Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Biology

Peptid Epitopların Kantitatif Analiz için bir yüksek veri akışı MHC II Bağlanma Deneyi

doi: 10.3791/51308 Published: March 25, 2014

ERRATUM NOTICE

Summary

Rekombinant insan MHC II molekülleri ile biyokimyasal analizler hızlı, kantitatif immünojenik epitop tanımlaması içine anlayışlar, silme ya da tasarım sağlayabilir. Burada, 384 oyuklu plakalara ölçekli bir peptid MHC-II bağlama deneyi açıklanmıştır. Bu maliyet etkin biçim protein deimmunization ve aşı tasarım ve geliştirme alanlarında yararlı ispatlamak zorundadır.

Abstract

Rekombinant insan MHC II molekülleri ile Biyokimyasal deneyler, hızlı ve nicel imünojenik epitop tanımlama bakış açıları, silme ya da tasarım 1,2 sağlayabilir. Burada, bir peptid-MHC II bağlanma deneyi 384-gözlü formata şekilde ölçeklendirilir. Küçültülmüş protokol% 75 reaktif madde maliyetlerini azaltır ve daha önce 96 oyuklu protokoller 1,3-5 tarif daha yüksek bir kapasiteye sahip olmasıdır. Özel olarak, deneysel tasarım 384-çukurlu ELISA plaka başına bir MHC II aleli karşı 15 peptidlerin sağlam ve tekrarlanabilir bir analiz izin verir. Tek bir sıvı kotarma robotu kullanılarak, bu yöntem, bir araştırmacı, en az 48 saat sekiz konsantrasyonları ve dört MHC II aleli tipleri aralığı üzerinde üç kez yaklaşık doksan deney peptidleri analiz etmeyi sağlar. Protein deimmunization veya aşı tasarımı ve geliştirme alanlarında çalışan Diğerleri protokol kendi işlerini kolaylaştırmada yararlı bulabilirsiniz. Özellikle, adım-adım talimatlar ve görsel biçimivallahi diğer kullanıcıların hızla ve kolayca kendi laboratuarlarında bu metodolojiyi kurmak için izin vermelidir.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Proteinler terapötik ajanların 6 hızlı büyüyen sınıf ve biyoterapötik boru hatlarının hızlı genişleme protein ilaçların geliştirilmesi ve kullanımı ile ilgili sorunlar üzerinde artan ilgi odaklanmıştır. Bir benzersiz göz sağlıklı ve işleyen bir bağışıklık sistemi, tüm hücre-dışı proteinleri antijen sunan hücreler (APC'ler) tarafından örneklenir, gerçeğinden kaynaklanmaktadır. Bir kez APC 'ler tarafından içsel, bir protein küçük peptit fragmanları halinde bölünür ve varsayılan imünojenik bölümler sınıf II ana histokompatibilite kompleksi proteinleri (MHC II) oluk içine yüklenir. Peptid-MHC II kompleksleri daha sonra APC yüzeyi üzerinde görüntülenir, ve gerçek immünojenik peptidleri, aynı kökenli CD4 T hücre yüzey reseptörleri ile 7 üçlü II MHC-peptid-T hücresi reseptörü kompleksler oluşturmak, T hücresi epitopları olarak adlandırılır. Bu kritik moleküler tanıma olay T hücresi aktivasyonuna neden olan bir sinyal akışını kompleks, sitokin salınımını başlatırs, CD4 T hücre aracılı B hücre olgunlaşması ve bağlanan ve soruna neden olan dışsal proteini açık IgG antikorları, dolaşımdaki sonuçta üretim. Bu durumda, proteinlerin imünojenik T hücresi epitoplarını oluşturan belirlenmesi ve MHC II kompleks oluşumu sorumlu anahtar kalıntıların mutasyona tâbi deimmunized olabilir. Bu T hücre epitopları genel olarak çok sayıda ve imünojenik protein boyunca dağıtılmış olabilir, ancak, not taşımaktadır ve epitop silme mutasyonu çoğunluğu protein işlevi veya bir istikrar yanlışlıkla kaybına neden olması muhtemeldir. Bu nedenle, mühendislik biyoterapiler karmaşık ve teknik açıdan zorlayıcı objektif olabilir deimmunized, ancak başarılı T hücresi özü silme projelerin 3,5,8-12 çeşitli örnekler de mevcuttur. Büyük ölçüde terapötik antikor ile sınırlandırılmıştır aşılama-göre "insancıllaştırılması" farklı olarak, epitop, silme bağımsız olarak sekans, yapı, fonksiyon esas olarak herhangi bir protein hedefi uygulanabilir veya homologo kullanılabilirliğiBizi insan iskeleleri. Bu tür bir yaklaşım uygulanması için ilk adım, hedef protein dizisi içinde gömülü önemli peptid epitoplarının tanımlanmasıdır.

Sentetik peptidler ve rekombinant insan MHC II molekülleri kullanarak yüksek verim biyokimyasal tahliller epitop tanımlaması ve hafifletme 1,3-5 içine hızlı ön anlayışlar sağlayabilir. Bu ELISA tip tahliller diğer protein / aşı tasarım ve geliştirme araçları için güçlü bir tamamlayıcı olabilir. Örneğin, epitop haritalama bir iyi kurulmuş deneysel bir yaklaşım zaman, işçilik dayanır ve yoğun ex vivo hücre çoğalma tahlilleri 15 kaynak. Kısaca, hedef proteinin primer dizisinin elde edilmesi ilk örtüşen peptidlerin bir panel ayrılmıştır, 12 artıkları ile, genellikle 15-mer peptidleri arasında bitişik üst üste gelir. Peptit paneli kimyasal olarak sentez edilir ve her bir peptidin bağışıklık çevresel bloo kullanılması birkaç farklı bağışıklık birinde test edilirinsan donörlerden 13,14 izole d mononükleer hücreleri (PBMC). Sonuç daha büyük bir güven sağlamak için, peptidler, tipik olarak 50 veya daha fazla farklı vericilerden alman PBMC ile tekrarlı olarak test edilmiştir. Deimmunization nihai hedeftir durumda da, çalışma mutasyona uğramış peptidlerin ek paneller üreten ve daha sonra fonksiyonel analiz için 10 tam uzunlukta proteinin herhangi bir deimmunizing mutasyonlar dahil önce PBMC deneylerinde yeni peptit paneller test etmek için ihtiyaç daha da karmaşıklaşır. Bu hücre deneyleri, insan hastalarda immünojenik potansiyelini değerlendirmek için altın standart olmaya devam ederken böyle bir kapsamlı yaklaşımın etkinliği, hızlı ve yüksek iş II MHC-peptid bağlama deneyi kullanılarak varsayımsal imünogenik epitopların ön filtreleme ile iyileştirilebilir.

