Summary
Biz, hipokampusun CA1 bölgesinde ve dilimin tetanized alan nükleer zenginleştirilmiş kısımların daha sonraki izolasyon Uzun süreli potansiyasyon indüksiyonu için ayrıntılı bir protokol sağlar. Bu yaklaşım, önemli aktivitesini öğrenme ve hafıza ile hücresel modellerinde bağımlı nükleer protein alma belirlemek için kullanılabilir.
Abstract
Öğrenim aktivitesine bağlı protein ekspresyonu, hücre-altı yer değiştirmesi, ya da fosforilasyon sinaptik plastisite altında yatan hücresel mekanizmaların anlaşılması önemlidir. Uzun vadeli potansiyelleri (LTP) ve akut hipokampal dilim bağlı uzun süreli depresyon (LTD) yaygın öğrenme ve hafızanın hücresel modelleri olarak kabul edilir. Etkinlik bağımlı protein dinamikleri görselleştirmek için canlı hücre görüntüleme veya immünohistokimya yaklaşımları kullanmak birçok çalışma bulunmaktadır. Bununla birlikte, bu yöntemler tek nöronlarda floresan-etiketli proteinlerin immünolojik hücre ya da aşırı dışavurumu için antikorların uygunluğu dayanır. Proteinlerin İmmünoblotting bulguların bağımsız onay veren bir alternatif yöntemdir. Bireysel tetanized hipokampal dilimlerde sub-hücresel fraksiyonları hazırlanmasında ilk sınırlayıcı faktör, malzemenin düşük miktarıdır. İkinci olarak, işleme yöntemi çok önemlidir l, hatta çok kısa bir küçük ve manipülasyon içindilimleri Iving belirli sinyal silsileleri uyarmamaktadır olabilir. Burada fare beyninden akut hippokampüs kesitlerinin CA1 bölgesinde yeterli saflıkta nükleer bakımından zengin kısım için yeterli malzeme elde etmek için bir optimum iş akışını açıklar. Temsili bir örnek olarak, synapto-nükleer protein haberci ERK1 / 2 fosforlu şekli Jacob aktif LTP indüksiyonu üzerine çekirdeğe doğru yer değiştirir ve CA1 nöronlarının bir nükleer bakımından zengin kısım tespit edilebileceğini göstermektedir.
Introduction
Sinaptik N-metil-D-aspartat-reseptörler (NMDARs) sinaptik plastisite ve hücre hayatta kalma ve nörodejenerasyonunun hücre ölümünü nasıl tetikleyebildiği extrasynaptic NMDARs aktivasyonu ise sinyal çok önemli bir rol oynar. Bu değişiklikler sıkı kontrol / düzenlenmiş bir faaliyet bağımlı gen ifadesine bağlı ve böylece aktif sinaps veya dendritler ve nükleus 7 arasında sürekli iletişim gerektirir. MAP ERK1 / 2 sinyalizasyon sinaptik NMDARs alt baş gerçekleştirmekle ve extrasynaptic NMDAR yoluyla sinyalleme yapan hiç ya da ERK1 / 2 aktivitesi 8,11 üzerinde inhibe edici bir etkiye sahiptir, oysa, NMDAR-aktivasyonu ile uyarılan gen sentezlenmesine katılan edilir kinaz.
Distal dendrit ve çekirdeği arasındaki transfer gösterilmiştir proteinler vardır. Bu proteinlerin çoğu bir nükleer lokalizasyon sinyali içerir ve aktif olarak çekirdeğe bir 6,9 ve dinein importin bağımlı bir şekilde, mikrotübülün boyunca taşınmaktadır. InterestinglY, belirli bir sinaptik uyarıcıya tepki olarak çekirdeğe Bu taşıyıcı maddelerin bazıları için yalnızca bir geçiş. Örneğin, siklik AMP tepki elemanı bağlayıcı protein 2 (CREB2) retrograd nakil aracı kimyasal LTD, fakat LTp 12 tarafından indüklenir. Lokalize NMDAR-bağımlı uyarma sinaptik uzun vadeli plastisite hipokampal 4 katılır çekirdeği, bir translokasyon süreç içine CREB düzenlenmiş kopyalayıcı ortak aktifleştirici (CRTC1) tahrik eder. Son zamanlarda protein haberci Jacob hem sonra nükleus, sinaptik ve extrasynaptic NMDAR aktivasyonu için translocates ve CREB'ye bağımlı gen transkripsiyonunu 5 düzenler olduğu gösterilmiştir. Sinyalinin sinaptik veya extrasynaptic kökenli Jacob bir sonrası modifikasyon kodlanmıştır. Sinaptik aktivitesi primer hipokampal kültürdeki çekirdeğe translokasyonu açısından daha sonra gerekli bir konumda olan 180 (pJacobS 180) açısından çok önemli bir serin bir Yakup'un ERK1 / 2 bağımlı fosforilasyonunu uyanr. Ayrıca, in CA1 Schaffer kollateral LTP sonra çekirdeğe akut hipokampal dilimlerin pJacobS 180 translocates nöronlar değil 1,10 LTD. pS180 Jacob plastisite ilişkili genlerin ifadesindeki artışa neden olur ve bu gen ekspresyon sinaptik fonksiyon geri beslenir. Extrasynaptic NMDARs aktivasyon Ser180 fosforilatlanır değildir ve neden çekirdekte farklı bir protein kompleksi ile ilişkili olabilir sonra çekirdeğe translocates tezat, Jacob 'CREB'ye kapatmak' ve sinaptik bağlantıları 10 bir geri çekilme.
