Summary
DNBS / TNBS colite indotta offre un metodo alternativo e poco costoso per studiare la pathobiology delle malattie infiammatorie intestinali. Il protocollo descritto in questo documento delinea l'applicazione di successo di DNBS per indurre colite in topi e ratti e permette di studiare a fondo le risposte intestinale ospite-mediata.
Abstract
Malattie infiammatorie croniche intestinali (IBD), tra cui il morbo di Crohn e la colite ulcerosa, sono stati a lungo associati con una base genetica, e, più recentemente, ospiterà la risposta immunitaria agli agenti microbici e ambientali. Colite dinitrobenzene solfonico (DNBS) indotta permette di studiare la patogenesi delle MICI fattori ambientali associati come lo stress e la dieta, gli effetti di potenziali terapie, e dei meccanismi alla base dell'infiammazione intestinale e della mucosa pregiudizio. In questo lavoro, abbiamo studiato gli effetti degli acidi n-3 e n-6 grassi alimentari sulla risposta infiammatoria della mucosa del colon di colite DNBS indotta nei ratti. Tutti i ratti sono stati alimentati con diete identiche ad eccezione dei diversi tipi di acidi grassi [olio di cartamo (SO), olio di canola (CO), o olio di pesce (FO)] per tre settimane prima dell'esposizione al intrarectal DNBS. I ratti di controllo indicati etanolo intrarettale continuato aumentare di peso nel corso dello studio cinque giorni, mentre, i ratti DNBS trattati con diete lipidi alimentati tutti lospeso t con FO e CO nutriti ratti dimostrano una significativa perdita di peso per 48 ore e ratti alimentati SO da 72 ore. L'aumento di peso ripreso dopo 72 ore postali DNBS, e da 5 DNBS giorni postali, il gruppo FO ha avuto un peso corporeo superiore a SO o gruppi CO. Sezioni del colon raccolto 5 giorni dopo DNBS-trattamento ha mostrato ulcerazione focale, distruzione cripta, deplezione delle cellule calice, e della mucosa infiltrazione di entrambe le cellule infiammatorie acute e croniche che differivano in gravità tra i gruppi di dieta. Il gruppo SO alimentato mostrato il danno più grave, seguito dal CO, e FO nutrito gruppi che hanno mostrato il più mite grado di danno tissutale. Allo stesso modo, la mieloperossidasi del colon (MPO) di attività, un marker di attività dei neutrofili era significativamente maggiore nel SO seguiti dai ratti nutriti CO, con FO ratti alimentati ad attività MPO notevolmente inferiore. Questi risultati dimostrano l'uso di colite DNBS indotta, come descritto in questo protocollo, per determinare l'impatto della dieta nella patogenesi delle IBD.
Introduction
Le malattie infiammatorie intestinali (IBD) è caratterizzata da infiammazione cronica recidivante nel tratto gastro-intestinale (GI), con conseguente sintomi di diarrea, perdita di peso, e dolore addominale. Colite ulcerosa (CU) e malattia di Crohn (CD) sono i due principali forme di IBD, e si distinguono per la posizione della infiammazione nel tratto GI. In pazienti UC, l'infiammazione in genere comporta il retto e si estende in modo contiguo il colon per una misura variabile colpisce solo la mucosa superficiale. Al contrario, CD può colpire qualsiasi parte del tratto GI, anche se colpisce prevalentemente l'ileo e cieco. CD manifesta frequentemente come l'infiammazione transmurale spesso associato con granulomi e portando a stenosante (fibrostenotic) e / o penetranti (fistulizing) malattia. Sebbene l'eziologia di IBD resta inafferrabile, è ben accettato che IBD è multifattoriale, coinvolgendo le interazioni tra i padroni di casa del sistema immunitario, predisposizione genetica e responsabilitàses a fattori ambientali e microbici.