Aynı şekilde, biyokimyasal peptid-MHC II bağlama deneyleri radikal epitop tanıma işlemini hızlandırmak için silico yöntemlerinde önceden tahmin ile kombine edilebilir.T hücre epitop tahminine yönelik hesaplama araçları çeşitli var; örnekler ProPred 16 arasında, MHCPred 17, SVRMHC 18 ARB 19, 20 SMM-align NetMHCIIpan 21 yanısıra EpiVax 22 böyle EpiMatrix gibi özel araçlar. Aynı şekilde, epitop prediktörler son zamanlarda diğer biyoinformatik ve deimmunizing mutasyonlar protein yapısı ve fonksiyonu 23-26 kesebileceği riskini azaltmak için tasarlanmış entegre protein deimmunization algoritmalar elde etmek için moleküler modelleme araçları ile kombine edilmiştir. Birkaç epitop belirleyiciler makul doğru 27,28 olduğu kanıtlanmış olsa da, hesaplamalı sonuçlar her zaman deneysel doğrulama gerektirir. Hızlı, yüksek verimli ve uygun maliyetli deneysel yöntemler siliko epitop tahminler için bir ön filtre olarak en uygundur.

Benzer şekilde, epitop prediktörler ters vaccinolo için antijen seçimi sürebilirsingy 29,30. Örneğin, biyoinformatik gelişmeler hızlı bir patojen proteomlarda çıkarılan bütün protein ya da peptid epitoplarının formunda aşı adaylarını tanımlamak tüm genom ekranlar vermiştir. Bu sağlayan teknoloji koruyucu aşıların keşfi ve gelişimi yeniden şekillendirilmesi iken, immünojenik aşı adaylarının ısrarlı büyük listelerinin şeklinde yeni bir meydan okuma sunuyor. Yüksek üretim peptid-MHC II bağlama deneyleri peptit bağlanma afinitesine miktarının ve birden fazla MHC II alelleri arasında karışıklık bağlanarak epitopu noktası rehberlik eder. Protein deimmunization ile olduğu gibi, deneysel yöntemler sonuçta vaat eden aşı potansiyel hesaplama tahmini doğrulamak için gereklidir.

Burada, 384-gözlü formata ölçekli bir peptid MHC-II bağlama deneyi açıklanmıştır. Protokol derece paralelleştirilmiş ve daha önce 96-çukurlu plaka biçimleri 1,3-5 tarif kıyasla% 75 oranında reaktif madde maliyetlerini azaltır. Tek Liqui kullanılmasıd robot işleme, bu yöntem, bir araştırmacı kolayca en az 48 saat sekiz konsantrasyonları ve dört MHC II aleli tipleri aralığı üzerinde üç kez yaklaşık doksan deney peptidleri analiz etmeyi sağlar. Bu makalede, bir MHC II aleli karşı yedi deney peptidlerinin analizi için, bir 384-çukurlu ELISA plaka kurulumu tarif etmektedir, ancak kolayca istenilen peptidleri ve / veya MHC herhangi bir sayıda deney ölçek şekilde yayılmış tabaka hesap ek malzeme olarak verilmiştir II molekülleri.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Dört ana faaliyetleri peptid-MHC II bağlanma tahlili aşağıdaki kısımları içermektedir: 1-Bağlayıcı: Test peptidler çözelti fazı çözünür MHC II proteinlerin bağlanma için etiketli kontrol peptidler ile rekabet eder. Bağlanma Test peptid konsantrasyonları geniş bir aralık üzerinde ölçülür. 2-Yakalama: Bağlanma reaksiyonu dengeye yaklaştıkça sonra, peptid-MHC II kompleksleri yakalanır ve bir hareketsiz kılınmış antikor ile yapıya bağlı tanıma bağlanmamış peptid ve protein ayrılır. 3-Algılama: Çekilen kontrol peptidi nicel zaman çözümlü bir fluoresans kullanılarak tespit edilir. 4-Analizi: Spektroskopik veri, işlenen çizilen ve test peptidi ve MHC II proteinlerinin doza bağımlı bağlanma özelliklerini tespit etmek için analiz edilir.

Varsa aşağıdaki prosedüre çeşitli adımlarda, bir sıvı taşıma robot kullanılması tavsiye edilir. Özellikle, 384 oyuklu formatta, otomatik dağıtma ve sıvıların seyreltme daha fazla kullanıcı hatası, sonuçlar en aza indirirtutarlı iyi-kuyu hacimleri ve manuel 96 oyuklu deneyleri (veriler gösterilmemiştir) ile karşılaştırıldığında IC 50 değerleri dar bir% 95 güven aralıklarını verir. Bir sıvı kotarma robotu mevcut değil ise, "(sıvı kotarma robotu)" ile açıklama adımları elle yapılabilir. Mümkünse Benzer şekilde, 384-gözlü formata ile uyumlu olan bir otomatik plaka yıkayıcı tavsiye edilir. Bu etkin plaka yıkama işlemini standardize eder. Bir tabak yıkayıcı mevcut değilse, "(tabak yıkayıcı)" açıklamalı adımları elle yapılabilir.

