Peptid Epitopların Kantitatif Analiz için bir yüksek veri akışı MHC II Bağlanma Deneyi
Summary
Rekombinant insan MHC II molekülleri ile biyokimyasal analizler hızlı, kantitatif immünojenik epitop tanımlaması içine anlayışlar, silme ya da tasarım sağlayabilir. Burada, 384 oyuklu plakalara ölçekli bir peptid MHC-II bağlama deneyi açıklanmıştır. Bu maliyet etkin biçim protein deimmunization ve aşı tasarım ve geliştirme alanlarında yararlı ispatlamak zorundadır.
Abstract
Rekombinant insan MHC II molekülleri ile Biyokimyasal deneyler, hızlı ve nicel imünojenik epitop tanımlama bakış açıları, silme ya da tasarım 1,2 sağlayabilir. Burada, bir peptid-MHC II bağlanma deneyi 384-gözlü formata şekilde ölçeklendirilir. Küçültülmüş protokol% 75 reaktif madde maliyetlerini azaltır ve daha önce 96 oyuklu protokoller 1,3-5 tarif daha yüksek bir kapasiteye sahip olmasıdır. Özel olarak, deneysel tasarım 384-çukurlu ELISA plaka başına bir MHC II aleli karşı 15 peptidlerin sağlam ve tekrarlanabilir bir analiz izin verir. Tek bir sıvı kotarma robotu kullanılarak, bu yöntem, bir araştırmacı, en az 48 saat sekiz konsantrasyonları ve dört MHC II aleli tipleri aralığı üzerinde üç kez yaklaşık doksan deney peptidleri analiz etmeyi sağlar. Protein deimmunization veya aşı tasarımı ve geliştirme alanlarında çalışan Diğerleri protokol kendi işlerini kolaylaştırmada yararlı bulabilirsiniz. Özellikle, adım-adım talimatlar ve görsel biçimivallahi diğer kullanıcıların hızla ve kolayca kendi laboratuarlarında bu metodolojiyi kurmak için izin vermelidir.
Introduction
Proteinler terapötik ajanların 6 hızlı büyüyen sınıf ve biyoterapötik boru hatlarının hızlı genişleme protein ilaçların geliştirilmesi ve kullanımı ile ilgili sorunlar üzerinde artan ilgi odaklanmıştır. Bir benzersiz göz sağlıklı ve işleyen bir bağışıklık sistemi, tüm hücre-dışı proteinleri antijen sunan hücreler (APC'ler) tarafından örneklenir, gerçeğinden kaynaklanmaktadır. Bir kez APC 'ler tarafından içsel, bir protein küçük peptit fragmanları halinde bölünür ve varsayılan imünojenik bölümler sınıf II ana histokompatibilite kompleksi proteinleri (MHC II) oluk içine yüklenir. Peptid-MHC II kompleksleri daha sonra APC yüzeyi üzerinde görüntülenir, ve gerçek immünojenik peptidleri, aynı kökenli CD4 T hücre yüzey reseptörleri ile 7 üçlü II MHC-peptid-T hücresi reseptörü kompleksler oluşturmak, T hücresi epitopları olarak adlandırılır. Bu kritik moleküler tanıma olay T hücresi aktivasyonuna neden olan bir sinyal akışını kompleks, sitokin salınımını başlatırs, CD4 T hücre aracılı B hücre olgunlaşması ve bağlanan ve soruna neden olan dışsal proteini açık IgG antikorları, dolaşımdaki sonuçta üretim. Bu durumda, proteinlerin imünojenik T hücresi epitoplarını oluşturan belirlenmesi ve MHC II kompleks oluşumu sorumlu anahtar kalıntıların mutasyona tâbi deimmunized olabilir. Bu T hücre epitopları genel olarak çok sayıda ve imünojenik protein boyunca dağıtılmış olabilir, ancak, not taşımaktadır ve epitop silme mutasyonu çoğunluğu protein işlevi veya bir istikrar yanlışlıkla kaybına neden olması muhtemeldir. Bu nedenle, mühendislik biyoterapiler karmaşık ve teknik açıdan zorlayıcı objektif olabilir deimmunized, ancak başarılı T hücresi özü silme projelerin 3,5,8-12 çeşitli örnekler de mevcuttur. Büyük ölçüde terapötik antikor ile sınırlandırılmıştır aşılama-göre "insancıllaştırılması" farklı olarak, epitop, silme bağımsız olarak sekans, yapı, fonksiyon esas olarak herhangi bir protein hedefi uygulanabilir veya homologo kullanılabilirliğiBizi insan iskeleleri. Bu tür bir yaklaşım uygulanması için ilk adım, hedef protein dizisi içinde gömülü önemli peptid epitoplarının tanımlanmasıdır.