Synapto-nükleer protein haberci nükleer ithalatına En yayınlanan çalışmalar, ayrışmış nöronal primer kültürlerinde yapılmıştır. Nöronal bağlantı ve fonksiyon çok daha iyi korunmuş olduğu, bu nedenle bu bulgular hipokampal dilimleri kullanarak fizyolojik daha uygun koşullar çoğaltılamaz görmek ilginç olacaktır. Burada LTP-de değerlendirmek için optimize edilmiş bir protokol mevcutimünoblotlama protein haberciler nükleer translokasyonunu pendent. Bu yöntem aynı zamanda bu basit bir nükleer fraksiyonda proteinin aktivitesine bağlı fosforilasyonunun analizi için uygundur. Özel olarak, mevcut protokolü akut, CA1, hipokampüse ait kesitler indüksiyonu ve LTP kayıt hazırlanmasını da kapsar. Sonraki CA1 bölgesi mikroskobik uyarılmış bölgeyi izole etmek için disseke edilir. Biz kombine ve Zhao ve arkadaşları 17 tarafından tanıtılan değişiklikler ile CellLytic nükleer Ekstraksiyon Kiti tarafından sağlanan nükleer izolasyonu için protokol değiştirilmiş. Optimize edilmiş prosedür, hücre şişmesi ve çekirdekler salımını sağlayan, hipotonik tampon maddesi içinde kesildi CA1 bölgelerin lızız ışlemını içermektedir. Hücre lizizi, ve çekirdekler morfolojisi mikroskopik inceleme ile tespit edilebilir. Nükleer zenginleştirme kısa bir santrifüjleme adımı ile elde edilir. Neun ve NSE2, nükleer veya sitosolik fraksiyonlar özel markörler, karşı antikorlar ile immunoblotting analizi bu yaklaşım hızlı bir şekilde kullanılabileceğini göstermektedirve tekrarlanabilir protokolü bu hücrealtı kesirler izole etmek ve protein fosforilasyonu gibi çok kararsız öteleme sonrası modifikasyonları çalışma. Buna ek olarak, bu yöntem, hipokampal dilimler kesilmiştir CA1 bölgelerinden kaynaklanan küçük bir doku numuneleri için avantajlıdır ve hipokampal dilimler immünohistokimya ile kombinasyon halinde de kullanılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Yetişkin sıçan beyninde gelen Akut Hipokampal Dilimleri hazırlanması 1.
- Izofluran ile sıçan anestezisi. DİKKAT: Kapalı bir exicator kullanarak prosedürü uygulayın, izofluran solumamanızı. Hayvan tamamen uyuşturulduktan emin olun.
- Hızlı, sıçan başını kesmek beyin izole ve precarbonated (% 95 O 2/5% CO2 gaz karışımı), buz soğukluğunda mM Gey çözeltisi içinde (bileşim bekletmektir: 130 NaCl, 4.9 KCl, 1.5 CaCl2 · 2H 2 O , 0.3 MgSO 4 · 2H 2, O, 11 MgCI2 · 6H 2, O, 0.23 KH 2 PO 4, 0.8, Na 2 HPO 4 · 7H 2, O, 5 Glükoz · H2O, 25 HEPES, 22 NaHCO3, pH 7.32) 30 dakika boyunca 1,2,10,16.
- Entorhinal korteks beyincik ve parçasını çıkarın. Daha sonra medial yüzeyi üzerinde her yarımkürede aşağı yerleştirin, bir mid-sagital kesim ile kortikal hemisferlerdir ayırın. Bundan sonra yapmakHer yarımkürede 13,14 dorsal kenarı boyunca 50-70 ° kesim (50-70 ° enine).