1.. Coat ELISA Plakası (Gün 1)

  1. 10 ug / ml 'lik bir konsantrasyona kadar çalışma Borat Tamponu içinde L243 antikor stok (0.5 mg / ml) seyreltin.
    1. Kaplamak için tek bir 384-plaka, Borat Tampon 9.8 ml stok antikor 200 ul ekleyin. (Alternatif ölçeklendirme için tamamlayıcı elektronik tablo hesap bakınız).
  2. , 384-w her bir oyuğuna L243 antikor çözeltisi 25 ul ekleell beyaz ELISA plakasını yüksek bağlayıcı. (Sıvı taşıma robotu)
  3. Bir polyester film ile yalıtılır ve bu plaka, 4 ° C de bir gece inkübe
    Not: her biri 384-çukurlu ELISA plakası 15 test, bir MHC II aleli için sekiz seyreltilerde peptidler, hem de pozitif ve negatif kontroller için uygun olabilir. Bu sonuçta üçlü ölçümleri verecektir.

2. Test Peptid seyreltme (Gün 1) Marka

  1. DMSO içinde her bir test peptidinin bir 10 mM stok ile başlayarak, 384 oyuklu polipropilen plakaları (Tablo 1) kullanılarak sitrat fosfat tamponu içinde aşağıdaki seyreltme serisi olun. (Sıvı taşıma robotu)
    Not: Tam bir 384-oyuklu polipropilen tabla içinde üç ayrı ELISA plakaları gerektirir. Bir polipropilen plakanın sadece üçte biri, bir ELISA plakasını (Şekil 1) gerekmektedir.
Seyreltme sayısı Cilt to önce seyreltme / stok almak Ekleme Cilt Sitrat Tampon Kons. Seyreltme Kons. Cilt Reaksiyonunda Kons. nötralize ELISA'da
(Ul) (Ul) (UM) (UM) (UM)
1 0.7 35.1 195,531 97,765 48.883
2 14.3 14.3 97,765 48.883 24.441
3 7.1 28.7 19.389 9.695 4.847
4 14.3 14.3 9.695 4.847 2,424
5 7.1 28.7 1.923 0.961 0.481
6 14.3 14.3 0.961 0.481 0.24
7 7.1 28.7 0.191 0.095 0.048
8 14.3 14.3 0.095 0.048 0.024
Çıkarın ve seyreltme 8 numaradan peptid çözeltisi 7.1 ul atın.

Test Peptid seyreltme serisi Tablo 1.. Hazırlanması.

Şekil 1
Şekil 1. Bağlanma Tahlili Peptid yakınlarındaki Plate. 384 oyuklu polipropilen plakalar içerisinde peptid seyreltisi (A) haritası. Her polipropilen plaka şarkı karşı rekabet bağlama reaksiyonlarında 15 peptidler üç grup ağırlayacak le MHC II aleli. Bağlanma reaksiyonu dengeye yaklaştıkça sonra, (B), her bir peptid grubu, bir anti-MHC II antikoru ile önceden kaplanmış olan ayrı bir 384-çukurlu ELISA plakasına, üç kopya olarak transfer edilir.

3. MHC II Master Mix (Gün 1) hazırlayın

  1. Reaksiyon Buffer olun
    1. Fosfat Tampon 3920 ul 1 mM Pefa bloku 80 ul ve oktil-β-D-glucopyranaside 60 mg ekleyin. (Alternatif ölçeklendirme için tamamlayıcı elektronik tablo hesap bakınız).
  2. Bir 15 ml konik tüp (Tablo 2) kullanılarak reaksiyon tamponu içinde 101 nM'ye seçilen MHC II stok çözelti seyreltin.
    Not: MHC II konsantrasyon sonunda nötralize ELISA tahlilinde bağlama reaksiyonu, 25 nM, 50 nM olacaktır. MHC II stok konsantrasyonları üretici yeri sayısına bağlı olarak değişecektir. (Ek-tablo hesap bakınız).
"> MHC II Allel DRB1 *: 1501 MHC II stok konsantrasyonu (mg / ml) 1.3 MHC II stok konsantrasyonu (mM) 20 Vol. MHC II Stok Ekle (ml) 14.65 Vol. Reaction Buffer Ekle (ml): 2.885,35 MHC II Master Mix Konsantrasyon (nM) 101

MHC II master karışımı Tablo 2.. Hazırlanması.

4. Negatif ve Pozitif Kontroller (Gün 1) hazırlayın

  1. Adım 2.1 'den 384 oyuklu polipropilen bir plaka (Şekil 1A) "Negatif kontrol" oyuğuna sitrat fosfat tampon 21.5 ul ekleyin.
  2. 384 oyuklu polipropilen plakanın "Pozitif kontrol" oyuğuna sitrat fosfat tampon 21.5 ul ekleyin.
    Not: "pozisyonunutive kontrol "altında, 5. bölümünde tamamlanacaktır.
  3. Bir 1.5 ml Eppendorf tüpüne adım 3.2 ve pipetten MHC II Master Mix 49.5 ul çıkarın.
  4. Aşama 4,3 MHC II Master Mix 49.5 ul sitrat tampon 0.5 ul ekleyin.
  5. 384 oyuklu polipropilen plakanın "Negatif kontrol" oyuk (Şekil 1A) adım 4,4 MHC II Master Mix ayarlandı konsantrasyonunun 21.5 ul ekleyin.
    Not: Bu örnek MHC II protein, NO kontrol peptit, ve NO deney peptid içeren sıfır sinyal negatif denetimini temsil eder.

