DNBS / TNBS inducerad kolit erbjuder ett alternativ och billig metod för att studera pathobiologyen av inflammatorisk tarmsjukdom. Protokollet diskuteras i detta dokument beskriver en framgångsrik tillämpning av DNBS att inducera kolit hos möss och råttor, och gör att man noggrant studera värdmedierad intestinal svar.
Inflammatoriska tarmsjukdomar (IBD), inklusive Crohns sjukdom och ulcerös kolit, har länge varit förknippad med en genetisk grund, och mera nyligen värd immunsvar mot mikrobiella och faktorer i miljön. Dinitrobensen sulfonsyra (DNBS)-inducerad kolit gör att man kan studera patogenesen för IBD tillhörande miljö-triggers som stress och kost, effekter av potentiella terapier, och mekanismerna bakom tarminflammation och mucosal skada. I denna skrift har vi undersökt effekterna av diet n-3 och n-6-fettsyror på colonic mucosal inflammatoriska svaret på DNBS-inducerad kolit hos råttor. Alla råttorna matades identiska dieter med undantag för olika typer av fettsyror [tistelolja (SO), rapsolja (CO) eller fiskolja (FO)] under tre veckor före exponering för intrarektal DNBS. Kontroll råttor som fick intrarektal etanol fortsatte upp i vikt under 5 dagars studie, medan, DNBS-behandlade råttor som matats fettdieter alla lost vikt med FO och CO matade råttor visar betydande viktminskning med 48 timmar och råttor som matats SO med 72 tim. Viktökning återupptas efter 72 timmar efter DNBS, och 5 dagar efter DNBS hade FO-gruppen en högre kroppsvikt än SO eller CO-grupper. Kolon sektioner samlas fem dagar efter DNBS-behandling visade fokal sår, crypt förstörelse, bägare cellbristen, och mucosal infiltration av både akuta och kroniska inflammatoriska celler som skilde sig i svårighetsgrad mellan dietgrupperna. Den så trött gruppen visade den allvarligaste skadan, följt av CO, och FO matade grupper som visade den mildaste graden av vävnadsskada. Likaså colonic myeloperoxidas (MPO)-aktivitet, en markör för neutrofil aktivitet var signifikant högre i den följd av CO matade råttor, med FO råttor matade med signifikant lägre MPO-aktivitet. Dessa resultat visar att användningen av DNBS-inducerad kolit, som beskrivs i detta protokoll, för att bedöma effekten av dieten i patogenesen för IBD.
Inflammatorisk tarmsjukdom (IBD) kännetecknas av kronisk återkommande inflammationer i det gastrointestinala (GI) området, vilket resulterar i symtom på diarré, viktminskning, och buksmärtor. Ulcerös kolit (UC) och Crohns sjukdom (CD) är de två huvudsakliga formerna av IBD, och kan särskiljas genom platsen för inflammation i mag-tarmkanalen. I UC patienter, inflammationen innebär normalt ändtarmen och sträcker sig intill varandra upp i tjocktarmen för ett varierande utsträckning påverkar bara den ytliga slemhinnan. Däremot kan CD påverka någon del av mag-tarmkanalen, även om det främst drabbar ileum och blindtarmen. CD manifesterar ofta som transmural inflammation förknippas ofta med granulom och leder till stricturing (fibrostenotic) och / eller penetrerande (fistulizing) sjukdom. Även om etiologin av IBD är fortfarande instabil, är det väl accepterat att IBD är multifaktoriell, involverar interaktioner mellan värdarna immunsystem, genetisk känslighet och ansvarSES till miljö-och mikrobiella faktorer.