- Kesit sistemin dilimleme platformda taze kesilmiş yüzeyi ile her yarımkürede Tutkal. Platform precarbogenated buz soğuk Gey çözümü ile kaplanmış olmalıdır.
- Z-ekseni salınımı en aza indirmek için ayarlanmış bir vibratome kullanarak yan posterior anterior 350 mikron 50-70 ° enine dilim kesin. Hipokampal oluşumda, subiküler ve entorinal kortekste gibi hipokampusa Dorsolateral bulunan korteksleri deneyler 13,14 için kullanılan dilimlerin bir parçası olacaktır.
- U-şekli ve batırılmış tipte inkübatöre hipokampal dilimler aktarın ve carbogenated yapay serebrospinal akışkan (ACSF mM içeren 32 ° C'de en az 2 saat süreyle inkübe edin: 2H 2, O, 1,5 MgSO ^ · 110 NaCl, 2.5 KCl, 2.5 CaCl2 4 · 2H 2 O, 1.24 KH 2 PO 4, 10 Glukoz · H 2, O, 27.4 NaHCO 3, pH 7.3) 1,2,10,16.
2. Elektrotların Konumlandırma, Temel Kayıt ve LTP indüksiyonu
- Mikroskop altında monte edilmiş bir batırılmış tipte kayıt odasına hipokamp dilim aktarın. 32 ° C'de en az 30 dakika boyunca carbogenated ACSF (6-7 ml / dak) perfüze.
- (Uç direnci M? 3-5 olan) ACSF ile dolu cam kılcal Mikroelektronlar hazırlayın.
- Uyarımı ve fEPSP için CA1 stratum radiatum kayıt 1,2,10 (Şekil 2) CA1 Schaffer kollateral-liflerde ACSF ile dolu bir cam Mikroelektronlar yerleştirin. Elektrotlar arasındaki mesafe yaklaşık 300 um olmalıdır.
- 3-4 V arasındaki bir aralıkta iki fazlı dikdörtgen akım darbelerinin (200 ms / kutup) ile Schaffer kollateral liflerin-uyarılması ile alanını uyancı postsinaptik potansiyeller (fEPSPs) uyandırmak
- Inp ölçerek maksimum stimülasyon testi gerçekleştirinut-çıkış ilişkisi ve elde edilen maksimum fEPSP-eğim değerlerinin% 40 olarak uyarım gücünü tanımlamak ve deney boyunca sabit tutun.
- Maksimum uyarma testi sonra en az 15 dakika boyunca başlangıç kayıt başlayın. Deney boyunca her dakika uyaranlara test yanıtları ölçün. Düşük frekanslı stimülasyon ile bazal kayıtları gerçekleştirin.
- En az 30 dakika boyunca temel kaydedin.
- Geç-LTP indüksiyonu için yüksek frekansı 5 dk diziler arası aralık ile 100 Hz üç 1 sn uyaran trenler oluşan 100 Hz tetanization geçerlidir. CA1 bölgesinde 5 uM bicuculline içinde stimülasyon alanını artırmak için tetanization önce, 2 dakika ile yıkanabilir ve hemen geçen tetanization sonra yıkanmalıdır.
LTP ve Yapış Donma İndüksiyonunun sonra Dilimleri 3. Koleksiyonu
- Dur LTP 2 dakika ya da Geç-LTP uyaran tetanik stimülasyon üç trenlerin 30 dakika sonra kayıt.
- -80 ° C de, 1.5 ml tüp ve mağaza her dilim toplayın.
Hippocampus CA1 Bölgesi'nden Nükleer Zenginleştirilmiş Kesirler 4. İzolasyonu
- -80 ° C donmuş dilimleri, 1.5 ml'lik Eppendorf tüpleri çıkarın ve buz üzerinde tutun.
- Ekleme tüpüne taze soğuk TBS tampon çözeltisi ihtiva eden bir proteaz (PI) ve fosfataz (PS) inhibitörleri, 0.5 mi. 2-3 dakika inkübe ve stereomicroscope transfer. DİKKAT: koruyucu eldiven kullanın ve PI ve PS ile çalışırken bir laboratuvar önlüğü.
- Iki iğne kullanılarak hipokampusun CA1 stratum radiatumdan, pyramidale bölgesini ayır. Stereomikroskop ve CA1 alanı kesmek için ikinci bir iğne altında tutulması için bir dilim iğne kullanın.
