Biokjemiske analyser med rekombinant humant MHC II molekyler kan gi raske, kvantitative innsikt i immunogent epitope identifikasjon, sletting, eller design. Her blir et peptid-MHC II-bindingsanalysen skalert til 384-brønners plater som er beskrevet. Denne kostnadseffektive format bør være nyttige innen protein deimmunization og vaksine design og utvikling.
Biokjemiske analyser med rekombinant humant MHC II molekyler kan gi raske, kvantitative innsikt i immunogent epitope identifikasjon, sletting, eller design 1,2. Her blir et peptid-MHC II-bindingsanalysen skalert til 384-brønnformat. Den nedskalert protokollen reduserer reagenvolumer kostnadene med 75% og er høyere gjennomstrømning enn tidligere beskrevet 96-brønners protokoller 1,3-5. Nærmere bestemt tillater den eksperimentelle utforming robust og reproduserbar analyse av opp til 15 peptider mot en MHC II allel pr 384-brønners ELISA-plate. Ved hjelp av en enkelt væskehåndtering robot, gir denne metoden en forsker for å analysere omtrent nitti testpeptider i triplikat over et område av åtte konsentrasjoner og fire MHC II-allel typer i mindre enn 48 timer. Andre som jobber innen protein deimmunization eller vaksine design og utvikling kan finne protokollen til å være nyttig i å tilrettelegge eget arbeid. Spesielt de trinnvise instruksjoner og visuelt formatav Jove bør tillate andre brukere å raskt og enkelt skape denne metodikken i sine egne laboratorier.
Proteiner er den raskest voksende klassen av terapeutiske midler 6, og den raske utvidelsen av bioterapeutiske rørledninger har fokusert økende oppmerksomhet på utfordringer knyttet til utvikling og bruk av protein narkotika. En unik faktor stammer fra det faktum at, i en sunn og fungerende immunsystem blir alle ekstracellulære proteiner samplet av antigen-presenterende celler (APCer). Når internalisert av APC, er et protein spaltes i små peptid fragmenter, og antatte immunogene segmenter er lastet inn i sporet i klasse II store histocompatibility komplekse proteiner (MHC II). De peptid-MHC II-kompleksene blir deretter vist på APC overflate, og sann immunogene peptider, betegnet T-celle-epitoper, danner ternære II MHC-peptid-T-celle-reseptor-komplekser med beslektede CD4 T-celleoverflatereseptorer 7. Denne kritiske molekylær anerkjennelse hendelsen initierer en kompleks signalering kaskade, noe som resulterer i T-celleaktivering, utgivelsen av cytokins, CD4 T-celle-mediert B-celle modning, og til slutt produksjon av sirkulerende IgG antistoffer som binder seg til og fjerne den fornærmende eksogene protein. Dermed kan immunogene proteiner bli deimmunized ved å identifisere konstituerende T-celle epitoper og mutere viktige rester ansvarlige for MHC II kompleks formasjon. Det bærer bemerker imidlertid at T-celle epitoper kan være mange og bredt fordelt gjennom immunogene proteiner, og de fleste av epitop-sletting mutasjoner vil sannsynligvis føre til en utilsiktet tap av proteinfunksjon eller stabilitet. Derfor, engineering deimmunized biotherapies kan være en kompleks og teknisk utfordrende mål, men det finnes flere eksempler på vellykkede T celle epitop sletting prosjekter 3,5,8-12. I motsetning til pode-baserte "menneskeliggjøring", som i stor grad begrenset til antistoff legemiddel, kan epitope sletting brukes på omtrent alle tenke protein mål uansett rekkefølge, struktur, funksjon, eller tilgjengeligheten av homologooss menneskelige stillaser. Det første skrittet til å implementere en slik tilnærming er identifisering av viktige peptidepitoper innebygd i målet protein sekvens.
Høy gjennomstrømning biokjemiske analyser ved hjelp syntetiske peptider og rekombinante humane MHC II molekyler kan gi raske foreløpige innsikt i epitop identifisere og redusere 1,3-5. Disse ELISA typen analyser kan være et kraftig supplement til andre protein / vaksine design og utviklingsverktøy. For eksempel, en godt etablert eksperimentell tilnærming til epitop kartlegging er avhengig av tid, arbeid og ressurskrevende ex vivo celleproliferasjon analyser 15. I korthet blir den primære sekvens av et målprotein først delt inn i et panel av overlappende peptider, ofte 15-mers med 12 rester overlapping mellom tilstøtende peptider. Peptidet panelet blir kjemisk syntetisert og immunogenisiteten av hvert peptid testes i en av flere forskjellige immunologiske målinger som anvender perifere blood mononukleære celler (PBMC) ble isolert fra humane givere 13,14. For å gi større tillit til resultatene, er peptider vanligvis testet i replikere med PBMC fra 50 eller flere ulike givere. I tilfeller der deimmunization er det ultimate målet, er arbeidet forsterkes ytterligere av behovet for å produsere flere paneler av muterte peptider og teste de nye peptid paneler i PBMC analyser før innføring eventuelle deimmunizing mutasjoner i full lengde protein for påfølgende funksjonsanalyse 10. Selv om disse cellulære analyser forblir gullstandarden for vurdering av immunogene potensial i humane pasienter, kan effektiviteten av en slik metode uttømmende forbedres ved prefiltering putative immunogene epitoper ved hjelp av en hurtig og høy gjennomstrømning II MHC-peptid-bindingsanalyse.