Hittills har olika modeller av IBD föreslagits att visa olika kliniska, histologiska och immunsvar som är karaktäristiska för UC och CD. De vanligaste modellerna omfattar genetiskt modifierade möss (IL-2, IL-10, SAMP / Yit), infektion inducerade modeller (Citrobacter rodentium, Salmonella typhimurium), adoptiv överföringsmodeller (CD45 + RB Hög, CD62L + cellöverföring i SCID-möss) och kemiskt inducerad kolit modeller (Dextran natriumsulfat (DSS), trinitrobensensulfonsyra (TNBS), och dinitrobensen sulfonsyra (DNBS)). På grund av deras låga kostnader och snabbt insättande av sjukdom, är kemiska modeller anses ovärderlig för studier av olika aspekter av IBD. Var och en av de kemiska kolit modeller som anges har fördelar och begränsningar i vissa aspekter av deras kliniska, immunologiska och histopatologiska relevans för IBD. DSS är ett av de vanligaste kemiska metoder som används för att inducera colitis hos gnagare 1. Administration av 3-10% DSS (MW: 42 kDa) i 7-10 dagar i dricksvattnet hos möss kan framkalla symtom och tecken på kolit inklusive viktminskning, diarré med blod, kolon förkortning, mucosal sår och neutrofil infiltration. Denna modell är speciellt användbart för drogscreeningstudier, samt utforska mekanismerna för epithelial förnyelse, effekterna av medfödd immunitet på slemhinnor homeostas, och rollen av inflammation i främjandet av intestinal dysplasi och adenocarcinom utveckling. Det finns dock vissa nackdelar med DSS-modellen, bland annat variationer i koncentrationen av DSS behövs för att framkalla kolit hos olika djuranläggningar, samt inkonsekvent vattenupptagning från möss och därmed inkonsekvent exponering för DSS, vilket resulterar i variationer i grad, omfattning och distribution av gastrointestinala skador och sår i kolon. Alla dessa funktioner leder till heterogenitet resultat och begränsar möjligheten att jämföra resultat mellan studier frOM olika forskargrupper.
Ett alternativ till DSS-modellen är den hapten-inducerade DNBS eller TNBS modeller av kolit. Denna modell använder rektal instillation av slemhinnor sensibiliserande ämnen DNBS eller TNBS, utspädda i varierande koncentrationer av etanol. Administreringen av etanol är en förutsättning för att bryta den colonic mucosal barriären för att medge penetrering av DNBS eller TNBS i lamina propria. DNBS / TNBS kommer sedan haptenize de lokaliserade kolon och tarmmikrobiella proteiner för att bli immunogena, vilket orsakade den värd medfödda och adaptiva immunsvar. I allmänhet är denna modell i samband med allvarlig och ibland blodig diarré, viktminskning och tarmvägg förtjockning men symptomen varierar beroende på vilken typ av gnagare som används, liksom tidpunkten, dosen och graden av exponering för DNBS eller TNBS används i studien. Viktiga skillnader mellan råttor och möss bör noteras, med fördelarna av lägre kostnader för inköp och styrelse, samt lower kroppsmassa för att minska per-djur kostnader för behandling in vivo. Detta skall ställas mot den mer plötslig och svår kurs av kolit i möss, där de mer ömtåliga och lyhörda djur snabbt kan nå en human slutpunkt.
Den tarminflammation leder initialt ur etanol-inducerad skada på tarmepitelceller, vilket leder till ökad epitelial permeabilitet, mikrobiell penetration in i slemhinnan, haptenization av värdproteiner, allt detta resulterar i infiltrering av neutrofiler, makrofager och Th1-T-lymfocyter in i den skadade slemhinnan. I jämförelse med DNBS är TNBS betraktas som en farlig kemikalie på grund av sin mycket oxidativa egenskaper som kan utgöra en risk för explosion vid kontakt med baser såsom natrium-och kaliumhydroxid. Därför DNBS för närvarande betraktas som en föredras av kemikalier över TNBS att framkalla kolit. Hos gnagare är DNBS kolit anses som en av de mest praktiska metoder för att studera fölvinge IBD associerade modifierare av sjukdom:
Jämfört med DSS-modellen, fördelarna med DNBS och TNBS-inducerade kolit innefattar låg kostnad, snabb utveckling av kolit (kräver vanligtvis 1-3 dagar att visa reproducerbar sår och inflammation) och konsekvent lokaliserad skada på distala kolon. Men nackdelarna är ett krav på enhögre teknisk kompetens, optimering av DNBS / TNBS dos, och behovet av anestesi för rektal administrering.