- Disseke CA toplayın50 ul liziz tamponu ihtiva eden yeni bir 1.5 ml'lik bir tüp içine (her bir grup için) 5 kesitlerden 1 bölgeleri (mM olarak içeren hipotonik liziz tamponu 1x: 10 HEPES, 1.5 MgCl2, 10 KCI, PI ve PS ile pH 7.9). Bu malzeme miktarı 2-3 imünoblotlarının çalıştırmak için yeterli olacağını unutmayın.
- Aşağı dikkatli pipetleme up ve tarafından toplanan doku homojenize. 200 ul pipet kullanın. Hücre şişer izin vermek için 5-7 dakika boyunca buz üzerinde inkübe lizat.
- , Lizatının 2 ul alır mikroskobik bir slayt üzerinde açılan ve parlak bir alan mikroskobu altında hücrelerin şişmesine görselleştirmek. Hücrelerin doğru şişmesi ile çekirdekler gibi yuvarlak sağlam yapıları görünür.
- 'Homojenat fraksiyon "olarak yeni bir 1.5 ml'lik bir tüp içine 20 ul numune toplayın. 4 x SDS numune tamponu denatüre 8 ul ilave edin.
- 1 dakika boyunca 11,000 rpm'de santrifüje kalan lizatları.
- Dikkatle, tr üst ('Sitosolik kısım, M') 'süpernatan toplamakansfer yeni bir tüpe ve 4x numune tamponu 20 ul ekle.
- , Hipotonik tampon maddesi, 60 ul pelletini ve 4x numune tamponu 20 ul ekle. Bu fraksiyon bir nükleer bakımından zengin kısım "olarak adlandırılır.
- Homojenat, sitosolik, nükleer veya zenginleştirilmiş kısımlar, daha sonra -80 ° C bağışıklık boyama için -20 ° C'de saklanabilir.
Synapto nükleer proteinlerin yarı kantitatif 5. Bağışıklık
- Örnekleri Defreeze ve 95 ° C'de 5 dakika boyunca kaynatın.
- Her parçadan 5 ul alın ve amido siyah testi veya BCA testi ile protein konsantrasyonu belirlemek.
- SDS-PAGE üzerinde homojenattan protein örneklerinin eşit miktarda, sitoplazmik ve nükleer zenginleştirilmiş kısımlar yükleyin. Ve kontrol LTP kesitlerden örnekler doğrudan bir karşılaştırma için, aynı jel üzerine yerleştirilmelidir.
- Standart Batı-kurutma işlemini gerçekleştirin (ıslak transferi önerilir).
- T membranlar Probeo seçenek antikor. Nörona özgü enolase2 (NSE2) ve nükleer işaretleyici - - Neun bir yükleme kontrolü olarak bir p-aktin antikor daha sonra aynı blotlar (veya aynı anda paralel ölçüm), sitoplazmik bir işaretleyici ile problanabilir.
6. Veri Analizi
- LTP indüksiyon Verimliliği Clampfit yazılım ile analiz edilebilir. Bazal kayıtların ortalama eğim tetanization sonra yamaçları iki yönlü ANOVA, p kullanılması ile karşılaştırıldığında <0.05 anlamlı farklılık olarak kabul edildi. FEPSP eğim değerleri ortalama ± SEM olarak şemalarda tasvir edildi
- Immunoblotların ölçümü için, bir film ya da otoradyografik tarar ve bir Licor sistemi ile ImageJ veya flüoresan gruplar tarafından protein bantlarının yoğunluğu analiz entegre. Immunorekatif bantlar Değerleri yükleme ve kurutma kontrolü için normalize edilmelidir. Kontrolü karşılaştırması ve LTP gruplar için nonparametrical Mann-Whitney U-Testi kullanılmış olabilir.