5. MHC II Master Mix için uygun kontrol peptidi (Gün 1) ekleme

MHC II Allel DRB1 * Biyotinile kontrol Peptide (Tortu) Sekans
0101 Flu-HA-B (306-318) Biotin-(Ahx) (Ahx) PRYVKQNTLKLAT-amit
0301 Miyoglobin (137-148) Biotin-(Ahx) - (Ahx)-LFRKDIAAKYKE-OH
0401 YAR-B (1-14) Biotin-(Ahx) (Ahx) YARFQSQTTLKQKT-OH
0701 TetTox-B (830-843) Biotin-(Ahx) (Ahx) QYIKANSKFIGITE-OH
1101 Flu-HA-B (306-318) Biotin-(Ahx) (Ahx) PRYVKQNTLKLAT-amit
1501 MBP-B (84-102) Biotin-(Ahx) (Ahx) NPVVHFFKNIVTPRTPPPS-OH

* Biz, ekonomi için 10 mg ölçek sipariş öneririz.
Tablo 3. Çeşitli MHC II alelleri için kontrol Peptides. *

  1. 20 uM bir seyreltilmiş stokları elde etmek için taze DMSO (DMSO içinde 400 uM depolanan) kontrol peptidi 1:20 seyreltin.
    1. 25 ul 400 uM peptid kontrol ekle475 ul DMSO. Not: Bu büyük bir fazla olmakla birlikte, yapışkan DMSO çözeltisi doğru olarak işlenmesine izin verir.
  2. Adım 3.2 'den daha fazla MHC II Master Mix olarak aşama 5.1 (20 mM) 1:100 arasındaki kontrol peptidi seyreltin.
    1. MHC II Master Mix kalan 2,850.5 ul Adım 5.2 'de inceltilmiş kontrol Peptid 28.8 ul ekleyin.
  3. 384 oyuklu polipropilen bir plaka (adım 4.2) (Şekil 1A) pozitif kontrol çukuruna kontrol peptidi (adım 5.2) ile MHC II Master Mix 21.5 ul ekleyin. Not: Bu örnek MHC II protein, kontrol peptid, ve NO deney peptid içeren yüksek sinyal pozitif denetimini temsil eder.

6. Bağlanma reaksiyonu, (Gün 1) Marka

  1. Binding reaksiyon oluşturmak için bir 1:1 oranında test Peptid seyreltileri (adım 2.1) her bir kontrol peptidi (adım 5.2) ihtiva eden MHC II Master Mix ekleyin.
    1. Con içeren MHC II Master Mix 21.5 ul ekleAdım 2.1 'den her bir test Peptid seyreltme 21.5 ul aşama 5.2' den trol Peptide. (Sıvı taşıma robotu)
  2. Bir polyester film ile kapatın ve Binding Reaction çalkalamadan 37 ° C'de olmayan bir CO2 kuluçka makinesi içinde kontrollü 12-24 saat inkübe edilir.

7. Nötralize ve bağlama reaksiyonu, (Gün 2) transfer

  1. 37 ° C inkübatör arasındaki bağlanma reaksiyonu (adım 6.2) ihtiva eden 384 çukurlu polipropilen plaka çıkarın.
  2. Nötralizasyon Tamponu ile Binding Reaction 1:01 seyreltin. (Sıvı taşıma robotu)
    1. Her iyi Binding Reaksiyonuna Nötralizasyon Buffer 43 ul ekleyin.
  3. 4 ° C arasındaki ELISA plakasını (adım 1.3) çıkarın ve PBS-% 0.05 Tween 20 içinde 60 ml / yuva ile 3 kez yıkayın. (Tabak yıkayıcı)
  4. Aktarım aşama 7.3 antikor kaplı 384-çukurlu ELISA plakasının üç kopyalı oyuklarına aşama 7.2 her bir nötralize bağlanma reaksiyonunda 25 ul. (Şekil 1
  5. Gece boyunca, 2.5 saat boyunca 37 ° C kuluçka makinesi içinde ya da 4 ° C buzdolabı içinde bir polyester film ve yer ile ELISA plakasını örtün.

8. ELISA Development (Gün 2 ya da 3)

  1. Aşama 7.5 ELISA plaka çıkarın, 60 ul / göz PBS-% 0.05 Tween ile 3 kez yıkayın. (Tabak yıkayıcı)
  2. DELFIA Test Tamponu içinde Streptavidin-Europium stok çözeltisi (0.1 mg / ml streptavidin, 3 + 7 Eu / streptavidin) 1000-kat seyreltiniz.
    1. Bir 384-oyuklu bir plaka için, 10 ml Test Tamponu içinde 10 ul streptavidin-europium seyreltin.
  3. Adım 8.1 'den 384 çukurlu ELISA plakasının her oyuğuna seyreltilmiş streptavidin-Evropiyum 25 ul ekle. (Sıvı taşıma robotu)
  4. 1 saat boyunca oda sıcaklığında karanlıkta bir polyester film ve yer ile plaka örtün. Not: 1 saat bekleme süresi boyunca buzdolabından Cinsel Çözüm kaldırmak ve RO karanlıkta 10 ml / plaka kenaraom sıcaklığı.
  5. 1 saat inkübe edildikten sonra, 60 ul / göz PBS-% 0.05 Tween ile adım 8.3 3x gelen 384-çukurlu ELISA plakasını yıkayın. (Tabak yıkayıcı)
  6. Aşama 8.5 384 çukurlu ELISA plakasının her oyuğuna geliştirme çözeltisi 25 ul ekle. (Sıvı taşıma robotu)
  7. Bir polyester film ile 384-çukurlu ELISA plaka Kapak ve levha 10-15 dakika boyunca oda sıcaklığında karanlıkta oturmasına izin verir.
  8. 200, Dur Int:. 1000, Ex 340, Em 10-15 dakika inkübe edildikten sonra, bir örneğin, Öropiyum zaman ayarları ile çözüldü floresan levha okuyucu (Başlangıç ​​Int kullanarak adım 8.7 384-çukurlu ELISA plakasının floresans okuma . 615, Kesim: Yok, PMT: Otomatik, / Peki Okur: 50).