Ad oggi, diversi modelli di IBD sono stati proposti che visualizza varie risposte cliniche, istologiche e immunitario caratteristici di UC e CD. I modelli più comunemente usati includono topi geneticamente modificati (IL-2, IL-10, SAMP / Yit), infezione modelli indotti (Citrobacter rodentium, Salmonella typhimurium), modelli di trasferimento adottivi (CD45 + RB alti, trasferimento di cellule CD62L + in topi SCID) e modelli di colite indotta chimicamente (Dextran solfato di sodio (DSS), trinitrobenzene solfonico (TNBS), e Dinitrobenzene acido solfonico (DNBS)). A causa del loro basso costo e rapida insorgenza della malattia, modelli chimici sono considerati preziosi per lo studio di vari aspetti della IBD. Ciascuno dei modelli colite chimici elencati presenta vantaggi e le limitazioni in alcuni aspetti della loro rilevanza clinica, immunologica e istopatologico di IBD. DSS è uno dei metodi chimici più comuni impiegati per indurre colitis nei roditori 1. La somministrazione di 3-10% DSS (MW: 42 kDa) per 7-10 giorni in acqua potabile di topi può indurre sintomi e segni di colite, tra cui la perdita di peso, diarrea con sangue, accorciamento del colon, ulcerazioni della mucosa e infiltrazione dei neutrofili. Questo modello è particolarmente utile per gli studi di screening di farmaci, così come esplorare i meccanismi di rigenerazione epiteliale, l'impatto di immunità innata sulla mucosa omeostasi, e il ruolo dell'infiammazione nella promozione displasia intestinale e sviluppo adenocarcinoma. Ci sono tuttavia alcuni inconvenienti al modello DSS, compresa una variazione nella concentrazione di DSS necessaria per indurre colite in diverse strutture animali, così come l'assorbimento di acqua incoerente da topi e l'esposizione così incoerente DSS, con conseguente variazione del grado, misura e distribuzione delle lesioni della mucosa e ulcerazione nel colon. Tutte queste caratteristiche portano a eterogeneità dei risultati e limitano la possibilità di confrontare i risultati di tutti gli studi frgruppi di ricerca differenti om.
Un'alternativa al modello DSS è il DNBS aptene-indotta o modelli TNBS di colite. Questo modello impiega instillazione rettale della mucosa agenti sensibilizzanti DNBS o TNBS, diluite in concentrazioni variabili di etanolo. La somministrazione di etanolo è un prerequisito per rompere la barriera della mucosa del colon per consentire la penetrazione di DNBS o TNBS nella lamina propria. DNBS / TNBS poi haptenize le proteine del colon e intestino microbiche localizzate a diventare immunogeno, innescando in tal modo l'host innata e le risposte immunitarie adattative. In generale, questo modello è associata a diarrea grave e talvolta sanguinante, perdita di peso e ispessimento della parete intestinale tuttavia sintomi variano a seconda del tipo di roditore utilizzati, nonché i tempi, dosaggio e il grado di esposizione al DNBS o TNBS utilizzato nella studio. Importanti distinzioni tra ratti e topi dovrebbero essere notato, con i vantaggi di basso costo per l'acquisto e cartone, nonché lower massa corporea per ridurre i costi per animali di trattamento in vivo. Questo dovrebbe essere impostato contro il corso più rapido e grave di colite nei topi, dove gli animali più fragili e reattive possono raggiungere rapidamente un endpoint umano.
L'infiammazione intestinale risulta inizialmente da etanolo danno indotto alle cellule epiteliali intestinali, con conseguente aumento della permeabilità epiteliale, penetrazione microbica nella mucosa, haptenization di proteine ospite, tutto questo con conseguente infiltrazione di neutrofili, macrofagi e linfociti T Th1 nella mucosa danneggiata. In confronto a DNBS, TNBS è considerato come sostanza chimica pericolosa per le sue proprietà altamente ossidanti che possono costituire un rischio di esplosione a contatto con basi come sodio e idrossido di potassio. Pertanto DNBS è attualmente considerato come una scelta preferita di chimica su TNBS per indurre colite. Nei roditori, DNBS colite è considerato come uno dei metodi più convenienti per studiare la succesala IBD modificatori della malattia associata:
- Depressione e riattivazione della colite: E 'stato dimostrato che lo stress, ansia e depressione nei pazienti IBD sono spesso associati a recidiva della malattia. DNBS colite è un modello adatto per studiare il ruolo della depressione e le sue conseguenze sulla riattivazione della colite in topi. Il metodo comporta tipicamente dell'inserimento iniziale di colite da DNBS, seguita dalla risoluzione della colite lasciando i topi per 6-8 settimane. I topi sono poi somministrati con depressione causando agenti come reserpina o bulbectomy olfattiva indurre depressione seguita da loro test per la riattivazione della colite attraverso sfida con una dose subcolitic di DNBS 2.
- Lo stress e la riattivazione della colite: Lo stress è un altro fattore ambientale comune che è stato collegato a IBD patogenesi. Vi è un crescente corpo di evidenze che suggeriscono una forte associazione tra stress cronico e l'insorgenza di sintomi di UC e CD in roditoris così come negli esseri umani e primati non umani 3. DNBS colite è un buon modello per studiare la riattivazione stress associato di colite sia in topi e ratti. Il metodo è di solito impiegato in un modo simile come sopra indicato per la depressione tranne in luogo della depressione, gli animali sono esposti ai fattori di stress come Sonic e contenimento dello stress 4.
- Infiammazione neurogenica: Un certo numero di studi hanno descritto né alterazioni transitorie o permanenti del sistema nervoso enterico (ENS) struttura e funzione, come si è visto in campioni di tessuto da modelli animali e da pazienti con IBD. DNBS è un buon modello per esplorare gli effetti di infiammazione sulla ENS 5 e per studiare sia noradrenergici e colinergici percorsi neurali 6.