Sentetik peptidler ve rekombinant insan MHC II molekülleri kullanarak yüksek verim biyokimyasal tahliller epitop tanımlaması ve hafifletme 1,3-5 içine hızlı ön anlayışlar sağlayabilir. Bu ELISA tip tahliller diğer protein / aşı tasarım ve geliştirme araçları için güçlü bir tamamlayıcı olabilir. Örneğin, epitop haritalama bir iyi kurulmuş deneysel bir yaklaşım zaman, işçilik dayanır ve yoğun ex vivo hücre çoğalma tahlilleri 15 kaynak. Kısaca, hedef proteinin primer dizisinin elde edilmesi ilk örtüşen peptidlerin bir panel ayrılmıştır, 12 artıkları ile, genellikle 15-mer peptidleri arasında bitişik üst üste gelir. Peptit paneli kimyasal olarak sentez edilir ve her bir peptidin bağışıklık çevresel bloo kullanılması birkaç farklı bağışıklık birinde test edilirinsan donörlerden 13,14 izole d mononükleer hücreleri (PBMC). Sonuç daha büyük bir güven sağlamak için, peptidler, tipik olarak 50 veya daha fazla farklı vericilerden alman PBMC ile tekrarlı olarak test edilmiştir. Deimmunization nihai hedeftir durumda da, çalışma mutasyona uğramış peptidlerin ek paneller üreten ve daha sonra fonksiyonel analiz için 10 tam uzunlukta proteinin herhangi bir deimmunizing mutasyonlar dahil önce PBMC deneylerinde yeni peptit paneller test etmek için ihtiyaç daha da karmaşıklaşır. Bu hücre deneyleri, insan hastalarda immünojenik potansiyelini değerlendirmek için altın standart olmaya devam ederken böyle bir kapsamlı yaklaşımın etkinliği, hızlı ve yüksek iş II MHC-peptid bağlama deneyi kullanılarak varsayımsal imünogenik epitopların ön filtreleme ile iyileştirilebilir.
Aynı şekilde, biyokimyasal peptid-MHC II bağlama deneyleri radikal epitop tanıma işlemini hızlandırmak için silico yöntemlerinde önceden tahmin ile kombine edilebilir.T hücre epitop tahminine yönelik hesaplama araçları çeşitli var; örnekler ProPred 16 arasında, MHCPred 17, SVRMHC 18 ARB 19, 20 SMM-align NetMHCIIpan 21 yanısıra EpiVax 22 böyle EpiMatrix gibi özel araçlar. Aynı şekilde, epitop prediktörler son zamanlarda diğer biyoinformatik ve deimmunizing mutasyonlar protein yapısı ve fonksiyonu 23-26 kesebileceği riskini azaltmak için tasarlanmış entegre protein deimmunization algoritmalar elde etmek için moleküler modelleme araçları ile kombine edilmiştir. Birkaç epitop belirleyiciler makul doğru 27,28 olduğu kanıtlanmış olsa da, hesaplamalı sonuçlar her zaman deneysel doğrulama gerektirir. Hızlı, yüksek verimli ve uygun maliyetli deneysel yöntemler siliko epitop tahminler için bir ön filtre olarak en uygundur.
