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Biology

Un ensayo de unión de alto rendimiento MHC II para el análisis cuantitativo del péptido epítopos

doi: 10.3791/51308 Published: March 25, 2014

ERRATUM NOTICE

Summary

Ensayos bioquímicos con moléculas recombinantes humanas MHC II pueden proporcionar rápidas, ideas cuantitativos en la identificación epítopo inmunogénico, eliminación o diseño. Aquí, se describe un ensayo de unión péptido-MHC II a escala para placas de 384 pocillos. Este formato rentable puede ser muy útil en los campos de desinmunización proteínas y diseño y desarrollo de vacunas.

Abstract

Ensayos bioquímicos con moléculas recombinantes humanas MHC II pueden proporcionar rápidas, ideas cuantitativos en la identificación epítopo inmunogénico, eliminación, o el diseño de 1,2. Aquí, un ensayo de unión péptido-MHC II se escala al formato de 384 pocillos. El protocolo reducido reduce los costes de reactivos en un 75% y es mayor rendimiento que se ha descrito anteriormente protocolos de 96 pocillos 1,3-5. Específicamente, el diseño experimental permite el análisis robusto y reproducible de hasta 15 péptidos contra un alelo de MHC II por 384 pocillos de placas de ELISA. El uso de un solo robot de manejo de líquidos, este método permite a un investigador para analizar aproximadamente noventa péptidos de ensayo por triplicado en un rango de concentraciones de ocho y cuatro tipos de alelos de MHC II en menos de 48 horas. Otros trabajan en los campos de la desinmunización proteína o el diseño y desarrollo de vacunas que encuentre el protocolo para ser útil en la facilitación de su propio trabajo. En particular, las instrucciones paso a paso y el formato visualde Jove debe permitir que otros usuarios establecer rápida y fácilmente esta metodología en sus propios laboratorios.

Introduction

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Las proteínas son la clase de más rápido crecimiento de agentes terapéuticos 6, y la rápida expansión de ductos bioterapéuticos se ha centrado cada vez más atención en los retos asociados con el desarrollo y el uso de fármacos de proteínas. Una consideración único surge del hecho de que, en un sistema inmunológico saludable y en funcionamiento, todas las proteínas extracelulares son muestreadas por las células presentadoras de antígeno (APCs). Una vez internalizado por las APC, una proteína se escinde en pequeños fragmentos de péptidos, y los segmentos inmunogénicos putativos se cargan en la ranura de clase II proteínas principales complejos de histocompatibilidad (MHC II). Los complejos de péptido-MHC II se muestran entonces en la superficie de APC, y verdaderos péptidos inmunogénicos, denominados epítopos de células T, formar complejos ternarios receptor de células MHC II-péptido-T con receptores de la superficie celular T CD4 afines 7. Este evento crítico reconocimiento molecular inicia una cascada compleja de señalización, lo que resulta en la activación de células T, la liberación de citoquinas, CD4 T mediada por células B maduración de las células, y en última instancia, la producción de anticuerpos IgG circulantes que se unen y restablezcan la proteína exógena infractor. Por lo tanto, las proteínas inmunogénicas pueden ser desinmunogénico mediante la identificación de constituyentes epítopos de células T y la mutación de residuos clave responsables de la formación de complejos de MHC II. Vale la pena observar, sin embargo, que los epítopos de células T pueden ser numerosos y ampliamente distribuida en toda proteínas inmunogénicas, y la mayoría de las mutaciones epítopo borrar es probable que causen una pérdida inadvertida de la función de proteínas o la estabilidad. Por lo tanto, la ingeniería desinmunogénico bioterapias pueden ser un objetivo complejo y técnicamente difícil, pero existen varios ejemplos de éxito T epítopos de células proyectos de eliminación 3,5,8-12. A diferencia de injerto a base de "humanización", que se limita en gran medida a la terapéutica de anticuerpos, eliminación epítopo se puede aplicar a esencialmente cualquier proteína objetivo, independientemente de la secuencia, estructura, función, o la disponibilidad de homólogonos andamios humanos. El primer paso para la implementación de un enfoque de este tipo es la identificación de epítopos peptídicos clave incrustados dentro de la secuencia de la proteína diana.