- Meccanismi Injury-riparazione: Durante IBD patogenesi, ospite-derivati mediatori di pregiudizio, come specie reattive dell'ossigeno (ROS), l'ossido nitrico (NO), molecola di adesione intercellulare 3 (ICAM-3), e P-selectina hanno tutti dimostrato di plaici un ruolo nel intestinale perturbazione epiteliali. DNBS è un ottimo modello per studiare le lesioni causate dal up-regolazione di questi mediatori, nonché meccanismi di riparazione che sono regolati da uso di droghe o inibitori selettivi 7,8.
- Infiammazione transmurale: Oltre alle suddette applicazioni di DNBS, il modello può essere applicato anche per studiare infiammazione transmurale dell'intestino, una caratteristica classica trovati in pazienti con MC. Entrambi DNBS e colite TNBS-indotti sono associate con una significativa infiltrazione di linfociti, nella mucosa del colon rendendo questi modelli particolarmente utile per studiare cellule T meccanismi immunitari dipendenti.
In confronto con il modello DSS, i vantaggi di DNBS e colite TNBS indotte includono basso costo, rapido sviluppo di colite (richiede solitamente 1-3 giorni per mostrare ulcerazione riproducibile e infiammazione) e danni localizzati coerente al colon distale. Tuttavia gli inconvenienti sono un requisito per unmaggior livello di competenza tecnica, l'ottimizzazione del dosaggio DNBS / TNBS, e la necessità di anestesia per la somministrazione rettale.
In questo documento metodologico abbiamo studiato gli effetti di concentrazioni variabili di n-6 e n-3 acidi grassi polinsaturi sulla modificare la risposta della mucosa del colon di colite DNBS indotta in ratti usando l'olio di cartamo oli vegetali (SO) e olio di canola (CO) , e olio di pesce (FO). E 'stato dimostrato che gli acidi n-6 e n-3 grassi sono importanti mediatori della malattia infiammatoria intestinale mediante la loro funzione porzioni acilico di phosopholipids membrana cellulare 9. In contrasto con il potenziale proinfiammatorio di acidi grassi n-6, n-3 acidi grassi sufficientemente elevato di aspirazione sono potenzialmente agenti anti-infiammatori. Le azioni antinfiammatorie degli acidi grassi n-3 sono mediate direttamente attraverso la sostituzione di acido arachidonico come substrato eicosanoidi, inibendo il metabolismo dell'acido arachidonico e indirettamente attraverso l'alterazione di proinflespressione genica ammatory e segnalazione cellulare. Gli acidi grassi n-3 suscitano anche resolvins, una famiglia di mediatori antinfiammatori. Elevato apporto di acidi grassi n-3 è associata ad una diminuzione della produzione di eicosanoidi proinfiammatori, citochine, chemochine, specie reattive dell'ossigeno e l'espressione di molecole di adesione. In questo studio, i ratti sono stati alimentati ad libitum diete identiche in tutte le sostanze nutritive eccetto acidi grassi, con una energia cento da grasso, 20% SO, 20% CO, o 18% di olio di pesce più 2% olio di cartamo (FO) 10-11 . In percentuale dell'energia giornaliera, la dieta SO disponibile acido linoleico 15% (LA), con <0,06% acido α-linolenico (ALA) e nessun acido eicosapentaenoico (EPA) o acido docosaesaenoico (DHA), la dieta CO aveva 4.2 % LA e 1,9% ALA senza EPA o DHA, e la dieta FO fornito 1,4% EPA, DHA 4,9%, 0,32% LA, e il 0,12% ALA. Tre settimane dopo l'inizio delle diete lipidi, i topi sono stati somministrati DNBS intrarettale o etanolo al 50% e si sono sacrificati 5 giorni dopo. Il inflammatory risposta è stata valutata mediante la valutazione della perdita di peso, i punteggi danno istologico e l'attività della mieloperossidasi tessuti.
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Protocol
Procedure che coinvolgono soggetti animali seguono le linee guida per la cura degli animali delineati dalla cura degli animali ed uso Comitato istituzionale (IACUC) presso l'Università della British Columbia.
Procedure menzionate nel presente protocollo saranno descritti sia per i ratti e topi, mentre i risultati rappresentativi saranno presentati da ratti Sprague-Dawley.