9. Veri Analizi

  1. Yan yan sütunlarda 3 suret değerleri (Y = floresan ölçüm X = test peptid konsantrasyonu) ile XY formatı grafikte verileri girin.
  2. Tüm veriler için X değerleri log dönüşümü: X = log (X)
  3. Günlük tra FitIC50 değeri elde etmek için bir site bağlanma modeline veri nsformed.
  4. Ortalama negatif kontrol değerine alt değerini kısıtlayın.
  5. Küresel üst değerini uygun ve küresel uyum parametresi altında veya pozitif kontrol eşit olduğunu sigortalamak.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Enterobacter cloacae P99 beta-laktamaz (BLA) (Genbank ID # X07274.1) ait olgun peptid dizisi, MHC II aleli DRB 1 * 1501 (Tablo 4) için varsayılan peptit bağlayıcı için ProPred 16 ile analiz edilmiştir. ProPred zorunlu bir çapa P1 tortusu ile 117 nonamer peptidler tanımlanmıştır (örneğin, bir M, L, I, V, E, Y, ya da 31, bağlama MHC II için gerekli pozisyon 1, at W). % 5 eşiğinde, sadece daha yüksek puan veya 2.6 'e eşit olasıdır bağlayıcılardır ile peptidleri. Böylece,% 5 eşik, sadece en iyi 11 peptidler * 1501 MHC II DRB1 bağlamak tahmin edilmektedir.

Tablo 4
Tablo 4. Top-puanlama BLA peptidler ve * 1501 MHC II alel DRB1 tahminler ProPred.

Tahmin epitop temsilcisi panelies eden MHC II bağlama tahlilinde (Tablo 4, kalın giriş) analiz için seçildi. On beş artıklarının BLA peptit fragmanları kimyasal olarak kabul edilen nonamer MHC II epitopları sentetik protein fragmanlarının içinde gömülü olduğu gibi sentezlendi. MHC II bağlayıcı oluk kendisini sadece dokuz amino asitler için uygun olsa da, kan kuşatıcı sekanslar, peptit-MHC II etkileşimleri etkileyebileceğini düşündürmektedir ve 15-20 kalıntılarının sentetik peptitler, bu nedenle genel olarak 15 meslek vardır. , Biyolojik olarak işlenmiş protein fragmanları meydana gelebilecek örtüşen epitopları karmaşıklığını temsil etmek için, (i) bir tahmin bağlayıcı maddeler, (ii) bir tahmin nonbinders, (iii) birden çok bağlayıcı tahmin, (iv) çok sayıda nonbinders tahmin ihtiva sentetik sekanslar test ya da (v) tahmin edilen bağlayıcı ve nonbinders (Tablo 4 ve 5) bir karışımı olabilir.

Tablo 5 Kimyasal olarak sentezlenen peptitlerin Tablo 5. Listesi.

Yukarıdaki protokol açıklandığı gibi MHC II DRB1 * 1501 bağlanma için biyotinile edilmiş MBP-B, kontrol peptidi (Tablo 3) ile rekabet için aşağıdaki sentetik peptidlerin kapasitesi analiz edilmiştir. Sentetik peptidler için rekabetçi bağlama eğrisi, Şekil 2'de gösterilmiştir. IC50 değerleri Prism bir yerinde rekabetçi bağlanma, lineer olmayan uyum fonksiyon (Tablo 6) ile log-dönüşümlü veriler uyarlanması suretiyle hesaplanmıştır. Şekil 2'de görüldüğü gibi, peptidler doğal olarak üç gruba bölüm: IC 50 ile güçlü bağlayıcılar, <1 uM (peptitler, 2 ve 10), 1 uM ile orta bağlayıcı IC50 <100 uM (peptitler, 4, 9, 11, ve 24 ≤ ); IC 50 ≥ 100 μ zayıf bağlayıcı, M (peptid 31).

Şekil 2,
Şekil 2. MHC II alel DRB1 BLA Peptidlerinin Rekabetçi Binding Eğri * 1501. Sıkı bağlayıcı turuncu çizgiler, orta bağlayıcı yeşil çizgiler ve zayıf bağlayıcı bir bordo çizgi ile uyum vardır.

Peptit Rank IC50 (uM) IC 50 için% 95 CI (iM) Uygun kalitesi (R 2)
2 0,1199 ,09404-0,1529 0.98
4 15.1 11,83-19,28 0.87
9 17.11 13,39-21,88 0.81
10 0,2743 0,2149-0,3502 0.98
11 10.49 8,252-13,34 0.98
24 4.787 3,769-6,082 0.96
31 190.6 137,7-263,9 0.80

Tablo 6. DRB1 * 1501 için BLA peptit fragmanlarının 50 IC değerleri hesaplanmıştır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Biotherapeutics 2012 32 ilk beş satan ilaçların dördünü temsil eden, modern tıbbın bir köşe taşı olarak kendilerini kurduk. Biopharmaceuticas sektörü birkaç yıl 6 için sürekli bir büyüme göstermiştir ve yeni ajanların sürekli geliştirme gibi biyobenzerlerin çıkması biyofarmasötik boru hatlarını genişletti. , Geleceğe bakıyorum değerlendirilmesi ve protein tedavisinin immünojenikliğini hafifletici erken evre biyoterapötik gelişiminin ayrılmaz bir parçası haline gelecektir. Bu süreci kolaylaştırmak için, biotechnologists epitop tahmini 16-22 için hesaplama yöntemleri kendileri gibi işlev 3,23-26 korurken imünogenliğini azaltmak için talep entegre protein tasarım algoritmaları boşuna olabilir. Aynı şekilde, aşı tasarım ve geliştirme öngörü algoritmaları 4 gücünü yararlanmak olabilir ve ters aşılama için devam olgunlaşma koruyucu verim bekleniyorönceki çalışmaları 33 atlatmış enfeksiyöz ajanların geniş bir dizi için aşılar. Bu hesaplama araçları kökten ilaç ve aşı geliştirme süreçlerini hızlandırma kapasitesine sahip iken, siliko tahminler sonuçları sonuçta daha bu kadar iyi performans adayların uysal sayısını belirlemek için filtre edilmelidir. Nicel peptid-MHC II analizinde son gelişmeler Lüminesans oksijen tayinleri 35 kanallık göre işlenmiş maya hücre yüzeyi görüntü sistemleri 34 ve mikroboncuk gelişimini dahil, ama in vitro deneyler, ELISA tipi spesifik MHC II ve peptit çiftleri arasındaki bağlanma miktarının belirlenmesi için beygir kalır. Burada, insan MHC II bağışıklık moleküllerine bağlanma peptit epitopunun, hızlı nicel ve maliyet etkin bir analizi için bir mikro-litre ölçekte prosedür tarif edilmektedir. Bu yöntemler, huni sürecinde erken evre deneysel araç olarak kullanılabilmektedir.