I detta metod papper studerade vi effekterna av olika koncentrationer av n-6 och n-3 fleromättade fettsyror på att förändra kolon mukosalt svar på DNBS-inducerad kolit hos råttor genom att använda vegetabiliska oljor safflorolja (SO) och rapsolja (CO) , och fiskolja (FO). Det har visat sig att n-6 och n-3-fettsyror är viktiga mediatorer av intestinala inflammatoriska sjukdomar genom deras roll som acylenheter av cellmembran phosopholipids 9. I motsats till den proinflammatoriska potentialen av n-6-fettsyror, n-3-fettsyror vid tillräckligt höga intag är potentiellt potenta anti-inflammatoriska medel. De antiinflammatoriska åtgärder av n-3-fettsyror förmedlas direkt genom ersättning av arakidonsyra som eikosanoid substrat, hämma arakidonsyrametabolism och indirekt genom förändring av proinflammatory genuttryck och cellsignalering. De n-3-fettsyror ger också upphov till resol, en familj av anti-inflammatoriska mediatorer. Högt intag av n-3-fettsyror är associerad med en minskning i produktionen av proinflammatoriska eikosanoider, cytokiner, kemokiner, reaktiva syretyper och uttryck av vidhäftningsmolekyler. I denna studie gavs råttor matades ad libitum dieter identiska i samtliga näringsämnen förutom fettsyror, med, som en procent energi från fett, 20% SO, 20% CO, eller 18% fiskolja plus 2% safflorolja (FO) 10-11 . I procent av det dagliga energi, SO kost förutsatt 15% linolsyra (LA), med <0,06% α-linolensyra (ALA) och ingen eikosapentaensyra (EPA) och dokosahexaensyra (DHA), hade CO kost 4.2 % LA och 1,9% ALA utan EPA och DHA, och FO dieten förutsatt 1,4% EPA, 4,9% DHA, 0,32% LA, och 0,12% ALA. Tre veckor efter initiering av fettdieter, mössen administrerades intrarektala DNBS eller 50% etanol och avlivades 5 dagar senare. Den inflammatory respons utvärderades genom bedömning av viktminskning, histologiska skador poäng och vävnads myeloperoxidasaktivitet.
Den DNBS modell beskrivs i detta protokoll är en värdefull, billigt och reproducerbar kolit-modell som kan användas för att studera olika aspekter av IBD. Vid administrering intrarektalt till råttor eller möss, DNBS inducerar en väsentlig grad av inflammation och vävnadsskada i tjocktarmen, som liknar människans Crohns sjukdom i termer av dess olika histologiska funktioner inklusive transmural infiltration av polymorfonukleära celler och dominerande NF-kB-beroende Th1 aktivering.
D…
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöddes av administrationsbidrag till KJ från naturvetenskaplig och teknisk forskning Council of Canada (NSERC) och Crohns och kolit Foundation of Canada (CCFC). VM stöds av en CFRI Gemenskap och GB en examen studentship från den kanadensiska Institutes for Health Research (CIHR). BAV är ett barn med Intestinal och leversjukdomar Foundation (CHILD) ordförande för pediatrisk IBD forskning och Kanada forskning ordförande i Pediatric Gastroenterology och KJ är en Senior Clinician Scientist stöd av barnet och barn-och familje Forskningsinstitut (CFRI) Clinician Forskare Award Program , University of British Columbia.
1 mL syringe | BD Biosciences | 309659 | |
19 gauge needle | BD Biosciences | 305187 | |
Polyethylene tubing PE-50 | BD Biosciences | 427517 | for intra-rectal administration in mice |
Polyethylene tubing PE-90 | BD Biosciences | 427519 | for intra-rectal administration in rat |
DNBS | MP Bio | 150959 | |
tear gel | Novartis | 63601662596 | |
10% Formalin | Fisher | 5F93-4 | |
warming pad | Kent Scientific | TPZ-0510 | |
Ethanol | Fisher | A-962.4 | |
hexadecyltrimethyl-ammonium bromide | Sigma-Aldrich | H5882 | |
Potassium phosphate buffer solution | Sigma-Aldrich | 79628- | |
O-dianisidine dihydrochloride | Sigma-Aldrich | D3252 | |
30% H2O2 | Sigma-Aldrich | 31642 | hydrogen peroxide |
Spectrophotometer | BIORAD | Benchmarker Plus | |
Light Microscope | Zeiss | Axio Image.Z1 | |
Data analysis software program | GraphPad Software | GraphPad Prism Software Version 4.00 | San Diego California USA, www.graphpad.com |