1. Preparazione di DNBS e intrarettale Amministrazione
- Per instillazione rettale di DNBS nei ratti, appena preparare 15-30 mg di DNBS/250 ml di etanolo al 50%. Per i topi, preparare 2-6 mg di DNBS/100 ml di etanolo al 50%. Nota: Ottimizzare l'esatta concentrazione DNBS deve essere somministrato a ciascun impianto. Ratti maschi Sprague-Dawley, e C57BL / 6 topi sono preferiti per l'induzione della colite DNBS, tuttavia altri ceppi di topi e ratti possono essere utilizzati. Topi e ratti trattati solo con etanolo al 50% possono essere utilizzati come gruppi di controllo tuttavia dati gli effetti di etanolo sono lievi o assenti, si può omit l'inclusione di questo gruppo per uno studio 12.
- Collegare una siringa da 1 ml ad un ago G 19, che ha un catetere di polietilene (PE-90 - ratti o PE-50 - topi) fissata alla sua fine.
- Leggermente anestetizzare il ratto o topo che poggia su una piastra elettrica (ad esempio con la somministrazione di 1,5% isoflurano via cono, gli animali dovrebbero ancora avere un batter e riflessi di deglutizione e visualizzare la respirazione regolare). Applicare il gel lacrima ai suoi occhi per evitare gli occhi secchi.
- Comprimendo leggermente con i polpastrelli alla estremità posteriore dell'animale per rimuovere eventuali feci che possono essere presenti nel colon distale.
- Inserire delicatamente il catetere rettale, con il catetere raggiunge circa 8 cm prossimalmente l'ano per i ratti, o di 3-4 cm per topi. Iniettare una piccola quantità della soluzione durante l'inserimento del catetere per lubrificare, consentendo facile inserimento. Nota: Se uno si avverte resistenza durante l'inserimento del catetere, non continuare da inserire come questo può portare alla perforazione della parete intestinale. Rimuovere il catetere e tentare di reinserire delicatamente, ancora una volta la lubrificazione del colon come procedere.
- Iniettare lentamente 250 (ratti) o 100 (topi) microlitri di DNBS, o un volume uguale o etanolo al 50% per i controlli. Dopo aver iniettato il DNBS, posizionare l'animale a testa in giù per 90 secondi per evitare la perdita del DNBS.
- Dopo somministrazione DNBS, nutrire gli animali acqua saccarosio 8% in soluzione fisiologica 0,2% per prevenire la disidratazione durante la prima settimana.
- Osservare attentamente gli animali, con un monitoraggio quotidiano per la perdita di peso e segni di disidratazione o di disagio per tutta la durata dell'esperimento. Nota: La perdita di peso può avvicinarsi rapidamente le raccomandazioni CCAC di perdita di peso massimo. Da questo deriva prevalentemente da disidratazione, perdita di peso dovrebbe essere usata come indicatore per amministrare la soluzione di Ringer lattato per limitare la disidratazione. Si prega di essere sicuri di consultare il veterinario impianto sulle questioni sanitarie del caso.
2. Collecting tessuti e valutazione del danno istologico in DNBS Mice Challenged
- Al punto di tempo desiderato dopo sfida con DNBS, eutanasia animali da sovradosaggio con isoflurano in una camera di anestetico integrato con sufficiente ossigeno. Osservare l'animale fino a quando non salita o di discesa del torace è visto e non c'è battito cardiaco palpabile. Confermare l'animale è stato eutanasia correttamente assenza di una risposta al pinch punta o toccare della cornea, seguita da dislocazione cervicale.
- Aprire la cavità addominale e rimuovere l'intero intestino crasso. Aprire l'intestino longitudinalmente; ulcere mucose macroscopiche dovrebbero essere osservati circa 5-6 cm prossimale dall'estremità distale del colon nei ratti (2-3 cm nei topi). Nota: Dopo aver rimosso l'intestino crasso, valutare i punteggi danni macroscopici, se lo desideri. Raccogliere i segmenti del colon dalla corrispondente posizione anatomica da animali di controllo. Nota: Gli individui segnando il tessuto per i punteggi danni macroscopici dovrebberoessere accecato l'identità dei gruppi di trattamento. Punteggio sezioni di tessuto utilizzando i seguenti o simili criteri: gravità e l'estensione di ulcerazione (0-10), sommati con i punteggi per l'assenza o la presenza di diarrea (0 o 1), aderenze (0, 1 o 2) e lo spessore della parete del colon massimo in millimetri 11.
- Raccogliere 0,5 centimetri sezioni prossimali al sito del danno macroscopico massima. Snap congelare una sezione di 0,5 cm in azoto liquido per valutare successivamente mieloperossidasi (MPO) (una misura di infiltrazione di neutrofili), e posizionare l'altra sezione in 10% formalina tamponata neutra per l'analisi istologica. Nota: Snap tessuti congelati per l'analisi mieloperossidasi può essere conservato a -80 ° C per un massimo di 1 mese.