| Tamponun Adı | Reaktif | Konsantrasyon (mM) | Tutar | Yorumlar / Açıklama |
| Gey çözeltisi (pH: ~ 7.4 7.3) | NaCl | 130 | 7.6 gr | steril filtrasyon |
| 1000 mi | KCl | 4.9 | 0.37 gr | |
| CaCl2 · 2H 2 O | 1.5 | 0.22 gr | ||
| MgSO 4 · 2H 2 O | 0.3 | 0.0739 g | ||
| MgCI2 · 6H 2 O | 11 | 2.24 g | ||
| KH 2 PO 4 | 0.23 | 0.0313 g | ||
| Na 2 HPO 4 · 7H 2 O | 0.8 | 0,2145 g | ||
| Glukoz · H2O | 5 | 0,9909 g | ||
| Hepes | 25 | 5.96 gr | ||
| NaHCO3 | 22 | 1.85 g | ||
| ACSF (pH: ~ 7.4 7.3) | NaCl | 110 | 6.428 g | steril filtrasyon |
| 1000 mi | KCl | 2.5 | 0,1865 g | |
| CaCl2 · 2H 2 O | 2.5 | 0.368 g | ||
| MgSO 4 · 2H 2 O | 1.5 | 0.370 g | ||
| KH 2 PO 4 | 1.24 | 0.169 gr | ||
| Glukoz · H2O | 10 | 1,9817 g | ||
| NaHCO3 | 27.4 | 2,3 g | ||
| 1x Hipotonik tamponu (pH: 7.9) | Hepes | 10 | 0.23 g | |
| 100 mi | MgCI2 · 6H 2 O | 1.5 | 0.0304 g | |
| KCl | 10 | 0,07455 g |
Tablo 1. Tamponlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Daha önce synapto-nükleer protein haberci Jacob LTP indüksiyonu değil, LTD 1 Aşağıdaki çekirdekte birikmektedir göstermiştir. Ayrıca, sinaptik stimülasyonu sonrası Yakup'un translokasyon Ser180 (Şekil 1) MAPK ERK1 / 2 aktivasyonunu ve Yakup'un fosforilasyonu gerektirir. Fosforile edilmiş Jacob bir importin bağımlı bir şekilde çekirdeğe doğru yer değiştirir ve fosforile durum 15 αinternexin ara filaman ile birlikte (Şekil 1) uzun süreler boyunca muhafaza edilebilir. Jacob, fosfo-durum aktivite bağımlı gen ve hücre canlılığının ifadesi için önemlidir. İlginç bir şekilde, extrasynaptic NMDARs aktivasyonu da çekirdeğin içine Jacob sürücüler ancak bu durumda Jacob Ser180 Fosforile değildir ve nükleer birikimi CREB indükleyen 5,10 'kapatma'. Yukarıda açıklanan sonuçlar elde edilmiştir ProtocoBizim son çalışmada kurulan ls (bakınız Karpova ve ark. 10 modelinin ayrıntılı bilgi için).
Jacob LTP indüksiyonu sonrasında çekirdek içine kanıtlamak için, (Şekil 2 ve 3). Kaynaklı akut ve hipokampal dilimlerde Schaffer kollateral fEPSP potensiyasyonun uyarılmasını ölçülür ve daha sonra CA1 nöronlarının nöronal çekirdek izole Bu yüksek frekanslı uyarım uygulama (2 dakika ve 30 dakika sonra), iki farklı zaman noktasına göre ve daha sonra nükleer izolasyon ve Batı lekeleme için işlenmiştir her kesiti için, LTP * nin yüklenmesini kaydedildi (Şekil 2 ve 3). Sitosolik işaretleyici nörona özgü enolase2 (NSE) lize c santrifüj işlemi sonrasında elde edilen yüzer tabaka fraksiyonunda daha çok mevcut ise nöronal nükleer belirteç Neun zenginleştirilmesi, kesilmiş CA1 bölgesinde hazırlanan nükleer bakımından zengin kısım görülebilirarşın (Şekil 4A). (Bilgilerini Karpova ve arkadaşları için bkz. 10) pS180 Jacob antikorun özelliği, daha önce karakterize edilmiştir. pS180 Jacob düzeyleri total CA1 protein homojenatlarda ve tetanization (Şekil 4B) sonra nükleer zenginleştirilmiş fraksiyon 2 dakika içinde değişmeden kaldı, ama biz Jacob teyit, 30 dakika LTP (Şekil 4C) indüksiyon sonrası pJacobS 180 imünoreaktiviteye önemli bir artış bulundu Bu hücresel plastisite modelinde çekirdek translokasyonunu Ser180 fosforilatlandığında.
Jacob S180 fosforile Şekil 1. NMDARs sinyallerinin sinaptik kaynağını kodlar. Hipokamp Schaffer kollateral elyaflar sonuç Tetanik uyarılması sinaptik NMDARs ve MAPK'nın sonraki aktivasyonu aktivasyonundaERK1 / 2 kaskad sinyalizasyon. Aktif ERK1 / 2 bağlanan ve serin 180 Jacob fosforilleyen ve Jacob-ERK1 / 2 kompleksi çekirdeğe doğru yer değiştirir ve bu geliştirilmiş CREB aktivite ve plastikliği ilgili gen ifadesi aktivasyonu ile ilişkilidir.