Ensayos bioquímicos alto rendimiento usando péptidos sintéticos y moléculas recombinantes humanas MHC II pueden proporcionar rápidas penetraciones preliminares sobre identificación y mitigación epítopo 1,3-5. Estos ensayos de tipo ELISA pueden ser un poderoso complemento a otras de diseño y desarrollo de proteínas / vacunas herramientas. Por ejemplo, un método experimental bien establecido para el mapeo de epítopos se basa en el tiempo, el trabajo y muchos recursos ex vivo ensayos de proliferación celular intensivos 15. Brevemente, la secuencia primaria de una proteína diana se divide primero en un panel de péptidos solapantes, a menudo 15-meros con 12 residuos de solapamiento entre los péptidos adyacentes. El panel de péptido se sintetiza químicamente y la inmunogenicidad de cada péptido se prueba en uno de los varios inmunoensayos que emplean diferentes Bloo periféricacélulas mononucleares de d (PBMC) aisladas de donantes humanos 13,14. Para proporcionar una mayor confianza en los resultados, los péptidos se prueban típicamente por duplicado con PBMC de 50 o más donantes diferentes. En los casos en que desinmunización es el objetivo final, el trabajo se complica aún más por la necesidad de producir paneles adicionales de péptidos mutados y probar los nuevos paneles de péptidos en ensayos de PBMC antes de introducir cualquier mutación deimmunizing a la proteína de longitud completa para el análisis funcional posterior 10. Si bien estos ensayos celulares siguen siendo el estándar de oro para evaluar el potencial inmunogénico en pacientes humanos, la eficacia de este enfoque exhaustiva podría ser mejorado por prefiltrado epítopos inmunogénicos putativos utilizando un rendimiento rápido y alta ensayo de unión de MHC II-péptido.

Del mismo modo, los ensayos de unión péptido-MHC II bioquímicos se pueden combinar con predictivo métodos in silico para acelerar radicalmente el proceso de identificación epítopo.Existen una variedad de herramientas computacionales para la predicción epítopo de células T, e incluye ProPred 16, MHCPred 17, SVRMHC 18, ARB 19, SMM-alinear 20, NetMHCIIpan 21, así como las herramientas propietarias como EpiMatrix por EpiVax 22. Del mismo modo, los predictores de epítopos recientemente se han combinado con otras herramientas de bioinformática y modelado molecular para producir algoritmos desinmunización proteínas integradas diseñadas para mitigar el riesgo de que las mutaciones deimmunizing pudiesen afectar a la estructura y función de proteínas 23-26. Mientras que varios predictores de epítopos han demostrado ser razonablemente exacta 27,28, resultados computacionales invariablemente requieren validación experimental. Métodos experimentales rápido, de alto rendimiento y rentables son los más adecuados como filtro preliminar para las predicciones de epítopos silico.

En una línea similar, los predictores de epítopos pueden conducir la selección de antígenos para vaccinolo inversagy 29,30. Por ejemplo, los avances en la bioinformática han arrojado entero genoma pantallas que identifican rápidamente vacunas candidatas en forma de proteínas enteras o epítopos de péptidos extraídos de proteomas de agentes patógenos. Si bien esta tecnología está dando nueva forma que permite el descubrimiento y desarrollo de vacunas protectoras, introduce un nuevo reto en forma de incurablemente grandes listas de candidatos a vacunas inmunogénicas. Ensayos de unión de alto rendimiento de péptido-MHC II pueden guiar la selección epítopo mediante la cuantificación de la afinidad de unión del péptido y la promiscuidad de unión entre los múltiples alelos de MHC II. Al igual que con desinmunización proteínas, tales métodos experimentales son, en última instancia requieren para validar la predicción computacional de clientes potenciales de vacunas prometedoras.

Aquí, se describe un ensayo de unión péptido-MHC II a escala al formato de 384 pocillos. El protocolo es altamente paralelizado y reduce los costes de reactivos en un 75% en comparación con el anteriormente descrito de 96 pocillos formatos de placa 1,3-5. El uso de un solo liquid robot de manipulación, este método permite a un investigador para analizar fácilmente aproximadamente noventa péptidos de ensayo por triplicado en un rango de concentraciones de ocho y cuatro tipos de alelos de MHC II en menos de 48 horas. En este artículo se describe la instalación de una placa de 384 pocillos de ELISA para el análisis de los siete péptidos experimentales contra un alelo MHC II, pero las calculadoras de hoja de cálculo se proporcionan como material complementario a fin de escalar fácilmente el experimento a cualquier número de péptidos y / o MHC deseados II moléculas.

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Protocol

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Cuatro actividades principales comprenden el ensayo de unión péptido-MHC II: 1-Encuadernación: péptidos de ensayo compiten con los péptidos de control marcado por la unión en fase de solución de proteínas MHC II solubles. Encuadernación se mide a través de una amplia gama de concentraciones de péptido de prueba. 2-Captura: Después de la reacción de unión se aproxima al equilibrio, los complejos de péptido-MHC II se capturan y se separan de péptido no unido y la proteína por el reconocimiento dependiente de la conformación con un anticuerpo inmovilizado. 3-Detección: péptido de control capturado se detecta cuantitativamente usando fluorescencia resuelta en el tiempo. 4-Análisis: Los datos espectroscópicos se procesan, representaron gráficamente y se analizaron para determinar propiedades de unión dependientes de la dosis de péptido de prueba y proteínas MHC II.