Pu içingösteri rposes, bla dizisi ProPred web sunucusu ile farazi II MHC bağlama peptidleri için analiz edildi. Bu peptidlerin yedi kimyasal olarak sentezlenebilir ve deneysel olarak çözünebilir insan MHC II DRB1 * 1501 bağlanma için test edildi. Belirleyicisi doğruluk 28 diğer analizlere benzer, ProPred bağlayıcı tahmin DRB1 * 1501 MHC II alel için deneysel olarak ölçülen IC 50 ile oldukça iyi korelasyon. Bu doğru MHC dilüsyonlarını, kontrol peptidler, ve test peptidler sağlamak için alınması gereken sonuçlar konsantrasyonlarda ve bakım değişimlerine duyarlı olduğuna dikkat etmek de önemlidir. Aynı şekilde, bu yöntemin bir sınırlama IC50 değerleri MHC konsantrasyonlarında ve kontrol peptidleri göre olmasıdır. BLA peptid test seti arasında, en yüksek ProPred epitop rekombinant DRB1 * 1501 için bağlayıcı güçlü sergiledi sırada. Benzer şekilde, tüm diğer tahmin bağlayıcı epitop, MHC II yüksek afiniteleri ve orta sergiledi. Beklendiği gibi,üst üste gelen tahmin edilen bağlama epitopu ve bağlayıcı olmayan bir epitoplarını içeren sentetik peptidler her durumda MHC II bağlandığı bulunmuştur. Tahmin epitoplann sıralanır, en düşük iki yayılmış peptid 31, zayıf MHC II bağlayıcı olduğunu kanıtladı. Peptid 24, bununla birlikte, bu, sadece yüksek sıralanmış oluşturucu epitopu (epitop 24),% 5 eşiğinde bir tahmin bağlayıcı olmadığı gerçeğine rağmen orta afiniteli MHC II bağlandığı bulunmuştur. İlginçtir, epitop 24 BLA 10 deimmunizing amaçlayan bir önceki çalışmada tespit edilmiştir. Bu deneylerde, sentetik peptid 24, insan PBMC deneylerinde yüksek ölçüde imünojenik olduğu gösterilmiştir. Böylece, bu durumda, bizim MHC II bağlama deneyi ProPred ise gelmediğini immünojenisite öngörü olduğunu kanıtladı. Agrega olarak sonuçlar muhtemel İmmünojenik epitoplardan doğru araştırmacılar rehberlik hesaplama tahminlerin kullanılmasını göstermek, ama onlar da ayrılmaz bir parçası olarak yüksek kapasiteli deneysel yöntemlerin öneminin altınıprotein / aşı tasarım süreci.

Daha da önemlisi, bu 384 oyuklu deney tasarımı oldukça paralelleştirilmiş ve en fazla 15 peptitler ve 384-çukurlu ELISA plaka başına bir MHC II aleli sıkı analiz edilmesini sağlar. Tek bir sıvı taşıma robot kullanarak, bu yöntem bir araştırmacı az 48 saat içinde dört MHC II alel türlerine karşı doksan testi peptidler analiz etmeyi sağlar. Bu tasarım, her bir konsantrasyonda sekiz farklı konsantrasyonlarda test peptidi ve üç kez tekrarlanan ölçümü yapılacaktır. Bu nedenle, kullanıcı, sağlam ve tekrarlanabilir kantitatif sonuçlar sağlanır. Protein tedavi veya aşı tasarımı ve geliştirme alanlarında çalışan Diğerleri bu protokol protein deimmunization veya immünojeniklik analiz işlerini kolaylaştırmada yararlı bulabilirsiniz.

Fosfat Tampon (22.2 mM Sitrik Asit, 55.6 mDibazik M Na 2 HPO 4, pH 5.4)
222 ml 0.1 M sitrik asit
278 ml 0.2 M Na dibazik 2 HPO 4
500 ml MilliQ H2O
Sitrik asit, sodyum fosfat ve MilliQ H2O içinde 450 ml karıştırın 5.4 pH ayarlayın ve 1 L. QS
Bu çözelti, oda sıcaklığında stabildir.
Bağlama Reaksiyon Tamponu
Fosfat Tamponu, pH 5.4 ile % 2 v / v, 1 mM Pefabloc
1.5% w / v Oktil-β-D-glucopyranaside
Hemen kullanın.
1 mM Pefabloc
1 ml MilliQ H2O
25 mg Pefablok SC (toz)
-20 ˚ C'de alikotları ve mağaza olun
Borat Tampon Formül (12.5 mM Sodyum pirobirikdekahidrat, pH 8.2)
1.19 g sodyum tetraborat dekahidrat (Sigma)
250 ml MilliQ H2O
MilliQ H 2 O'dan 225 ml sodyum tetraborat dekahidratı çözülür 250 ml 8.2 ve QS pH ayarlayın.
Bu çözelti, oda sıcaklığında stabildir.
PBS-Tween (2.7 mM KCI, 1.5 mM KH 2 PO 4, 136.9 mM NaCl, 8.9 mM Na 2 HPO 4 • 7H 2 O,% 0.05 Tween, pH 7.4)
4.5 L MilliQ H2O 500 ml 10x Dulbecco PBS (DPBS)
2.5 ml Tween 20
Bu çözelti, oda sıcaklığında stabildir.
Nötralizasyon Tamponu (50 mM Trizma HCl, pH 8.0)
475 ml MilliQ H2O
25 ml 1 M Trizma HCl
Karıştırın ve 8.0 'a pH ayarlamak
Bu çözelti, 4 ° C'de stabildir

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Leonard Moise tarafından istihdam ve EpiVax, Inc, Providence, RI bulunan özel sektöre ait biyoteknoloji şirketi hisse senedi opsiyonlarını tutar. Bu araştırma raporunda yer alan çalışma şirketin ticari hedefleri ile ilişkili olabilecek herhangi bir önyargı ücretsizdir.