Şekil 2. aletler ve LTP indüksiyonu için kullanılan ve hipokampal gelen CA1 bölgeyi diseksiyon. 3 - mikromanipulatöre perfüzyon sistemi, 4 - Yeniden Kodlama elektrot, 5 - uyarılması elektrot, 6 - Su objektif lens - Vibratome) B1-2) Elektrofizyoloji ve görüntüleme kurulumu (2 - Mikroskop A), akut Vibratome hipokampal dilimler (1 'in hazırlanması için kullanılan , 7 - hipokampal dilim dilim tutucu) C) hipokampal dilimlerde CA1 bölgesinde diseksiyonu için kullanılan ekipmanlar (8. Stereomicroscope; 9 - iğnelerle İnsülin şırınga; 10 - Küçük cerrahi makas; 11 - Neşter; 12 - Plastik Pasteur pipeti; 13 - İnce spatula; dilimleri diseksiyonu için kullanılan buz-su ile dolu 14-100 mm plastik kültür çanak ve 40 mm plastik kültür çanak.
Şekil 3. Karikatür deneysel prosedürünü gösteren. Numaraları protokolde adımlarını gösterir. 2,1-2,8) Schaffer kollateral-CA1 sinapslar potansiyasyonu için stratum radiatum yerleştirilen cam elektrodlar ile batık odasında bir akut hipokampal dilim. Içerlek yatay çubuk 5 msn'den gösterir ve dikey çubuk 0.5 mV gösterir, örnek fEPSP analog izlerini temsil eder. 3.3) • Dilimler sonra 1.5 ml tüpler içinde toplandıLTP kayıt ve donduruldu. 4.3) yetişkin sıçan hipokampal dilimlerde CA1 bölgesinde diseksiyonu. 4.4-4.5) CA1 bölgeleri hücreleri ve çekirdekleri serbest ozmotik şişmesine neden olur hipotonik lizis tamponu, içinde homojenize. 1 dakika boyunca 11,000 rpm'de lizatlarının 4.8) Santrifüj. Bağışıklık boyama için sitoplazmik ve nükleer zengin fraksiyonların 4.10) toplanması. SDS-PAGE ve daha sonra standart Batı-lekeleme ile sitoplazmik ve nükleer zengin fraksiyonlar, 5.3) Yükleme.
CA1 LTP indüksiyonu Şekil 4. çekirdekte pJacS180 birikimine yol açar. Indu sonra sitosolik, nükleer işaretleri b.) Homojenat, 2 dakika içinde pJac-S180 seviyesinin bağışıklık beneklenme analizi, ve 30 dakika süre ile problanmış homojenatı, sitosolik ve CA1 lizatının nükleer zenginleştirilmiş fraksiyon için A), bağışıklık beneklenmetetanization. C'nin ölü m) tetanization sonra nükleer zenginleştirilmiş fraksiyon, 2 dakika ile dk pJacS180 seviyesinin bağışıklık beneklenme analizi. Bu sonuçlar, 10 Karpova et al yayınlanan ölçüm grafiğinin bir parçasıdır. Bu temsili bağışıklık lekeleriyle daha özgün yayını dahil değildir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Yukarıdaki protokolün açıklanan adımlar, hipokampus akut genç ya da yetişkin farelerin dilimlenmiş hazırlamak dilim uyarılmış alanı neden ve kayıt LTP, hızla teşrih ve aktivite bağımlı protein dinamikleri incelemek için nükleer zenginleştirilmiş kısmını hazırlamak için nasıl rehberlik sağlamak. Bu yaklaşım, her biri birbirinden bağımsız bir şekilde kullanılan birçok farklı yöntemlerin kombinasyonu kaynaklanmaktadır. Biz bir iş akışını optimize edilmiş ve LTP indüksiyonu üzerine proteinlerin hücre içi yeniden dağıtılması incelemek için kendi deneylerini kurmak yeni başlayanlar için yeterli ayrıntı sağlar. Bir örnek olarak LTP geç bir şekilde S 180 nükleer birikimi Jacob fosforile uyardığını göstermektedir. Bir proteinin, önceden varolan bir çekirdek havuzunun fosforilasyonu ve sinaptik etkinlik sonra fosforile edilmiş formu translokasyon arasında ayrım yapmak için, bu yaklaşım, nükleer bakımından zengin kısım, ilgi duyulan proteini toplam seviyesi için kontrol ile kombine edilebilir. Ayrıca, testiLTP indüksiyonu sonra farklı zaman noktalarında numuneler üzerinde ng protein aktivasyonu / inaktivasyonu veya nükleer devir hızı zaman süresini üzerinde çalışmak için çok anlaşılır olabilir.