- Lasciare i tessuti prelevati per l'analisi istologica nel passaggio da 2.3 a fissare in formalina durante la notte, e poi lavare con il 70% di etanolo. Incorpora tessuti in paraffina e tagliati a spessore desiderato (3-5 micron), macchia con hemotoxylin e eosina (HE) per il punteggio istologico. Hanno due osservatori segnano almeno tre sezioni di tessuto da ogni animale sotto un microscopio ottico per determinare i punteggi danni istologici per ogni gruppo. Nota: Gli individui segnando il tessuto per i punteggi danni istologici devono essere accecati per l'identità dei gruppi di trattamento. Punteggio sezioni di tessuto utilizzando i seguenti criteri: o simili misura di infiltrato cellulare infiammatorio (0 = assente, 3 = transmurale), perdita di architettura della mucosa (0 = assente, 3 = grave), presenza o assenza di ascessi cripta (0-1) , e la deplezione delle cellule calice (0-3). Determinare il punteggio istologico danno come somma di questi punteggi 11.
3. Esecuzione di mieloperossidasi (MPO) Saggio sulla DNBS Sfidato tessuto intestinale
- Saggio di attività MPO nei 0,5 centimetri segmenti del colon ottenuti nella fase 2.3. Omogeneizzare tessuti in un tampone di omogeneizzazione MPO (0,5% hexadecyltrimethyl-ammonio bromuro in 50 mM tampone fosfato di potassio (pH 6,0)) a dare 50 mg colon segment / ml di sospensione tampone di omogeneizzazione.
- Aliquotare la soluzione omogeneizzato in 1 ml porzioni e centrifugare a 4 ° C per 2 min a 10.000 x g.
- Miscelare 100 ml di ciascuna soluzione con 2,9 ml di 50 mM tampone fosfato (pH 6.0) contenente 0,167 mg / ml di o-dianisidinedihydrochloride e 0,0005% di perossido di idrogeno in una cuvetta.
- Misurare il tasso di assorbanza utilizzando uno spettrofotometro a 460 nm. Nota: attività MPO è definita come la quantità di enzima degradante 1 pmol / min di H 2 O 2 H 2 O a temperatura ambiente ed è espressa in unità per mg di tessuto.
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Representative Results
Sfida di ratti (Sprague-Dawley) o topi (C57BL / 6) con DNBS si traduce in genere nella perdita di peso transitoria e diarrea, a volte con sangue presente nelle feci. Tuttavia, fattori quali la genetica, la dieta e le microbiota intestinale possono modificare la suscettibilità alla colite DNBS indotta. Pertanto, animali inclusi negli esperimenti dovrebbero essere dalla stessa istituzione, sia derivato localmente o ordinato in da un unico fornitore animale. Tutti gli animali devono essere attentamente monitorati per il grado di perdita di peso e sintomi di disagio subiti durante la colite.
I risultati presentati nelle figure 1-4 rappresentano un esperimento in cui gli effetti di tre oli alimentari: sono stati valutati olio di cartamo, olio di canola e di olio di pesce sulla gravità risultante DNBS colite. Le differenze statistiche tra i gruppi sono stati determinati utilizzando ANOVA seguito dal test post hoc di Tukey, utilizzando un programma software di analisi dei dati. Valore AP <0,05 era consire considerato significativo.
Dopo sfida intrarettale con DNBS (20 mg DNBS/250 ml di etanolo al 50%), perdita di peso significativa è stata osservata per 48 ore nei ratti integrati con FO e CO e 72 ore nei ratti integrati con SO (P <0.05). Massima perdita di peso è visto a 48 ore nei ratti integrati con FO e 72 ore nei ratti integrati con CO e SO. L'aumento di peso ripreso dopo 72 ore, e da 5 DNBS giorni postali, FO e così i gruppi mostrano pesi corporei simili ai valori basali. I ratti di controllo integrate con le diete e sfidati con etanolo intrarettale continuano ad aumentare di peso durante il periodo di studio di 5 giorni.
Il danno intestinale causata da DNBS può essere diffusa, tuttavia la zona di danno massima è generalmente localizzato alle distali 6 cm dalla colon nei ratti, e le distali 3 cm di topi. Macroscopicamente questo può essere osservato come ispessimento della parete del colon, ulcerazioni della mucosa, e l'adesione occasionale della distal colon agli organi adiacenti, come la vescica. Sulla valutazione istologica più stretta, ampia lesione epiteliale, in alcune aree che portano alla formazione di ulcere, infiltrazione di cellule immunitarie (prevalentemente neutrofili e linfociti), cryptitis, muco esaurimento, e l'edema si osserva. Sebbene questi segni istologici di infiammazione e danno tissutale sono evidenti in tutti e tre i gruppi petroliferi integrato dietetici su sfida con DNBS, il danno più grave è visto nel gruppo olio di cartamo, seguito dal gruppo olio di canola, mentre ratti nel gruppo olio di pesce dimostrano lesioni epiteliali minimo e una limitata infiltrazione di cellule infiammatorie nella mucosa (Figura 2).