En diversas etapas del procedimiento, se recomienda el uso de un robot de manejo de líquidos si hay alguno disponible. En particular, en un formato de 384 pocillos, de dispensación automatizada y la dilución de los líquidos minimiza el error de usuario, resultados en másconsistentes volúmenes del pozo a pozo, y los rendimientos más estrechos intervalos de confianza del 95% para los valores de CI 50 en comparación con los ensayos de 96 pozos manuales (datos no presentados). Si un robot de manejo de líquidos no está disponible, los pasos anotados con "(robot de manejo de líquidos)" se pueden hacer a mano. Del mismo modo, si es posible, se recomienda un lavador de placas automatizado que es compatible con el formato de 384 pocillos. Esto normaliza eficazmente el proceso de lavado de placas. Si un lavador de placas no está disponible, los pasos anotados con "(lavador de placas)" se pueden hacer a mano.

1. Cubra la placa ELISA (Día 1)

  1. Diluir anticuerpo L243 de stock (0,5 mg / ml) en tampón borato a una concentración de trabajo de 10 mg / ml.
    1. Para cubrir una sola placa de 384 pocillos, añadir 200 l de anticuerpo de stock a 9,8 ml de tampón borato. (Ver calculadora de hoja de cálculo complementario para escalamiento alternativa).
  2. Añadir 25 l de la solución de anticuerpo L243 a cada pocillo de un 384-Well alta unión a la placa ELISA blanco. (Robot de manejo de líquidos)
  3. Sellar la placa con una lámina de poliéster y se incuba durante la noche a 4 ° C.
    Nota: Cada placa de ELISA de 384 pozos con capacidad para 15 péptidos de ensayo en ocho diluciones de un alelo de MHC II, así como los controles positivos y negativos. Esto producirá en última instancia, mediciones por triplicado.

2. Haga la prueba de péptidos diluciones (Día 1)

  1. A partir de un almacén 10 mM de cada péptido de ensayo en DMSO, hacer la siguiente serie de dilución en tampón de citrato-fosfato utilizando placas de polipropileno de 384 pocillos (Tabla 1). (Robot de manejo de líquidos)
    Nota: Un plato lleno de polipropileno de 384 pozos requiere de tres placas de ELISA separadas. Una tercera parte de una placa de polipropileno requerirá sólo una placa de ELISA (Figura 1).
Número de dilución Volumen to tomar desde antes de la dilución / cepa Volumen de Tampón de Citrato añadir Conc. de Dilución Conc. en reacción de unión Conc. en neutralizados ELISA
(L) (L) (M) (M) (M)
1 0.7 35.1 195.531 97.765 48.883
2 14.3 14.3 97.765 48.883 24.441
3 7.1 28.7 19.389 9.695 4.847
4 14.3 14.3 9.695 4.847 2.424
5 7.1 28.7 1.923 0.961 0.481
6 14.3 14.3 0.961 0.481 0.24
7 7.1 28.7 0.191 0.095 0.048
8 14.3 14.3 0.095 0.048 0.024
Retire y deseche 7,1 l de solución de péptido de dilución número 8.

Tabla 1. Preparación de prueba de péptido serie de dilución.

Figura 1
Figura 1. Plate Mapa del péptido Ensayo de unión. (A) Mapa de las diluciones de péptido en polipropileno placas de 384 pocillos. Cada placa de polipropileno tiene capacidad para tres grupos de 15 péptidos en las reacciones de unión de competición contra un cantar alelo le MHC II. (B) Después de la reacción de unión se aproxima al equilibrio, cada grupo de péptidos por triplicado se transfiere,, a una placa de 384 pocillos de ELISA separada que ha sido pre-revestido con anticuerpo anti-MHC II.

3. Preparar la mezcla maestra MHC II (Día 1)

  1. Hacer el tampón de reacción
    1. Añadir 80 l de 1 mM de Pefa Bloc y 60 mg de octil-β-D-glucopyranaside a 3.920 l de citrato tampón fosfato. (Ver calculadora de hoja de cálculo complementario para escalamiento alternativa).
  2. Diluir soluciones madre MHC II seleccionados a 101 nM en tampón de reacción utilizando un tubo cónico de 15 ml (Tabla 2).
    Nota: la concentración de MHC II será en última instancia 50 nM en la reacción de unión y 25 nM en el ensayo ELISA neutralizado. Las concentraciones madre MHC II variarán en función de número de lote del fabricante. (Ver calculadora de hoja de cálculo complementario).
"> MHC II alelo DRB1 *: 1501 Concentración de la MHC II (mg / ml) 1.3 MHC II Stock Concentración (mM) 20 Vol.. II MHC Stock agregar (ml) 14.65 Vol.. Reaction Buffer agregar (ml): 2885.35 Concentración de MHC II Master Mix (nM) 101

Tabla 2. Preparación de mezcla maestra de MHC II.

