir. VM SÜMAE Bursu ve GB Sağlık Araştırmaları Kanada Enstitüleri (CIHR) mezunu öğrencilik tarafından desteklenmektedir. BAV Bağırsak ve Karaciğer Hastalıkları Pediatrik Gastroenteroloji ve KJ Pediatrik İBH Araştırma ve Kanada Araştırma Başkanı Vakfı (ÇOCUK) Başkanı ÇOCUK ve Çocuk ve Aile Araştırma Enstitüsü (SÜMAE) Klinisyen Bilim Ödülü Programı tarafından desteklenen bir Kıdemli Klinisyen Bilimci olan bir çocuk olduğunu , British Columbia Üniversitesi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 ml Syringe | BD Biosciences | 309659 | |
| 19 G Needle | BD Biosciences | 305187 | |
| Polyethylene tubing PE-50 | BD Biosciences | 427517 | for intrarectal administration in mice |
| Polyethylene tubing PE-90 | BD Biosciences | 427519 | for intrarectal administration in rat |
| DNBS | MP Bio | 150959 | |
| Tear gel | Novartis | 63601662596 | |
| 10% Formalin | Fisher | 5F93-4 | |
| Warming pad | Kent Scientific | TPZ-0510 | |
| Ethanol | Fisher | A-962.4 | |
| Hexadecyltrimethyl-ammonium bromide | Sigma-Aldrich | H5882 | |
| Potassium phosphate buffer solution | Sigma-Aldrich | 79628- | |
| o-Dianisidine dihydrochloride | Sigma-Aldrich | D3252 | |
| 30% H2O2 | Sigma-Aldrich | 31642 | hydrogen peroxide |
| Spectrophotometer | BioRad | Benchmarker Plus | |
| Light Microscope | Zeiss | Axio Image.Z1 | |
| Data analysis software program | GraphPad Software | GraphPad Prism Software Version 4.00 | www.graphpad.com |
References
- Perše, M., Cerar, A. Dextran sodium sulphate colitis mouse model: traps and tricks. Biotechnol, J. . B. iomed , (2012).
- Ghia, J. E., Blennerhassett, P., Deng, Y., Verdu, E., Khan, W., Collins, S. Reactivation of inflammatory bowel disease in a mouse model of depression. Gastroenterology. 136 (7), 2280-2288 (2009).
- Reber, S. Stress and animal models of inflammatory bowel disease-an update on the role of the hypothalamo-pituitary-adrenal axis. Psychoneuroendocrinology. 37 (1), 1-19 (2012).
- Qiu, B., Vallance, B., Blennerhassett, P., Collins, S. The role of CD4+ lymphocytes in the susceptibility of mice to stress-induced reactivation of experimental colitis. Nat. Med. 5 (10), 1178-1182 (1999).
- Boyer, L., et al. Myenteric plexus injury and apoptosis in experimental colitis. Auto. Neurosci. Basic Clin. 117 (1), 41-53 (2005).
- Saunders, P., et al. Noradrenergic and cholinergic neural pathways mediate stress-induced reactivation of colitis in the rat. Auto. Neurosci. Basic Clin. 124 (1-2), 56-68 (2006).
- Cuzzocrea, S., et al. Calpain inhibitor I reduces colon injury caused by dinitrobenzene sulphonic acid in the rat. Gut. 48 (4), 478-488 (2001).
- Cuzzocrea, S., et al. Melatonin reduces dinitrobenzene sulfonic acid-induced colitis. J. Pineal Res. 30 (1), 1-12 (2001).
- Innis, S., Jacobson, K. Dietary lipids in early development and intestinal inflammatory disease. Nutr. Rev. 65, S188-S193 (2007).
- Innis, S. M., de La Presa Owens, S. Dietary fatty acid composition in pregnancy alters neurite membrane fatty acids and dopamine in newborn rat brain. J. Nutr. 131 (1), 118-122 (2001).
- Jacobson, K. Mundra H.,Innis S.M. Intestinal responsiveness to experimental colitis in young rats is altered by maternal diet. Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 289, 13-20 (2005).
- Sanovic, S., Lamb, D. P., Blennerhassett, M. G. Damage to the enteric nervous system in experimentalcolitis. Am. J. Pathol. 155 (4), 1051-107 (1999).
- Vilaseca, J., Salas, A., Guarner, F., Rodriguez, R., Martinez, M., Malagelada, J. R. Dietary fish oil reduces progression of chronic inflammatory lesions in a rat model of granulomatous colitis. Gut. 31, 539-544 (1990).
- N-3 fatty acid-rich diet prevents early response of interleukin-6 elevation in trinitrobenzene sulfonic acid-induced enteritis. Int. J. Mol. Med. Andoh, A., Tsujikawa, T., Ishizuka, I., Araki, Y., Sasaki, M., Koyama, S., Fujiyama, Y. 12, 721-725 (2003).
- Barros, K. V., Xavier, R. A., Abreu, G. G., Martinez, C. A., Ribeiro, M. L., Gambero, A., Carvalho, P. O., Nascimento, C. M., Silveira, V. L. Soybean and fish oil mixture increases IL-10, protects against DNA damage and decreases colonic inflammation in rats with dextran sulfate sodium (DSS) colitis. Lipids Health Dis. 9, 68 (2010).
- Hekmatdoost, A., Wu, X., Morampudi, V., Innis, S. M., Jacobson, K. Dietary oils modify the host immune response and colonic tissue damage following Citrobacter rodentium infection in mice. Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 304 (10), 917-928 (2013).
- Innis, S. M., Dai, C., Wu, X., Buchan, A. M., Jacobson, K. Perinatal lipid nutrition alters early intestinal development and programs the response to experimental colitis in young adult rats. Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 299 (6), 1376-1385 (1152).