Le differenze a danno istologico possono essere quantificate per consentire una migliore comparazione tra i gruppi. I criteri utilizzati per valutare il danno istologico incluso il grado di infiltrato infiammatorio cellulare, la perdita di architettura della mucosa, deplezione delle cellule calice, e la presenza di CRYPt ascessi. Mostrato in figura 3 sono i punteggi danni istologici per i tre gruppi petroliferi alimentari durante DNBS colite. Come si vede nelle sezioni H & E macchiati in figura 2, l'olio di cartamo completata gruppo ha la maggiore estensione del danno, seguito dal gruppo olio di canola, mentre il gruppo olio di pesce mostra la minor quantità di danni.
Il grado di infiltrato di cellule infiammatorie, in particolare dei neutrofili, può essere ulteriormente esaminato eseguendo una mieloperossidasi (MPO) saggio di attività. MPO è considerato un indicatore di infiammazione, in quanto è un enzima presente nei granuli dei granulociti neutrofili ed altre cellule della linea mieloide. Valutazione dell'attività MPO nel colon di ratto il giorno 5 esposizione post-DNBS rivela un aumento dell'attività in tutti e tre i gruppi (Figura 4). La maggiore attività MPO è osservata nel gruppo olio di cartamo, seguito dal gruppo olio di canola, mentre la più bassa attività MPO è visto nellagruppo olio di pesce, corrispondenti alle colonne danno istologico valutati in Figura 3.
Figura 1. Variazioni del peso corporeo (% del basale) in seguito alla somministrazione intrarettale del 50% di etanolo (controllo) o dinitrobenzene solfonico (DNBS) in donne adulti Sprague-Dawley (250-500 g) alimentato SO, CO, o FO. I ratti sono poi monitorati per la perdita di peso corporeo dal giorno 1 fino al giorno 5 post trattamento. La perdita percentuale di peso corporeo è tramato contro giorni dopo il trattamento DNBS. I valori sono media ± SEM, n = 5 / gruppo. Rispetto ai non-trattata DNBS omologhi, ratti alimentati con CO e FO aveva una significativa riduzione del loro peso corporeo iniziale fin dal giorno 1 trattamento post DNBS considerando che il giorno 3 tutti i tre gruppi di ratti avevano SIGficativi perdita di peso rispetto al peso basale (P <0.01). Tutti i gruppi di colite dimostrano l'aumento di peso dopo 72 ore, con il peso tornare al basale nel FO e gruppi SO alimentati. I ratti nei gruppi di controllo etanolo dimostrano l'aumento di peso durante il periodo di studio di 5 giorni. Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita .
Figura 2. Aspetto istologico di sezioni di tessuto del colon H & E colorati rappresentative cinque giorni dopo la somministrazione intrarettale del 50% di etanolo (CTL) o DNBS a ratti femmina adulti alimentato SO, CO, o FO. Il tessuto viene raccolto in formalina al 10% e ha permesso di fissare per un periodo minimo di 24 ore seguita da sezionamento dei tessuti e HE colorazione. Ilsezioni di tessuto di ratti alimentati SO e CO dimostrano notevoli turbative dei dell'integrità epiteliale con diversi gradi di lesione epiteliale, cripta drop out, formazione di ulcere e transmurale infiltrazione di cellule immunitarie, con i cambiamenti più marcati visto con SO. Nei topi nutriti CO, la prova di rigenerazione epiteliale e di restituzione è visto. Al contrario, ratti alimentati FO mantenuta l'integrità epiteliale e aveva infiltrazione limitato di cellule infiammatorie confinate alla lamina propria. (M-mucosa, SM-sub-mucosa e U-ulcera; ingrandimento originale 100X; barra della scala: 100 micron). Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita .
Figura 3. Danno istologico punteggio dei tessuti del colon 5 giorni aopo la somministrazione intrarettale del 50% di etanolo (chiara bar) o DNBS (bar solido) in ratti femmine adulte alimentato SO, CO, o FO. sezioni di tessuto sono segnati da un investigatore esperto, accecato ai trattamenti, utilizzando un criteri impostati sulla base istologica danni. I criteri utilizzati per questo studio include: infiltrazione infiammatoria delle cellule (0 = assente, 3 = transmurale), la perdita dell'integrità della mucosa (0 = assente, 3 = grave), la formazione di ascessi cripta (0 = assente, 1 = presente) deplezione delle cellule caliciformi (0 = assente, 3 = alto). Il punteggio danno istologico è determinato come somma dei punteggi ottenuti segnando un minimo di tre sezioni di tessuto da ogni animale. I risultati dimostrano chiaramente un danno istologico ridotta nei ratti alimentati FO rispetto al SO e CO ratti alimentati. I valori sono media ± SEM, n = 5 / gruppo. Rispetto ai rispettivi controlli di etanolo, l'amministrazione DNBS è associato ad un significativo aumento dei danni punteggio (P <0,05); colite gruppi con simboli diversi sono significativamente differenti (P <;. 0,01) Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita .
Figura 4. Attività MPO nei tessuti del colon cinque giorni dopo la somministrazione intrarettale del 50% di etanolo (chiara bar) o DNBS (bar solido) a ratti femmina adulti alimentati SO, CO, o FO. Tessuti del colon infiammate sono a scatto congelati in azoto liquido e analizzati per l'attività mieloperossidasi , come indice di granulociti infiltrazione. Ratti alimentati colitici FO mostra una ridotta attività MPO rispetto al SO e valori CO sono mezzi ± SEM, n = 5 / gruppo. Rispetto ai rispettivi controlli etanolo, somministrazione DNBS è associato ad un aumento significativo dell'attività MPO (P <0.001); colite gruppi con simboli diversi sono significantly differente (P <0,05). Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita .
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Discussion
Il modello DNBS descritto in questo protocollo è un modello valido, poco costoso, e riproducibile colite che può essere utilizzata per studiare vari aspetti della IBD. Quando somministrato per via rettale a ratti o topi, DNBS induce un sostanziale grado di infiammazione e danno tissutale nel colon, simile morbo di Crohn umano in termini di sue varie caratteristiche istologiche incluse infiltrazione transmurale di cellule polimorfonucleati e l'attivazione Th1 NF-kB-dipendente predominante.
Questo modello è stato utilizzato per studiare vari fattori ritenuti impatto sulle IBD come lo stress, la depressione, e la dieta, così come il coinvolgimento del sistema nervoso enterico, i meccanismi di riparazione del pregiudizio, infiammazione transmurale, e le terapie preclinici. Il modello DNBS è anche una valida alternativa per l'infiammazione TNBS indotta in topi e ratti e offre un'alternativa meno costosa ad altri modelli chimici comunemente impiegati di colite come DSS. La procedura descritta in questo protocol consentirà uno per eseguire con successo questo modello.
Coerentemente con altri modelli sperimentali di colite 13-16, lo studio rafforza gli effetti variabili di grassi alimentari sulla mucosa intestinale risposte immunitarie dove l'alta assunzione di EPA e DHA consumato prima e dopo l'esposizione DNBS attenua, mentre l'alta assunzione di ARA con un minimo di n -3 acidi grassi aggrava la colite. Gli effetti benefici di n-3 acidi grassi alimentari osservati in questo studio sono dovute in parte alla n-3 acidi grassi efficacemente inferiore tessuto fosfolipide ARA sia inibendo la sintesi di ARA da LA e sostituendo ARA con EPA e DHA. Questa modifica sposta il substrato acido grasso disponibile per il rilascio e la successiva sintesi degli eicosanoidi verso un ambiente meno proinfiammatorio. Al contrario, l'elevato apporto di acidi grassi n-6 è associato ad un alto ARA colon con successiva sintesi di mediatori proinfiammatori che esacerbare risposta immune mucosale. In keeping con il nostro recente studio Citrobacter rodentium indotta colite, ratti alimentati con olio di colza con meno ARA di olio di cartamo, ma con n-3 ALA e nessun EPA o DHA avuto una risposta infiammatoria intermedia 16.
Ci sono diversi passaggi critici che possono influire sulla corretta attuazione del modello DNBS. Diversi studi hanno utilizzato diverse concentrazioni di DNBS vanno 3-6 mg / mouse o 15-30 mg / ratto di stabilire colite. Pertanto, è importante per i singoli ricercatori per ottimizzare il dosaggio di DNBS per i loro studi, poiché dosi ottimali possono variare da un impianto animale all'altro. E 'anche importante notare che la concentrazione di DNBS sarà diverso a seconda del tipo e specie di animali che un investigatore utilizza (Es: alcuni ceppi possono essere più sensibili e altri più resistenti alla DNBS). Si deve prestare attenzione a garantire che la concentrazione di DNBS non sia troppo elevato poiché ciò può causare la rapida morte degli animali Resulting da perforazione intestinale e sepsi. Un altro passo fondamentale per usare questo modello sta sviluppando il metodo appropriato per inserire un catetere intrarectal nel colon distale dell'animale. La presenza di feci nel colon per garantire un'adeguata inserimento del catetere durante l'instillazione. Per evitare questo, comprimendo leggermente alla fine posteriore dell'ano di topi leggermente anestetizzati per rimuovere eventuali feci nel colon distale / retto. Si raccomanda di inserire il catetere di circa 3-4 cm dall'ano, anche se può essere esteso ad un massimo di 6-8 cm nei ratti fino alla flessura splenica (una curva a gomito tra trasversale e colon discendente) 7. È importante notare che durante la procedura instillazione, lubrificazione del catetere iniettando DNBS / etanolo in piccoli volumi renda più facile inserimento del catetere. Per evitare il reflusso retrogrado di DNBS fuori dell'ano, è fondamentale per tenere gli animali in una posizione a testa in giù per 90 sec, in alternativa, latopi possono essere conservati per 15 min in posizione di Trendelenburg (posizione supina in cui i piedi sono posti superiore alla testa del 15-30 °).