4. Preparar los controles positivos y negativos (Día 1)

  1. Añadir 21,5 l de citrato tampón fosfato al pozo "control negativo" de la placa de polipropileno de 384 pozos desde el paso 2.1 (Figura 1A).
  2. Añadir 21,5 l de citrato tampón fosfato al pozo "control positivo" de la placa de polipropileno de 384 pocillos.
    Nota: La función "Posicontrol efectivo "se completará en la sección 5, a continuación.
  3. Retire 49,5 l de la MHC II Master Mix desde el paso 3.2 y la pipeta en un tubo Eppendorf de 1,5 ml.
  4. Añadir 0,5 l de tampón de citrato a los 49,5 l de la MHC II Master Mix desde el paso 4.3.
  5. Añadir 21,5 l de la concentración ajustada de MHC II Master Mix de la etapa 4.4 para el bienestar "control negativo" de la placa de polipropileno de 384 pocillos (Figura 1A).
    Nota: Esta muestra representa el control negativo de la señal cero que contiene proteínas MHC II, NO péptido control, y NO péptido de prueba.

5. Añadir el apropiado péptido de control a la MHC II Master Mix (Día 1)

MHC II alelo DRB1 * Biotinilado de control Péptido (Residuos) Secuencia
0101 Gripe-HA-B (306-318) Biotina-(Ahx) (Ahx) PRYVKQNTLKLAT-amida
0301 La mioglobina (137-148) Biotina-(Ahx) - (Ahx)-LFRKDIAAKYKE-OH
0401 YAR-B (1-14) Biotina-(Ahx) (Ahx) YARFQSQTTLKQKT-OH
0701 TetTox-B (830-843) Biotina-(Ahx) (Ahx) QYIKANSKFIGITE-OH
1101 Gripe-HA-B (306-318) Biotina-(Ahx) (Ahx) PRYVKQNTLKLAT-amida
1501 MBP-B (84-102) Biotina-(Ahx) (Ahx) NPVVHFFKNIVTPRTPPPS-OH

* Recomendamos pedir 10 mg escala para la economía.
Tabla 3. Péptidos de control para los diversos alelos de MHC II. *

  1. Diluir el péptido de control (almacenado a 400 mM en DMSO) 1:20 en DMSO fresco para producir una acción diluido a 20 mM.
    1. Añadir 25 l de 400 mM de control péptido a475 l de DMSO. Nota: este es un gran exceso, pero permite la manipulación precisa de soluciones de DMSO viscosos.
  2. Además diluir el péptido de control del paso 5,1 (20 mM) 1:100 en el MHC II Master Mix desde el paso 3.2.
    1. Añadir 28,8 l de control péptido diluido en el paso 5.2 a los 2,850.5 l restantes del MHC II Master Mix.
  3. Añadir 21,5 l de la mezcla maestra de MHC II con el péptido de control (paso 5.2) para el pocillo de control positivo de la placa de polipropileno de 384 pocillos (paso 4,2) (Figura 1A). Nota: Esta muestra representa el control positivo de alta señal que contiene proteínas MHC II, péptido control, y NO péptido de prueba.

6. Hacer la reacción de unión (Día 1)

  1. Añadir la mezcla maestra de MHC II que contiene péptido de control (paso 5,2) a cada una de las diluciones de prueba de péptidos (paso 2,1) en una proporción de 1:1 para crear la reacción de unión.
    1. Añadir 21,5 l de MHC II Master Mix que contienen de ConPéptido de control de la etapa 5,2-21,5 l de cada dilución de ensayo peptídicos desde el paso 2.1. (Robot de manejo de líquidos)
  2. Selle la reacción de unión con una película de poliéster e incubar 12-24 horas en una incubadora no son CO 2 a 37 ° C sin agitación.