Acknowledgments

Bu çalışma NIH hibe R01-GM-098977 ve CBK ve KEG R21-AI-098122 tarafından desteklenmiştir. RSS Mühendislik Thayer School Thayer Yenilik Programı Bursu ile bir Luce Vakfı Bursu tarafından ve kısmen desteklenmiştir.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sodium Tetraborate Decahydrate Sigma 221732
Citric Acid Sigma C1901
Dibasic Sodium Phosphate Sigma S7907
Trizma HCl OmniPur 9310
Tween-20 Sigma P7949
100% DMSO Sigma D8418
Octyl-β-D-Glucopyranaside Fischer 29836-26-8
Pefa Bloc SCF Roche 1158591600
Dulbecco’s 10x Phosphate Buffered Saline Invitrogen 14200-166
DELFIA Assay Buffer Perkin Elmer 4002-0010
DELFIA Enhancement Buffer Perkin Elmer 4001-0010
Europium Labelled Streptavidin Perkin Elmer 1244-360
L243 anti-HLA-DR antibody Biolegend 307602
Biotinylated tracer peptides 21st Century Biochemicals Custom Order
Test peptides (1-4 mg, 85% purity) Genscript Custom Order
Purified HLA-DRB1 monomers (non-biotinylated) Benaroya Research Institute* Custom Order
384-well white EIA/RIA plate Thermo 460372
Polypropylene 384-well plate Costar 3656
Film, AxySeal, 80 µm, ELISA Applicator  Axygen Ascientific PCR-SP
MilliQ Water N/A N/A
Epimotion Liquid Handler (or similar) Eppendorf 5075
Select TS Plate Washer (or similar) BioTek 405
SpectraMax Gemini Microplate Reader (or similar) Molecular Devices N/A
*Recombinant human MHC II molecules can be obtained from the Benaroya Tetramer Core Laboratory.  See: https://www.benaroyaresearch.org/our-research/core-resources/tetramer-core-laboratory