Benzer şekilde, epitop prediktörler ters vaccinolo için antijen seçimi sürebilirsingy 29,30. Örneğin, biyoinformatik gelişmeler hızlı bir patojen proteomlarda çıkarılan bütün protein ya da peptid epitoplarının formunda aşı adaylarını tanımlamak tüm genom ekranlar vermiştir. Bu sağlayan teknoloji koruyucu aşıların keşfi ve gelişimi yeniden şekillendirilmesi iken, immünojenik aşı adaylarının ısrarlı büyük listelerinin şeklinde yeni bir meydan okuma sunuyor. Yüksek üretim peptid-MHC II bağlama deneyleri peptit bağlanma afinitesine miktarının ve birden fazla MHC II alelleri arasında karışıklık bağlanarak epitopu noktası rehberlik eder. Protein deimmunization ile olduğu gibi, deneysel yöntemler sonuçta vaat eden aşı potansiyel hesaplama tahmini doğrulamak için gereklidir.
Burada, 384-gözlü formata ölçekli bir peptid MHC-II bağlama deneyi açıklanmıştır. Protokol derece paralelleştirilmiş ve daha önce 96-çukurlu plaka biçimleri 1,3-5 tarif kıyasla% 75 oranında reaktif madde maliyetlerini azaltır. Tek Liqui kullanılmasıd robot işleme, bu yöntem, bir araştırmacı kolayca en az 48 saat sekiz konsantrasyonları ve dört MHC II aleli tipleri aralığı üzerinde üç kez yaklaşık doksan deney peptidleri analiz etmeyi sağlar. Bu makalede, bir MHC II aleli karşı yedi deney peptidlerinin analizi için, bir 384-çukurlu ELISA plaka kurulumu tarif etmektedir, ancak kolayca istenilen peptidleri ve / veya MHC herhangi bir sayıda deney ölçek şekilde yayılmış tabaka hesap ek malzeme olarak verilmiştir II molekülleri.
Protocol
Representative Results
Discussion
Biotherapeutics 2012 32 ilk beş satan ilaçların dördünü temsil eden, modern tıbbın bir köşe taşı olarak kendilerini kurduk. Biopharmaceuticas sektörü birkaç yıl 6 için sürekli bir büyüme göstermiştir ve yeni ajanların sürekli geliştirme gibi biyobenzerlerin çıkması biyofarmasötik boru hatlarını genişletti. , Geleceğe bakıyorum değerlendirilmesi ve protein tedavisinin immünojenikliğini hafifletici erken evre biyoterapötik gelişiminin ayrılmaz bir parçası hal…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma NIH hibe R01-GM-098977 ve CBK ve KEG R21-AI-098122 tarafından desteklenmiştir. RSS Mühendislik Thayer School Thayer Yenilik Programı Bursu ile bir Luce Vakfı Bursu tarafından ve kısmen desteklenmiştir.