Uyarılan dilimlerden nükleer zenginleştirilmiş fraksiyonların hazırlanması sırasında ele alınması gereken birkaç metodolojik sorunları vardır. İlk olarak, CA1 bölgesindeki uyarılmış nöron sayısı ve bağışıklık boyama için malzeme miktarını arttırmak için, biz tetanization sırasında GABAa reseptör tıkayıcı biccuculine 5 uM uygulanır. Uyancı postsinaptik potansiyeller Biccuculine 3 arttırmak için gösterilmiştir.
Dilimleri mekanik taşıma doğrudan proteinin değişiklikler değişiklikleri ile ilişkilendirilmesi faaliyetlerinin farklı neden olabilir çünkü İkincisi, hızlı dondurulması ile LTP indüksiyonu sonrası dilim korunması başarılı deneyler için kritik bir adımdır. Mümkün olduğu kadar prosedür kısaltmak için, kuru buz üzerine yerleştirilmiş bir metal çubuk kullanılır. Dilims plastik Pasteur pipet kullanarak ACSF bir damla transfer edilebilir ve önceden soğutulmuş metal üzerine konulduğunda çok az saniye içinde donmuş.
Üçüncü önemli adım CA1 lisatlardaki çekirdeklerin zenginleştirme olduğunu. Biz mikroskop altında şişme hücre izlemek ve en uygun zaman noktasını bulmak için tavsiye. Doku homojenizasyon düzgün yapılmazsa Bazen, hücre enkaz hala örneklerinde kalır. Ardından çekirdek topağı bir kaç dakika için yıkanmış, tekrar lisis tamponu içinde yeniden süspansiyon haline getirilmiş ve daha sonra, daha saf bir nükleer kısmını almak için santrifüj edilebilir.
Genel olarak bu protokol daha sinaptik plastisite farklı synapto nükleer haberci proteinlerin rolünü explorer yardımcı olabilir. Aynı prosedür uygulanabilir değil sadece yüksek frekanslı stimülasyon kaynaklı LTP ama LTD, teta-patlama LTP, kısa vadeli plastisite modelleri, ve diğerleri gibi sinaptik plastisite tüm diğer formları.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| CED 1401 AD/DA converter | Cambridge Electronics Design, UK | ||
| Stereomicroscope | Leica S4E, Germany | ||
| Vibrotome | Leica VT1000S, Germany | ||
| Isolated pulse stimulator | A-M Systems, USA | Model 2100 | |
| Centrifuge | Thermo Scientific | ||
| SDS-PAGE system | Biorad | ||
| Cooler | Julabo | ||
| Bright field Microscope | Nikon Eclipse TS100 | ||
| Cell culture incubator | Thermo Electron Corporation | ||
| Micromanipulator | Luigs & Neumann, SM-5, Germany | ||
| Blotting chamber and electric power supplier | Hoefer Scientific Instruments, San Francisco, CA | ||
| Submerged type recording chamber | custom made | ||
| U-shape and submerged type incubator | custom made | ||
| Small surgical scissors | |||
| Scalpel | |||
| Thin spatula | |||
| Plastic Pasteur pipette | |||
| Plastic culture dish | |||
| Bunsen beaker | |||
| Syringe | |||
| Reagents | |||
| NaCl | Roth | Art.-Nr.3957.1 | ≥99.5%, p.a., ACS, ISO |
| KCl | Roth | Art.-Nr.6781.1 | ≥99.5%, p.a., ACS, ISO |
| CaCl2·2H2O | Merck | 1.02382.0500 | pro analysis |
| MgSO4·2H2O | Merck | 5886.05 | pro analysis |
| MgCl2·6H2O | AppliChem | CAS-NO: 7791-18-6; EC-NO:2320946 | for molecular biology |
| KH2PO4 | Merck | 12034.025 | for molecular biology |
| Na2HPO4·2H2O | Merck | 1.06574.1000 | extra pure |
| Glucose·H2O | Roth | Art.-Nr.6887.1 | for molecular biology |
| HEPES | Roth | Art.-Nr.9105.4 | PUFFERAN, ≥99.5%, p.a. |
| NaHCO3 | Merck | 1.06329.1000 | pro analysis |
| Protease inhibitor cocktail | Roche | ||
| Phosphostop | Roche | ||
| Bicuculline | Tocris Bioscience | ||
| Isoflurane | Baxter | ||
| Antibodies | |||
| Primary antibodies | Company | Catalog Number | Species |
| pJac-s180 | Biogenes | rabbit (diluted 1:100) | |
| NeuN | Milipore | MAB377 | mouse (diluted 1:1,000) |
| NSE | Cell Signaling | D20H2 | rabbit (diluted 1:1,000) |
| Beta-actin | Sigma | A-5441 | mouse (diluted 1:5,000) |
| Secondary antibodies | Company | Catalog Number | Species |
| IgG HRP conjugated | DAKO | goat anti-mouse (1:5,000) | |
| IgG HRP conjugated | NEB | goat anti-rabbit (1:5,000) | |
References
- Behnisch, T., et al. Nuclear translocation of Jacob in hippocampal neurons after stimuli inducing long-term potentiation but not long-term depression. PLoS One. 6 (2), e17276 (2011).