7. Neutralizar y Transferencia de la reacción de unión (Día 2)

  1. Retire la placa de polipropileno de 384 pocillos que contiene la reacción de unión (paso 6.2) de la incubadora a 37 ° C.
  2. Diluir la 1:01 reacción de unión con tampón de neutralización. (Robot de manejo de líquidos)
    1. Añadir 43 l de la Neutralization Buffer a cada reacción de unión también.
  3. Retire la placa de ELISA (paso 1.3) del 4 ° C y lavar 3 veces con 60 ml / pocillo de PBS-Tween 20 0,05%. (Lavador de placas)
  4. Transferencia de 25 l de cada reacción de unión neutralizada desde el paso 7.2 en pocillos por triplicado de la 384 pocillos de placas de ELISA de anticuerpos recubiertos desde el paso 7.3. (Figura 1
  5. Cubrir la placa de ELISA con una película de poliéster y el lugar en una incubadora a 37 ° durante 2,5 horas o en el refrigerador de 4 ° C durante la noche.

8. Desarrollo de ELISA (Día 2 o 3)

  1. Retire la placa de ELISA de la etapa 7.5, lavar 3 veces con 60 l / pocillo de PBS-Tween al 0,05%. (Lavador de placas)
  2. Diluir la solución de estreptavidina europio acciones (0,1 mg / ml de estreptavidina, 7 Eu 3 + / estreptavidina) 1000 veces en el tampón de ensayo DELFIA.
    1. Para una placa de 384 pocillos, diluya 10 l estreptavidina-europio en 10 ml de tampón de ensayo.
  3. Añadir 25 l de la estreptavidina diluida-europio a cada pocillo de la placa de 384 pocillos de ELISA a partir del paso 8.1. (Robot de manejo de líquidos)
  4. Cubrir la placa con una lámina de poliéster y el lugar en la oscuridad a temperatura ambiente durante 1 hora. Nota: Durante la incubación de 1 hora, retire la solución de mejora de la nevera y dejar de lado 10 ml / placa en la oscuridad a rotemperatura OM.
  5. Después de la incubación de 1 hora, se lava la placa de 384 pocillos ELISA desde el paso 8.3 3 veces con 60 l / pocillo de PBS-Tween al 0,05%. (Lavador de placas)
  6. Añadir 25 l de solución de mejora a cada pocillo de la placa de 384 pocillos de ELISA a partir del paso 8.5. (Robot de manejo de líquidos)
  7. Cubrir la placa ELISA de 384 pozos con una película de poliéster y permita que la placa para sentarse en la oscuridad a temperatura ambiente durante 10 a 15 min.
  8. Después de la incubación de 10 a 15 min, lee la fluorescencia de la placa de 384 pocillos ELISA desde el paso 8.7 usando un lector de tiempo resuelto fluorescente plato con configuración de europio (por ejemplo, Empezar Int.: 200, Stop Int.:. 1000, Ex. 340, Em . 615, Límite: Ninguno, PMT: Auto, Lee / Bien: 50).

9. Análisis de Datos

  1. Introducir datos en el gráfico en formato XY con 3 valores replicados en columnas de side-by-side (X = concentración de péptido de ensayo; Y = medición de fluorescencia).
  2. Entrar a transformar los valores de X para todos los datos: X = log (X)
  3. Montar los tra registronsformed de datos con el modelo de unión competitiva de un solo sitio para extraer el valor de CI 50.
  4. Restringir el valor inferior al valor medio de control negativo.
  5. A nivel mundial ajustarse el valor superior y asegurar que el parámetro de ajuste global es menor o igual que el control positivo.

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Representative Results

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La secuencia de péptido maduro de Enterobacter cloacae P99 de beta-lactamasa (bla) (GenBank ID # X07274.1) se analizó con ProPred 16 para aglutinantes de péptidos putativos a MHC II alelo DRB1 * 1501 (Tabla 4). ProPred identificado péptidos nonamer 117 con un residuo de anclaje P1 obligatoria (es decir, un M, L, I, V, F, Y, o W en la posición 1, que se requiere para MHC II de unión 31). En el umbral del 5%, sólo los péptidos con puntajes mayores o iguales a 2.6 son probables aglutinantes. Por lo tanto, en el umbral de 5%, sólo 11 de los mejores péptidos se predicen para unirse MHC II DRB1 * 1501.

Tabla 4
Tabla 4. Mejor puntuación ProPred predicciones para péptidos BLA y el alelo DRB1 * 1501 MHC II.

Un panel representativo de epitop predichoES fue seleccionado para análisis en nuestro ensayo de unión a MHC II (Tabla 4, las entradas en negrita). Fragmentos peptídicos BLA de quince restos fueron sintetizados químicamente de tal manera que los epítopos nonamer putativo MHC II fueron incorporados dentro de los fragmentos de proteínas sintéticas. Mientras que el surco de unión de MHC II en sí acomoda sólo nueve aminoácidos, la evidencia sugiere que las secuencias flanqueantes pueden influir en las interacciones péptido-MHC II, y péptidos sintéticos de 15-20 residuos son por lo tanto comúnmente empleados 15. Para representar la complejidad de epítopos que podrían ocurrir en fragmentos de proteínas biológicamente procesados ​​superposición, hemos probado secuencias sintéticas que contenían (i) aglutinantes individuales predichas, (ii) nonbinders predichos individuales, (iii) múltiple predijo aglutinantes, (iv) múltiples predijo nonbinders, o (v) una mezcla de ligantes y nonbinders predichos (Tablas 4 y 5).

Tabla 5 Tabla 5. Lista de los péptidos sintetizados químicamente.

Se analizó la capacidad de estos péptidos sintéticos para competir con el péptido de control MBP-B biotinilado (Tabla 3) para la unión a MHC II DRB1 * 1501 como se describe en el protocolo anterior. Las curvas de unión competitiva para los péptidos sintéticos se muestran en la Figura 2. Los valores de CI50 se calcularon por ajuste de los datos transformados logarítmicamente usando el de un sitio competitiva, función de unión no lineal en forma de prisma (Tabla 6). Como se ve en la Figura 2, los péptidos particionan naturalmente en tres grupos: fuertes aglutinantes con CI 50 <1 M (péptidos 2 y 10); aglutinantes moderados con 1 M ≤ IC 50 <100 micras (péptidos 4, 9, 11, y 24 ); aglutinantes débiles con IC 50 ≥ 100 μ; M (péptido 31).

Figura 2
Figura 2. Curva de unión competitiva de BLA péptidos de MHC II alelo DRB1 * 1501. Aglomerantes apretados son en forma con líneas naranjas, aglutinantes moderados líneas verdes, y el aglutinante débil una línea marrón.

Péptido Posición IC 50 (M) IC del 95% para IC 50 (M) Calidad de ajuste (R 2)
2 0.1199 ,09404-0,1529 0.98
4 15.1 11,83-19,28 0.87
9 17.11 13,39-21,88 0.81
10 0.2743 0,2149-0,3502 0.98
11 10.49 8,252-13,34 0.98
24 4.787 3,769-6,082 0.96
31 190.6 137,7-263,9 0.80

Tabla 6. Calculan IC 50 valores de fragmentos peptídicos BLA para DRB1 * 1501.

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Discussion

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Biotherapeutics se han establecido como uno de los pilares de la medicina moderna, que representan cuatro de las cinco principales drogas que venden en 2012 32. El sector de la biofarmacia ha mostrado un crecimiento sostenido durante varios años y 6, y el desarrollo continuo de nuevos agentes, así como la aparición de los biosimilares se ha expandido ductos biofarmacéuticos. Mirando hacia el futuro, evaluar y mitigar la inmunogenicidad de las proteínas terapéuticas se convertirá en una parte integral del desarrollo bioterapéutico etapa temprana. Para facilitar este proceso, los biotecnólogos podrán hacer uso de métodos computacionales para la predicción epítopo 16-22, así como algoritmos de diseño de proteínas integradas que buscan reducir la inmunogenicidad, manteniendo la función 3,23-26. Del mismo modo, el diseño y el desarrollo de vacunas pueden aprovechar el poder de los algoritmos predictivos 4, y se espera que la maduración continua de la vacunología inversa para dar protecciónVacunas para una amplia gama de agentes infecciosos que han eludido los esfuerzos anteriores 33. Si bien estas herramientas computacionales tienen la capacidad de acelerar radicalmente los procesos de desarrollo de medicamentos y vacunas, los resultados de las predicciones in silico en última instancia, deben ser más filtrada a fin de identificar un número manejable de los principales candidatos rendimiento. Los avances recientes en el análisis cuantitativo péptido-MHC II han incluido el desarrollo de sistemas de ingeniería de la superficie celular de la levadura de visualización 34 y microperlas basa oxígeno luminiscente Canalización inmunoensayos 35, pero en ensayos in vitro de tipo ELISA siendo el caballo de batalla para la cuantificación de la unión entre específica de MHC II y pares de péptidos. Aquí, se describe un procedimiento de escala de microlitros para una rápida, cuantitativa, y el coste efectivo análisis de epítopo de péptido de unión a moléculas MHC II inmunes humanos. Estos métodos pueden ser utilizados como una herramienta experimental etapa temprana en el proceso de canalización.

Para la purposes de demostración, se analizó la secuencia de BLA para péptidos de unión MHC II putativos utilizando el servidor web ProPred. Siete de estos péptidos se sintetizaron químicamente y experimentalmente probados por la unión a soluble humana MHC II DRB1 * 1501. Al igual que en otros análisis de la exactitud de predicción 28, la predicción de unión ProPred razonablemente bien correlacionada con la medida experimentalmente IC 50 para el alelo DRB1 * 1501 MHC II. También es importante tener en cuenta que los resultados son sensibles a las variaciones en las concentraciones y se debe tener cuidado para asegurar diluciones precisas de MHC, péptidos de control, y péptidos de la prueba. Del mismo modo, una limitación de este método es que los valores de IC50 son en relación con las concentraciones de MHC y péptidos de control. Entre el conjunto de pruebas péptido BLA, el mejor clasificado ProPred epítopo exhibió la más fuerte unión a DRB1 * 1501 recombinante. Del mismo modo, todos los otros aglutinantes de epítopos predichos exhiben moderada a altas afinidades MHC II. Como era de esperar,No se encontraron péptidos sintéticos que contienen la superposición de epítopos de unión previsto y epítopos no vinculantes para unirse de MHC II en todos los casos. El péptido 31, que se extendió por dos de los de más bajo ranking epítopos predichos, demostró ser el más débil aglutinante MHC II. Péptido 24, sin embargo, se encontró que se unen de MHC II con una afinidad moderada a pesar del hecho de que su epítopo constituyente sólo de alto rango (epítopo 24) no fue un aglutinante predicho en el umbral del 5%. Curiosamente, 24 epítopo se identificó en un estudio anterior dirigido a deimmunizing BLA 10. En esos experimentos, péptido sintético 24 ha demostrado ser altamente inmunogénica en ensayos de PBMC humanos. Por lo tanto, en éste caso, nuestro ensayo de unión a MHC II resultó ser predictivo de la inmunogenicidad mientras que ProPred no lo hizo. En conjunto, los resultados demuestran la utilidad de las predicciones computacionales para guiar investigadores hacia posibles epítopos inmunogénicos, pero también ponen de relieve la importancia de los métodos experimentales de alto rendimiento como un componente integral deel proceso de diseño de proteínas / vacuna.

Es importante destacar que este diseño de 384 pocillos experimental es muy paralelizada y permite el análisis riguroso de hasta 15 péptidos y un alelo de MHC II por 384 pocillos de placas de ELISA. El uso de un solo robot de manejo de líquidos, este método permite a un investigador para analizar noventa péptidos de ensayo frente a cuatro tipos de alelos de MHC II en menos de 48 horas. Este diseño incluye ocho diferentes concentraciones de péptidos de prueba y medida por triplicado a cada concentración. Por lo tanto, el usuario se asegura resultados cuantitativos robustos y reproducibles. Otros trabajan en los campos de la terapéutica de la proteína o el diseño y desarrollo de vacunas pueden encontrar este protocolo para ser útil para facilitar su trabajo en desinmunización proteína o análisis de inmunogenicidad.

Citrato tampón fosfato (mM ácido cítrico 22.2, 55.6 mM Dibásico Na 2 HPO 4, pH 5,4)
Ácido cítrico 222 ml de 0,1 M
278 ml 0,2 M dibásico Na 2 HPO 4
500 ml H2O MilliQ
Mezclar ácido cítrico, fosfato de sodio, y 450 ml de H2O MilliQ Ajustar el pH a 5,4 y la cantidad suficiente hasta 1 L.
Esta solución es estable a temperatura ambiente.
Binding Buffer de Reacción
Citrato de tampón fosfato, pH 5,4 con 2% v / v 1 mM Pefabloc
1,5% W / V octil-β-D-glucopyranaside
Utilice de inmediato.
1 mM de Pefabloc
1 ml H2O MilliQ
25 mg Pefabloc SC (polvo)
Alicuotar y almacenar a -20 ˚ C.
Tampón borato Fórmula (tetraborato de sodio 12,5 mMdecahidrato, pH 8,2)
Tetraborato decahidrato de 1,19 g de sodio (Sigma)
250 ml H2O MilliQ
Disolver tetraborato sódico decahidrato en 225 ml de H2O MilliQ Ajustar el pH a 8,2 y en cantidad suficiente para 250 ml.
Esta solución es estable a temperatura ambiente.
PBS-Tween (2,7 mM de KCl, 1,5 mM KH 2 PO 4, NaCl 136,9 mM, 8,9 mM de Na 2 HPO 4 • 7H 2 O, 0,05% de Tween, pH 7,4)
4,5 l MilliQ H 2 O 500 ml de 10x PBS de Dulbecco (DPBS)
2,5 ml de Tween 20
Esta solución es estable a temperatura ambiente.
Tampón de neutralización (50 mM de Trizma HCl, pH 8.0)
475 ml H2O MilliQ
25 ml de HCl 1 M Trizma
Mezclar y ajustar el pH a 8,0
Esta solución es estable a 4 ° C.