Materials
| Sodium Tetraborate Decahydrate | Sigma | 221732 | |
| Citric Acid | Sigma | C1901 | |
| Dibasic Sodium Phosphate | Sigma | S7907 | |
| Trizma HCl | OmniPur | 9310 | |
| Tween-20 | Sigma | P7949 | |
| 100% DMSO | Sigma | D8418 | |
| Octyl-β-D-Glucopyranaside | Fischer | 29836-26-8 | |
| Pefa Bloc SCF | Roche | 1158591600 | |
| Dulbecco’s 10X Phosphate Buffered Saline | Invitrogen | 14200-166 | |
| DELFIA Assay Buffer | Perkin Elmer | 4002-0010 | |
| DELFIA Enhancement Buffer | Perkin Elmer | 4001-0010 | |
| Europium Labelled Streptavidin | Perkin Elmer | 1244-360 | |
| L243 anti-HLA-DR antibody | Biolegend | 307602 | |
| Biotinylated tracer peptides | 21st Century Biochemicals | Custom Order | |
| Test peptides (1-4mg, 85% purity) | Genscript | Custom Order | |
| Purified HLA-DRB1 monomers (non-biotinylated) | Benaroya Research Institute* | Custom Order | |
| 384-well white EIA/RIA plate | Thermo | 460372 | |
| Polypropylene 384-well plate | Costar | 3656 | |
| Film, AxySeal, 80 µm, ELISA Applicator | Axygen Asicentific | PCR-SP | |
| MilliQ Water | N/A | N/A | |
| Epimotion Liquid Handler (or similar) | Eppendorf | 5075 | |
| Select TS Plate Washer (or similar) | BioTek | 405 | |
| SpectraMax Gemini Microplate Reader (or similar) | Molecular Devices | N/A | |
| *Recombinant human MHC II molecules can be obtained from the Benaroya Tetramer Core Laboratory. See: https://www.benaroyaresearch.org/our-research/core-resources/tetramer-core-laboratory | |||
References
- Steere, A. C., et al. Antibiotic-refractory Lyme arthritis is associated with HLA-DR molecules that bind a Borrelia burgdorferi peptide. J. Exp. Med. 203, 961-971 (2006).
- Raddrizzani, L., et al. Different modes of peptide interaction enable HLA-DQ and HLA-DR molecules to bind diverse peptide repertoires. J. Immunol. 159, 703-711 (1997).
- Osipovitch, D. C., et al. Design and analysis of immune-evading enzymes for ADEPT therapy. Protein Eng. Design. 25, 613-623 (2012).
- Moise, L., et al. In silico-accelerated identification of conserved and immunogenic variola/vaccinia T-cell epitopes. Vaccine. 27, 6471-6479 (2009).
- Moise, L., et al. Effect of HLA DR epitope de-immunization of Factor VIII in vitro and in vivo. Clin. Immunol. 142, 320-331 (2012).
- Aggarwal, S. R. What’s fueling the biotech engine-2011 to 2012. Nat. Biotechnol. 30, 1191-1197 (2012).
- Trombetta, E. S., Mellman, I. Cell biology of antigen processing in vitro and in vivo. Ann. Rev. Immunol. 23, 975-1028 (2005).
- Warmerdam, P. A. M., et al. Elimination of a human T-cell region in staphylokinase by T-cell screening and computer modeling. Thrombosis Haemostasis. 87, 666-673 (2002).
- Jones, T. D., et al. Identification and removal of a promiscuous CD4+T cell epitope from the C1 domain of factor VIII. J. Thrombosis Haemostasis. 3, 991-1000 (2005).
- Harding, F. A., et al. A beta-lactamase with reduced immunogenicity for the targeted delivery of chemotherapeutics using antibody-directed enzyme prodrug therapy. Mol. Cancer. 4, 1791-1800 (2005).
- Mazor, R., et al. Identification and elimination of an immunodominant T-cell epitope in recombinant immunotoxins based on Pseudomonas exotoxin A. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, E3597-E3603 (2012).
- Cantor, J. R., et al. Therapeutic enzyme deimmunization by combinatorial T-cell epitope removal using neutral drift. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 1272-1277 (2011).
- Kern, F., LiPira, G., Gratama, J. W., Manca, F., Roederer, M. Measuring Ag-specific immune responses: understanding immunopathogenesis and improving diagnostics in infectious disease, autoimmunity and cancer. Trends Immunol. 26, 477-484 (2005).
- Li Pira, G., Ivaldi, F., Moretti, P., Manca, F. High throughput T epitope mapping and vaccine development. J. Biomed. Biotechnol. 2010, 325720 (2010).