På samme måte kan biokjemiske peptid-MHC II-bindingsanalyser kombineres med prediktiv in silico metoder for å radikalt akselerere epitop identifikasjonsprosessen.Det finnes en rekke dataverktøy for T-celle epitop prediksjon; eksempler inkluderer ProPred 16, MHCPred 17, SVRMHC 18, ARB 19, SMM-align 20, NetMHCIIpan 21 samt proprietære verktøy som EpiMatrix etter EpiVax 22. Likeledes har epitop prediktorer nylig blitt kombinert med andre bioinformatikk og molekylær modelleringsverktøy for å vike integrerte protein deimmunization algoritmer designet for å redusere risikoen for at deimmunizing mutasjoner kan forstyrre protein struktur og funksjon 23-26. Mens flere epitop prediktorer har vist seg å være rimelig nøyaktig 27,28, beregningsresultatene alltid kreve eksperimentell validering. Rapid, høy gjennomstrømning, og kostnadseffektive eksperimentelle metoder som er best egnet som en foreløpig filter for i silikofluorid epitope spådommer.
På samme måte, kan epitop prediktorer kjøre antigen utvalg for omvendt vaccinology 29,30. For eksempel, har fremskritt innen bioinformatikk ga hele genomet skjermer som raskt identifiserer vaksinekandidater i form av hele proteiner eller peptidepitoper hentet fra patogen proteomes. Selv om dette slik teknologi er omforme oppdagelse og utvikling av beskyttende vaksiner, introduserer det en ny utfordring i form av intractably store lister over immunogene vaksinekandidater. Høy gjennomstrømming peptid-MHC II bindingsanalyser kan veilede epitope valg ved å tallfeste peptid bindingsaffiniteten og bindende promiskuitet blant flere MHC II alleler. Som med protein deimmunization, er slike eksperimentelle metoder til slutt nødt til å validere beregnings prediksjon av lovende vaksine fører.
Her blir et peptid-MHC II-bindingsanalysen skalert til 384-brønnformat beskrevet. Protokollen er svært parallelliserte og reduserer reagenvolumer kostnadene med 75% sammenlignet med tidligere beskrevet 96-brønns plate formater 1,3-5. Ved hjelp av et enkelt avviklingd håndtering robot, gir denne metoden en forsker å enkelt analysere omtrent nitti test peptider i tre eksemplarer over et utvalg av åtte konsentrasjoner og fire MHC II allel typer i mindre enn 48 timer. Denne artikkelen beskriver oppsett av en 384-brønnen ELISA-plate for analyse av syv eksperimentelle peptider mot en MHC II allel, men regneark kalkulatorer er gitt som supplerende materiale, slik at det enkelt kan skalere eksperimentet til en rekke ønskede peptider og / eller MHC II molekyler.
Biotherapeutics har etablert seg som en hjørnestein i moderne medisin, som representerer fire av de fem som selger narkotika i 2012 32. Sektoren Biopharmaceutics har vist vedvarende vekst i flere år 6, og den pågående utviklingen av nye midler, samt fremveksten av biosimilars har utvidet biofarmasøytisk rørledninger. Se fremover, vurdere og dempe immunogenisitet av protein legemiddelselskap vil bli en integrert del av tidlig stadium biotherapeutic utvikling. For å lette denne prosessen, kan …
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av NIH tilskudd R01-GM-098 977 og R21-AI-098122 til CBK og KEG. RSS ble støttet delvis av en Luce Foundation Fellowship og delvis av en Thayer Innovation Program Fellowship fra Thayer School of Engineering.
Sodium Tetraborate Decahydrate | Sigma | 221732 | |
Citric Acid | Sigma | C1901 | |
Dibasic Sodium Phosphate | Sigma | S7907 | |
Trizma HCl | OmniPur | 9310 | |
Tween-20 | Sigma | P7949 | |
100% DMSO | Sigma | D8418 | |
Octyl-β-D-Glucopyranaside | Fischer | 29836-26-8 | |
Pefa Bloc SCF | Roche | 1158591600 | |
Dulbecco’s 10X Phosphate Buffered Saline | Invitrogen | 14200-166 | |
DELFIA Assay Buffer | Perkin Elmer | 4002-0010 | |
DELFIA Enhancement Buffer | Perkin Elmer | 4001-0010 | |
Europium Labelled Streptavidin | Perkin Elmer | 1244-360 | |
L243 anti-HLA-DR antibody | Biolegend | 307602 | |
Biotinylated tracer peptides | 21st Century Biochemicals | Custom Order | |
Test peptides (1-4mg, 85% purity) | Genscript | Custom Order | |
Purified HLA-DRB1 monomers (non-biotinylated) | Benaroya Research Institute* | Custom Order | |
384-well white EIA/RIA plate | Thermo | 460372 | |
Polypropylene 384-well plate | Costar | 3656 | |
Film, AxySeal, 80 µm, ELISA Applicator | Axygen Asicentific | PCR-SP | |
MilliQ Water | N/A | N/A | |
Epimotion Liquid Handler (or similar) | Eppendorf | 5075 | |
Select TS Plate Washer (or similar) | BioTek | 405 | |
SpectraMax Gemini Microplate Reader (or similar) | Molecular Devices | N/A | |
*Recombinant human MHC II molecules can be obtained from the Benaroya Tetramer Core Laboratory. See: https://www.benaroyaresearch.org/our-research/core-resources/tetramer-core-laboratory |