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Disclosures

Leonard Moise está empleado y tiene opciones sobre acciones en EpiVax, Inc., una compañía de biotecnología de propiedad privada con sede en Providence, RI. El trabajo contenido en este informe de investigación es libre de cualquier sesgo que podría asociarse con los objetivos comerciales de la empresa.

Acknowledgments

Este trabajo fue apoyado por subvenciones del NIH R01-GM-098 977 y R21-AI-098 122 para CBK y KEG. RSS fue apoyado en parte por una beca de la Fundación Luce y en parte por una beca del Programa de Innovación Thayer de la Escuela de Ingeniería Thayer.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sodium Tetraborate Decahydrate Sigma 221732
Citric Acid Sigma C1901
Dibasic Sodium Phosphate Sigma S7907
Trizma HCl OmniPur 9310
Tween-20 Sigma P7949
100% DMSO Sigma D8418
Octyl-β-D-Glucopyranaside Fischer 29836-26-8
Pefa Bloc SCF Roche 1158591600
Dulbecco’s 10x Phosphate Buffered Saline Invitrogen 14200-166
DELFIA Assay Buffer Perkin Elmer 4002-0010
DELFIA Enhancement Buffer Perkin Elmer 4001-0010
Europium Labelled Streptavidin Perkin Elmer 1244-360
L243 anti-HLA-DR antibody Biolegend 307602
Biotinylated tracer peptides 21st Century Biochemicals Custom Order
Test peptides (1-4 mg, 85% purity) Genscript Custom Order
Purified HLA-DRB1 monomers (non-biotinylated) Benaroya Research Institute* Custom Order
384-well white EIA/RIA plate Thermo 460372
Polypropylene 384-well plate Costar 3656
Film, AxySeal, 80 µm, ELISA Applicator  Axygen Ascientific PCR-SP
MilliQ Water N/A N/A
Epimotion Liquid Handler (or similar) Eppendorf 5075
Select TS Plate Washer (or similar) BioTek 405
SpectraMax Gemini Microplate Reader (or similar) Molecular Devices N/A
*Recombinant human MHC II molecules can be obtained from the Benaroya Tetramer Core Laboratory.  See: https://www.benaroyaresearch.org/our-research/core-resources/tetramer-core-laboratory

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References

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Erratum

Formal Correction: Erratum: A High Throughput MHC II Binding Assay for Quantitative Analysis of Peptide Epitopes
Posted by JoVE Editors on 03/18/2019. Citeable Link.

An erratum was issued for: A High Throughput MHC II Binding Assay for Quantitative Analysis of Peptide Epitopes.  There were typos in the Protocol section and Table 2.

Step 3.1.1 in the Protocol was updated from:

Add 80 µl of 1 mM Pefa Bloc and 60 mg of octyl-β-D-glucopyranaside to 3,920 µl of Citrate Phosphate Buffer. (See supplemental spreadsheet calculator for alternative scaling).

to:

Add 80 µl of 1 mM Pefa Bloc and 60 µg of octyl-β-D-glucopyranaside to 3,920 µl of Citrate Phosphate Buffer. (See supplemental spreadsheet calculator for alternative scaling).

Step 5.2 in the Protocol was updated from:

Further dilute the Control Peptide from step 5.1 (20 mM) 1:100 into the MHC II Master Mix from step 3.2.

to:

Further dilute the Control Peptide from step 5.1 (20 µM) 1:100 into the MHC II Master Mix from step 3.2.

Table 2 was updated from:

MHC II Allele DRB1*: 1501
MHC II Stock Concentration (mg/ml) 1.3
MHC II Stock Concentration (mM) 20
Vol. MHC II Stock to Add (ml) 14.65
Vol. Reaction Buffer to Add (ml): 2885.35
MHC II Master Mix Concentration (nM) 101

to:

MHC II Allele DRB1*: 1501
MHC II Stock Concentration (mg/ml) 1.3
MHC II Stock Concentration (μM) 20
Vol. MHC II Stock to Add (μl) 14.65
Vol. Reaction Buffer to Add (μl): 2885.35
MHC II Master Mix Concentration (nM) 101
Un ensayo de unión de alto rendimiento MHC II para el análisis cuantitativo del péptido epítopos
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Salvat, R., Moise, L., Bailey-Kellogg, C., Griswold, K. E. A High Throughput MHC II Binding Assay for Quantitative Analysis of Peptide Epitopes. J. Vis. Exp. (85), e51308, doi:10.3791/51308 (2014).More

Salvat, R., Moise, L., Bailey-Kellogg, C., Griswold, K. E. A High Throughput MHC II Binding Assay for Quantitative Analysis of Peptide Epitopes. J. Vis. Exp. (85), e51308, doi:10.3791/51308 (2014).

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