I tessuti possono essere raccolti in momenti selezionati a seconda degli interessi del ricercatore e se lo studio si sta concentrando su infiammazione acuta o cronica. Inoltre, i tessuti possono anche essere utilizzati per studiare i ENS intestinale e del sistema immunitario innato e adattativo. Tuttavia, è essenziale garantire che i tessuti siano correttamente campionati. Si raccomanda di raccogliere i tessuti in un ampio volume di formalina al 10% in 5 ml fiale al contrario di fiale di volume piccole per garantire una fissazione corretta. Adeguato fissazione dei campioni è una chiave per studiare sia il danno istopatologico e la visualizzazione di molecole bersaglio nei tessuti da H & E e immunostaining, rispettivamente. Punteggio istologico dei tessuti deve essere eseguita da persone esperte che sono accecati alle condizioni sperimentali, utilizzando criteri fissati stabiliti dal tegli 11,17 ricercatore individuale. Mieloperossidasi (MPO) serve come un buon marker di infiammazione, danno tissutale e l'infiltrazione dei neutrofili nei tessuti gastrointestinali 11. Per eseguire i test di MPO, si suggerisce di scatto congelare i tessuti in azoto liquido e il giorno dell'analisi, si consiglia di lavorare con i tamponi e soluzioni preparate di recente per ottenere le migliori e più precisi risultati. Questo modello può essere utilizzato anche per studiare le cellule infiammatorie che infiltrano l'intestino, i meccanismi coinvolti nella chemiotassi e trasmigrazione di cellule infiammatorie e vari meccanismi coinvolti nell'attivazione e rilascio di altri mediatori proinfiammatori coinvolti nel danno tissutale e mediatori coinvolti nel modulare la risposta infiammatoria e nella riparazione dei tessuti.
Gli svantaggi clinici attualmente osservati con l'utilizzo di farmaci immunosoppressori o destinata a una citochina proinfiammatoria, come TNF-α dovrebbero incoraggiare investigratori di sviluppare migliori strategie terapeutiche per gestire i pazienti con IBD. I modelli, come il modello DNBS, consente agli investigatori di aumentare la nostra comprensione della patogenesi delle IBD, potenzialmente identificare nuovi bersagli terapeutici e sviluppare / migliorare le strategie per controllare l'infiammazione attraverso l'uso di nuove vie infiammatorie e nuove terapie.
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Disclosures
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni di funzionamento a KJ dalle scienze naturali e ingegneria Research Council del Canada (NSERC) e il morbo di Crohn e Colite Foundation of Canada (CCFC). VM è supportato da un CFRI Fellowship e GB una borsa di studio laureato dal Canadian Institutes for Health Research (CIHR). BAV è un bambini con intestinale e disturbi epatici Foundation (CHILD), presidente della Pediatric IBD ricerca e il Canada Research Chair in Gastroenterologia Pediatrica e KJ è un Senior Scientist Clinico supportato dal bambino e il bambino e la famiglia Research Institute (CFRI) Programma Clinico scienziati Award , University of British Columbia.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 ml Syringe | BD Biosciences | 309659 | |
| 19 G Needle | BD Biosciences | 305187 | |
| Polyethylene tubing PE-50 | BD Biosciences | 427517 | for intrarectal administration in mice |
| Polyethylene tubing PE-90 | BD Biosciences | 427519 | for intrarectal administration in rat |
| DNBS | MP Bio | 150959 | |
| Tear gel | Novartis | 63601662596 | |
| 10% Formalin | Fisher | 5F93-4 | |
| Warming pad | Kent Scientific | TPZ-0510 | |
| Ethanol | Fisher | A-962.4 | |
| Hexadecyltrimethyl-ammonium bromide | Sigma-Aldrich | H5882 | |
| Potassium phosphate buffer solution | Sigma-Aldrich | 79628- | |
| o-Dianisidine dihydrochloride | Sigma-Aldrich | D3252 | |
| 30% H2O2 | Sigma-Aldrich | 31642 | hydrogen peroxide |
| Spectrophotometer | BioRad | Benchmarker Plus | |
| Light Microscope | Zeiss | Axio Image.Z1 | |
| Data analysis software program | GraphPad Software | GraphPad Prism Software Version 4.00 | www.graphpad.com |
References
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