- Hoffmeister, B., et al. Mapping T cell epitopes by flow cytometry. Methods. 29, 270-281 (2003).
- Singh, H., Raghava, G. P. ProPred: prediction of HLA-DR binding sites. Bioinformatics. 17, 1236-1237 (2001).
- Guan, P., Doytchinova, I. A., Zygouri, C., Flower, D. R. MHCPred: bringing a quantitative dimension to the online prediction of MHC binding. Appl. Bioinformatics. 2, 63-66 (2003).
- Wan, J., et al. SVRMHC prediction server for MHC-binding peptides. BMC Bioinformatics. 7, 463 (2006).
- Bui, H. H., et al. Automated generation and evaluation of specific MHC binding predictive tools: ARB matrix applications. Immunogenetics. 57, 304-314 (2005).
- Nielsen, M., Lundegaard, C., Lund, O. Prediction of MHC class II binding affinity using SMM-align, a novel stabilization matrix alignment method. BMC Bioinformatics. 8, 238 (2007).
- Nielsen, M., Justesen, S., Lund, O., Lundegaard, C., Buus, S. NetMHCIIpan-2.0 – Improved pan-specific HLA-DR predictions using a novel concurrent alignment and weight optimization training procedure. Immun. Res. 6, 9 (2010).
- De Groot, A. S., Knopp, P. M., Martin, W. De-immunization of therapeutic proteins by T-cell epitope modification. Dev. Biol. 122, 171-194 (2005).
- Choi, Y., Griswold, K. E., Bailey-Kellogg, C. Structure-based redesign of proteins for minimal T-cell epitope content. J. Comput. Chem. 34, 879-891 (2013).
- Parker, A. S., Choi, Y., Griswold, K. E., Bailey-Kellogg, C. Structure-guided deimmunization of therapeutic proteins. J. Comput. Biol. 20, 152-165 (2013).
- Parker, A. S., Griswold, K. E., Bailey-Kellogg, C. Optimization of therapeutic proteins to delete T-cell epitopes while maintaining beneficial residue interactions. J. Bioinform. Comput. Biol. 9, 207-229 (2011).
- Parker, A. S., Zheng, W., Griswold, K. E., Bailey-Kellogg, C. Optimization algorithms for functional deimmunization of therapeutic proteins. BMC Bioinformatics. 11, 180 (2010).
- De Groot, A. S., Martin, W. Reducing risk, improving outcomes: Bioengineering less immunogenic protein therapeutics. Clin. Immunol. 131, 189-201 (2009).
- Wang, P., et al. A systematic assessment of MHC class II peptide binding predictions and evaluation of a consensus approach. PLoS Comput. Biol. 4, e1000048 (2008).
- Sette, A., Rappuoli, R. Reverse vaccinology: developing vaccines in the era of genomics. Immunity. 33, 530-541 (2010).
- Moise, L., Cousens, L., Fueyo, J., De Groot, A. S. Harnessing the power of genomics and immunoinformatics to produce improved vaccines. Expert Opin. Drug Discov. 6, 9-15 (2011).
- Sturniolo, T., et al. Generation of tissue-specific and promiscuous HLA ligand databases using DNA microarrays and virtual HLA class II matrices. Nat. Biotechnol. 17, 555-561 (1999).
- . Biologic drugs set to top 2012 sales. Nat. Med. 18, 636 (2012).
- Seib, K. L., Zhao, X., Rappuoli, R. Developing vaccines in the era of genomics: a decade of reverse vaccinology. Clin. Microbiol. Infect. 18, 109-116 (2012).
- Jiang, W., Boder, E. T. High-throughput engineering and analysis of peptide binding to class II MHC. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 13258-13263 (2010).
- Justesen, S., Harndahl, M., Lamberth, K., Nielsen, L. -. L. B., Buus, S. Functional recombinant MHC class II molecules and high-throughput peptide-binding assays. Immun. 5, 1-20 (2009).