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Steere, A. C., et al. Antibiotic-refractory Lyme arthritis is associated with HLA-DR molecules that bind a Borrelia burgdorferi peptide. J. Exp. Med. 203, 961-971 (2006).
  2. Raddrizzani, L., et al. Different modes of peptide interaction enable HLA-DQ and HLA-DR molecules to bind diverse peptide repertoires. J. Immunol. 159, 703-711 (1997).
  3. Osipovitch, D. C., et al. Design and analysis of immune-evading enzymes for ADEPT therapy. Protein Eng. Design. 25, 613-623 (2012).
  4. Moise, L., et al. In silico-accelerated identification of conserved and immunogenic variola/vaccinia T-cell epitopes. Vaccine. 27, 6471-6479 (2009).
  5. Moise, L., et al. Effect of HLA DR epitope de-immunization of Factor VIII in vitro and in vivo. Clin. Immunol. 142, 320-331 (2012).
  6. Aggarwal, S. R. What's fueling the biotech engine-2011 to 2012. Nat. Biotechnol. 30, 1191-1197 (2012).
  7. Trombetta, E. S., Mellman, I. Cell biology of antigen processing in vitro and in vivo. Ann. Rev. Immunol. 23, 975-1028 (2005).
  8. Warmerdam, P. A. M., et al. Elimination of a human T-cell region in staphylokinase by T-cell screening and computer modeling. Thrombosis Haemostasis. 87, 666-673 (2002).
  9. Jones, T. D., et al. Identification and removal of a promiscuous CD4+T cell epitope from the C1 domain of factor VIII. J. Thrombosis Haemostasis. 3, 991-1000 (2005).
  10. Harding, F. A., et al. A beta-lactamase with reduced immunogenicity for the targeted delivery of chemotherapeutics using antibody-directed enzyme prodrug therapy. Mol. Cancer. 4, 1791-1800 (2005).
  11. Mazor, R., et al. Identification and elimination of an immunodominant T-cell epitope in recombinant immunotoxins based on Pseudomonas exotoxin A. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, E3597-E3603 (2012).
  12. Cantor, J. R., et al. Therapeutic enzyme deimmunization by combinatorial T-cell epitope removal using neutral drift. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 1272-1277 (2011).
  13. Kern, F., LiPira, G., Gratama, J. W., Manca, F., Roederer, M. Measuring Ag-specific immune responses: understanding immunopathogenesis and improving diagnostics in infectious disease, autoimmunity and cancer. Trends Immunol. 26, 477-484 (2005).
  14. Li Pira, G., Ivaldi, F., Moretti, P., Manca, F. High throughput T epitope mapping and vaccine development. J. Biomed. Biotechnol. 2010, 325720 (2010).
  15. Hoffmeister, B., et al. Mapping T cell epitopes by flow cytometry. Methods. 29, 270-281 (2003).
  16. Singh, H., Raghava, G. P. ProPred: prediction of HLA-DR binding sites. Bioinformatics. 17, 1236-1237 (2001).
  17. Guan, P., Doytchinova, I. A., Zygouri, C., Flower, D. R. MHCPred: bringing a quantitative dimension to the online prediction of MHC binding. Appl. Bioinformatics. 2, 63-66 (2003).
  18. Wan, J., et al. SVRMHC prediction server for MHC-binding peptides. BMC Bioinformatics. 7, 463 (2006).
  19. Bui, H. H., et al. Automated generation and evaluation of specific MHC binding predictive tools: ARB matrix applications. Immunogenetics. 57, 304-314 (2005).
  20. Nielsen, M., Lundegaard, C., Lund, O. Prediction of MHC class II binding affinity using SMM-align, a novel stabilization matrix alignment method. BMC Bioinformatics. 8, 238 (2007).
  21. Nielsen, M., Justesen, S., Lund, O., Lundegaard, C., Buus, S. NetMHCIIpan-2.0 - Improved pan-specific HLA-DR predictions using a novel concurrent alignment and weight optimization training procedure. Immun. Res. 6, 9 (2010).
  22. De Groot, A. S., Knopp, P. M., Martin, W. De-immunization of therapeutic proteins by T-cell epitope modification. Dev. Biol. 122, 171-194 (2005).
  23. Choi, Y., Griswold, K. E., Bailey-Kellogg, C. Structure-based redesign of proteins for minimal T-cell epitope content. J. Comput. Chem. 34, 879-891 (2013).
  24. Parker, A. S., Choi, Y., Griswold, K. E., Bailey-Kellogg, C. Structure-guided deimmunization of therapeutic proteins. J. Comput. Biol. 20, 152-165 (2013).
  25. Parker, A. S., Griswold, K. E., Bailey-Kellogg, C. Optimization of therapeutic proteins to delete T-cell epitopes while maintaining beneficial residue interactions. J. Bioinform. Comput. Biol. 9, 207-229 (2011).
  26. Parker, A. S., Zheng, W., Griswold, K. E., Bailey-Kellogg, C. Optimization algorithms for functional deimmunization of therapeutic proteins. BMC Bioinformatics. 11, 180 (2010).
  27. De Groot, A. S., Martin, W. Reducing risk, improving outcomes: Bioengineering less immunogenic protein therapeutics. Clin. Immunol. 131, 189-201 (2009).
  28. Wang, P., et al. A systematic assessment of MHC class II peptide binding predictions and evaluation of a consensus approach. PLoS Comput. Biol. 4, e1000048 (2008).
  29. Sette, A., Rappuoli, R. Reverse vaccinology: developing vaccines in the era of genomics. Immunity. 33, 530-541 (2010).
  30. Moise, L., Cousens, L., Fueyo, J., De Groot, A. S. Harnessing the power of genomics and immunoinformatics to produce improved vaccines. Expert Opin. Drug Discov. 6, 9-15 (2011).
  31. Sturniolo, T., et al. Generation of tissue-specific and promiscuous HLA ligand databases using DNA microarrays and virtual HLA class II matrices. Nat. Biotechnol. 17, 555-561 (1999).
  32. Biologic drugs set to top 2012 sales. Nat. Med. 18, 636 (2012).
  33. Seib, K. L., Zhao, X., Rappuoli, R. Developing vaccines in the era of genomics: a decade of reverse vaccinology. Clin. Microbiol. Infect. 18, 109-116 (2012).
  34. Jiang, W., Boder, E. T. High-throughput engineering and analysis of peptide binding to class II MHC. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 13258-13263 (2010).
  35. Justesen, S., Harndahl, M., Lamberth, K., Nielsen, L. -L. B., Buus, S. Functional recombinant MHC class II molecules and high-throughput peptide-binding assays. Immun. 5, 1-20 (2009).

Erratum

Formal Correction: Erratum: A High Throughput MHC II Binding Assay for Quantitative Analysis of Peptide Epitopes
Posted by JoVE Editors on 03/18/2019. Citeable Link.

An erratum was issued for: A High Throughput MHC II Binding Assay for Quantitative Analysis of Peptide Epitopes.  There were typos in the Protocol section and Table 2.

Step 3.1.1 in the Protocol was updated from:

Add 80 µl of 1 mM Pefa Bloc and 60 mg of octyl-β-D-glucopyranaside to 3,920 µl of Citrate Phosphate Buffer. (See supplemental spreadsheet calculator for alternative scaling).

to:

Add 80 µl of 1 mM Pefa Bloc and 60 µg of octyl-β-D-glucopyranaside to 3,920 µl of Citrate Phosphate Buffer. (See supplemental spreadsheet calculator for alternative scaling).

Step 5.2 in the Protocol was updated from:

Further dilute the Control Peptide from step 5.1 (20 mM) 1:100 into the MHC II Master Mix from step 3.2.

to:

Further dilute the Control Peptide from step 5.1 (20 µM) 1:100 into the MHC II Master Mix from step 3.2.

Table 2 was updated from:

MHC II Allele DRB1*: 1501
MHC II Stock Concentration (mg/ml) 1.3
MHC II Stock Concentration (mM) 20
Vol. MHC II Stock to Add (ml) 14.65
Vol. Reaction Buffer to Add (ml): 2885.35
MHC II Master Mix Concentration (nM) 101

to:

MHC II Allele DRB1*: 1501
MHC II Stock Concentration (mg/ml) 1.3
MHC II Stock Concentration (μM) 20
Vol. MHC II Stock to Add (μl) 14.65
Vol. Reaction Buffer to Add (μl): 2885.35
MHC II Master Mix Concentration (nM) 101
Peptid Epitopların Kantitatif Analiz için bir yüksek veri akışı MHC II Bağlanma Deneyi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Salvat, R., Moise, L., Bailey-Kellogg, C., Griswold, K. E. A High Throughput MHC II Binding Assay for Quantitative Analysis of Peptide Epitopes. J. Vis. Exp. (85), e51308, doi:10.3791/51308 (2014).More

Salvat, R., Moise, L., Bailey-Kellogg, C., Griswold, K. E. A High Throughput MHC II Binding Assay for Quantitative Analysis of Peptide Epitopes. J. Vis. Exp. (85), e51308, doi:10.3791/51308 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter