Un ensayo de unión de alto rendimiento MHC II para el análisis cuantitativo del péptido epítopos
Summary
Ensayos bioquímicos con moléculas recombinantes humanas MHC II pueden proporcionar rápidas, ideas cuantitativos en la identificación epítopo inmunogénico, eliminación o diseño. Aquí, se describe un ensayo de unión péptido-MHC II a escala para placas de 384 pocillos. Este formato rentable puede ser muy útil en los campos de desinmunización proteínas y diseño y desarrollo de vacunas.
Abstract
Ensayos bioquímicos con moléculas recombinantes humanas MHC II pueden proporcionar rápidas, ideas cuantitativos en la identificación epítopo inmunogénico, eliminación, o el diseño de 1,2. Aquí, un ensayo de unión péptido-MHC II se escala al formato de 384 pocillos. El protocolo reducido reduce los costes de reactivos en un 75% y es mayor rendimiento que se ha descrito anteriormente protocolos de 96 pocillos 1,3-5. Específicamente, el diseño experimental permite el análisis robusto y reproducible de hasta 15 péptidos contra un alelo de MHC II por 384 pocillos de placas de ELISA. El uso de un solo robot de manejo de líquidos, este método permite a un investigador para analizar aproximadamente noventa péptidos de ensayo por triplicado en un rango de concentraciones de ocho y cuatro tipos de alelos de MHC II en menos de 48 horas. Otros trabajan en los campos de la desinmunización proteína o el diseño y desarrollo de vacunas que encuentre el protocolo para ser útil en la facilitación de su propio trabajo. En particular, las instrucciones paso a paso y el formato visualde Jove debe permitir que otros usuarios establecer rápida y fácilmente esta metodología en sus propios laboratorios.
Introduction
Las proteínas son la clase de más rápido crecimiento de agentes terapéuticos 6, y la rápida expansión de ductos bioterapéuticos se ha centrado cada vez más atención en los retos asociados con el desarrollo y el uso de fármacos de proteínas. Una consideración único surge del hecho de que, en un sistema inmunológico saludable y en funcionamiento, todas las proteínas extracelulares son muestreadas por las células presentadoras de antígeno (APCs). Una vez internalizado por las APC, una proteína se escinde en pequeños fragmentos de péptidos, y los segmentos inmunogénicos putativos se cargan en la ranura de clase II proteínas principales complejos de histocompatibilidad (MHC II). Los complejos de péptido-MHC II se muestran entonces en la superficie de APC, y verdaderos péptidos inmunogénicos, denominados epítopos de células T, formar complejos ternarios receptor de células MHC II-péptido-T con receptores de la superficie celular T CD4 afines 7. Este evento crítico reconocimiento molecular inicia una cascada compleja de señalización, lo que resulta en la activación de células T, la liberación de citoquinas, CD4 T mediada por células B maduración de las células, y en última instancia, la producción de anticuerpos IgG circulantes que se unen y restablezcan la proteína exógena infractor. Por lo tanto, las proteínas inmunogénicas pueden ser desinmunogénico mediante la identificación de constituyentes epítopos de células T y la mutación de residuos clave responsables de la formación de complejos de MHC II. Vale la pena observar, sin embargo, que los epítopos de células T pueden ser numerosos y ampliamente distribuida en toda proteínas inmunogénicas, y la mayoría de las mutaciones epítopo borrar es probable que causen una pérdida inadvertida de la función de proteínas o la estabilidad. Por lo tanto, la ingeniería desinmunogénico bioterapias pueden ser un objetivo complejo y técnicamente difícil, pero existen varios ejemplos de éxito T epítopos de células proyectos de eliminación 3,5,8-12. A diferencia de injerto a base de "humanización", que se limita en gran medida a la terapéutica de anticuerpos, eliminación epítopo se puede aplicar a esencialmente cualquier proteína objetivo, independientemente de la secuencia, estructura, función, o la disponibilidad de homólogonos andamios humanos. El primer paso para la implementación de un enfoque de este tipo es la identificación de epítopos peptídicos clave incrustados dentro de la secuencia de la proteína diana.
Ensayos bioquímicos alto rendimiento usando péptidos sintéticos y moléculas recombinantes humanas MHC II pueden proporcionar rápidas penetraciones preliminares sobre identificación y mitigación epítopo 1,3-5. Estos ensayos de tipo ELISA pueden ser un poderoso complemento a otras de diseño y desarrollo de proteínas / vacunas herramientas. Por ejemplo, un método experimental bien establecido para el mapeo de epítopos se basa en el tiempo, el trabajo y muchos recursos ex vivo ensayos de proliferación celular intensivos 15. Brevemente, la secuencia primaria de una proteína diana se divide primero en un panel de péptidos solapantes, a menudo 15-meros con 12 residuos de solapamiento entre los péptidos adyacentes. El panel de péptido se sintetiza químicamente y la inmunogenicidad de cada péptido se prueba en uno de los varios inmunoensayos que emplean diferentes Bloo periféricacélulas mononucleares de d (PBMC) aisladas de donantes humanos 13,14. Para proporcionar una mayor confianza en los resultados, los péptidos se prueban típicamente por duplicado con PBMC de 50 o más donantes diferentes. En los casos en que desinmunización es el objetivo final, el trabajo se complica aún más por la necesidad de producir paneles adicionales de péptidos mutados y probar los nuevos paneles de péptidos en ensayos de PBMC antes de introducir cualquier mutación deimmunizing a la proteína de longitud completa para el análisis funcional posterior 10. Si bien estos ensayos celulares siguen siendo el estándar de oro para evaluar el potencial inmunogénico en pacientes humanos, la eficacia de este enfoque exhaustiva podría ser mejorado por prefiltrado epítopos inmunogénicos putativos utilizando un rendimiento rápido y alta ensayo de unión de MHC II-péptido.
Del mismo modo, los ensayos de unión péptido-MHC II bioquímicos se pueden combinar con predictivo métodos in silico para acelerar radicalmente el proceso de identificación epítopo.Existen una variedad de herramientas computacionales para la predicción epítopo de células T, e incluye ProPred 16, MHCPred 17, SVRMHC 18, ARB 19, SMM-alinear 20, NetMHCIIpan 21, así como las herramientas propietarias como EpiMatrix por EpiVax 22. Del mismo modo, los predictores de epítopos recientemente se han combinado con otras herramientas de bioinformática y modelado molecular para producir algoritmos desinmunización proteínas integradas diseñadas para mitigar el riesgo de que las mutaciones deimmunizing pudiesen afectar a la estructura y función de proteínas 23-26. Mientras que varios predictores de epítopos han demostrado ser razonablemente exacta 27,28, resultados computacionales invariablemente requieren validación experimental. Métodos experimentales rápido, de alto rendimiento y rentables son los más adecuados como filtro preliminar para las predicciones de epítopos silico.
En una línea similar, los predictores de epítopos pueden conducir la selección de antígenos para vaccinolo inversagy 29,30. Por ejemplo, los avances en la bioinformática han arrojado entero genoma pantallas que identifican rápidamente vacunas candidatas en forma de proteínas enteras o epítopos de péptidos extraídos de proteomas de agentes patógenos. Si bien esta tecnología está dando nueva forma que permite el descubrimiento y desarrollo de vacunas protectoras, introduce un nuevo reto en forma de incurablemente grandes listas de candidatos a vacunas inmunogénicas. Ensayos de unión de alto rendimiento de péptido-MHC II pueden guiar la selección epítopo mediante la cuantificación de la afinidad de unión del péptido y la promiscuidad de unión entre los múltiples alelos de MHC II. Al igual que con desinmunización proteínas, tales métodos experimentales son, en última instancia requieren para validar la predicción computacional de clientes potenciales de vacunas prometedoras.
Aquí, se describe un ensayo de unión péptido-MHC II a escala al formato de 384 pocillos. El protocolo es altamente paralelizado y reduce los costes de reactivos en un 75% en comparación con el anteriormente descrito de 96 pocillos formatos de placa 1,3-5. El uso de un solo liquid robot de manipulación, este método permite a un investigador para analizar fácilmente aproximadamente noventa péptidos de ensayo por triplicado en un rango de concentraciones de ocho y cuatro tipos de alelos de MHC II en menos de 48 horas. En este artículo se describe la instalación de una placa de 384 pocillos de ELISA para el análisis de los siete péptidos experimentales contra un alelo MHC II, pero las calculadoras de hoja de cálculo se proporcionan como material complementario a fin de escalar fácilmente el experimento a cualquier número de péptidos y / o MHC deseados II moléculas.
Protocol
Representative Results
Discussion
Biotherapeutics se han establecido como uno de los pilares de la medicina moderna, que representan cuatro de las cinco principales drogas que venden en 2012 32. El sector de la biofarmacia ha mostrado un crecimiento sostenido durante varios años y 6, y el desarrollo continuo de nuevos agentes, así como la aparición de los biosimilares se ha expandido ductos biofarmacéuticos. Mirando hacia el futuro, evaluar y mitigar la inmunogenicidad de las proteínas terapéuticas se convertirá en una parte…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por subvenciones del NIH R01-GM-098 977 y R21-AI-098 122 para CBK y KEG. RSS fue apoyado en parte por una beca de la Fundación Luce y en parte por una beca del Programa de Innovación Thayer de la Escuela de Ingeniería Thayer.
Materials
| Sodium Tetraborate Decahydrate | Sigma | 221732 | |
| Citric Acid | Sigma | C1901 | |
| Dibasic Sodium Phosphate | Sigma | S7907 | |
| Trizma HCl | OmniPur | 9310 | |
| Tween-20 | Sigma | P7949 | |
| 100% DMSO | Sigma | D8418 | |
| Octyl-β-D-Glucopyranaside | Fischer | 29836-26-8 | |
| Pefa Bloc SCF | Roche | 1158591600 | |
| Dulbecco’s 10X Phosphate Buffered Saline | Invitrogen | 14200-166 | |
| DELFIA Assay Buffer | Perkin Elmer | 4002-0010 | |
| DELFIA Enhancement Buffer | Perkin Elmer | 4001-0010 | |
| Europium Labelled Streptavidin | Perkin Elmer | 1244-360 | |
| L243 anti-HLA-DR antibody | Biolegend | 307602 | |
| Biotinylated tracer peptides | 21st Century Biochemicals | Custom Order | |
| Test peptides (1-4mg, 85% purity) | Genscript | Custom Order | |
| Purified HLA-DRB1 monomers (non-biotinylated) | Benaroya Research Institute* | Custom Order | |
| 384-well white EIA/RIA plate | Thermo | 460372 | |
| Polypropylene 384-well plate | Costar | 3656 | |
| Film, AxySeal, 80 µm, ELISA Applicator | Axygen Asicentific | PCR-SP | |
| MilliQ Water | N/A | N/A | |
| Epimotion Liquid Handler (or similar) | Eppendorf | 5075 | |
| Select TS Plate Washer (or similar) | BioTek | 405 | |
| SpectraMax Gemini Microplate Reader (or similar) | Molecular Devices | N/A | |
| *Recombinant human MHC II molecules can be obtained from the Benaroya Tetramer Core Laboratory. See: https://www.benaroyaresearch.org/our-research/core-resources/tetramer-core-laboratory | |||
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