- Cai, F., Frey, J. U., Sanna, P. P., Behnisch, T. Protein degradation by the proteasome is required for synaptic tagging and the heterosynaptic stabilization of hippocampal late-phase long-term potentiation. Neuroscience. 169 (4), 1520-1526 (2010).
- Chapman, C. A., Perez, Y., Lacaille, J. C. Effects of GABA(A) inhibition on the expression of long-term potentiation in CA1 pyramidal cells are dependent on tetanization parameters. Hippocampus. 8 (3), 289-298 (1998).
- Ch'ng, T. H., Uzgil, B., Lin, P., Avliyakulov, N. K., O'Dell, T. J., Martin, K. C. Activity-dependent transport of the transcriptional coactivator CRTC1 from synapse to nucleus. Cell. 150 (1), 207-221 (2012).
- Dieterich, D. C., et al. Caldendrin-Jacob: a protein liaison that couples NMDA receptor signalling to the nucleus. PLoS Biol. 6 (2), e34 (2008).
- Fainzilber, M., Budnik, V., Segal, R. A., Kreutz, M. R. From synapse to nucleus and back again--communication over distance within neurons. J. Neurosci. 31 (45), 16045-16048 (2011).
- Hardingham, G. E., Bading, H. Synaptic versus extrasynaptic NMDA receptor signalling: implications for neurodegenerative disorders. Nat. Rev. Neurosci. 11 (10), 682-696 (2010).
- Ivanov, A., et al. Opposing role of synaptic and extrasynaptic NMDA receptors in regulation of the extracellular signal-regulated kinases (ERK) activity in cultured rat hippocampal neurons. J. Physiol. 57, 789-798 (2006).
- Jordan, B. A., Kreutz, M. R. Nucleocytoplasmic protein shuttling: the direct route in synapse-to-nucleus signaling. Trends Neurosci. 32 (7), 392-401 (2009).
- Karpova, A., et al. Encoding and transducing the synaptic or extrasynaptic origin of NMDA receptor signals to the nucleus. Cell. 152 (5), 1119-1133 (2013).
- Kim, M. J., Dunah, A. W., Wang, Y. T., Sheng, M. Differential roles of NR2A- and NR2B-containing NMDA receptors in Ras-ERK signaling and AMPA receptor trafficking. Neuron. 46, 745-760 (2005).
- Lai, K. O., Zhao, Y., Ch'ng, T. H., Martin, K. C. Importin-mediated retrograde transport of CREB2 from distal processes to the nucleus in neurons. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105 (44), 17175-17180 (2008).
- Leutgeb, J. K., Frey, J. U., Behnisch, T. LTP in cultured hippocampal-entorhinal cortex slices from young adult (P25-30) rats. J. Neurosci. Methods. 130 (1), 19-32 (2003).
- Leutgeb, J. K., Frey, J. U., Behnisch, T. Single cell analysis of activity-dependent cyclic AMP-responsive element-binding protein phosphorylation during long-lasting long-term potentiation in area CA1 of mature rat hippocampal-organotypic cultures. Neuroscience. 131 (3), 601-610 (2005).
- Perlson, E., Hanz, S., Ben-Yaakov, K., Segal-Ruder, Y., Seger, R., Fainzilber, M. Vimentin-dependent spatial translocation of an activated MAP kinase in injured nerve. Neuron. 45 (5), 715-726 (2005).
- Xiang, Z., et al. Long-term maintenance of mature hippocampal slices in vitro. J. Neurosci. Methods. 98 (2), 145-154 (2000).
- Zhao, M., Adams, J. P., Dudek, S. M. Pattern-dependent role of NMDA receptors in actin potential generation: consequences on extracellular signal-regulated kinase activation. J. Neurosci. 25 (30), 7032-7039 (2005).
