Summary
אנו מספקים פרוטוקול מפורט לאינדוקציה של הגברה לטווח ארוך באזור CA1 של ההיפוקמפוס והבידוד הבא של שברים מועשרים גרעיניים מאזור tetanized של הפרוסה. גישה זו יכולה לשמש כדי לקבוע פעילות יבוא חלבון גרעיני תלוי בדגמים סלולריים של למידה וזיכרון.
Abstract
ביטוי לומד פעילות חלבון תלוי, טרנסלוקציה subcellular, או זירחון הוא חיוני כדי להבין את המנגנונים תאיים הבסיסיים של פלסטיות הסינפטית. הגברה לטווח ארוך (LTP) ודיכאון לטווח ארוך (בע"מ) מושרה בפרוסות בהיפוקמפוס חריפות מקובלים מאוד כמודלים תאיים של למידה וזיכרון. ישנם מספר רב של מחקרים המשתמשים בגישות הדמיה תא או אימונוהיסטוכימיה חיות לדמיין דינמיקת חלבון תלויה פעילות. עם זאת שיטות אלו מסתמכות על התאמתו של נוגדנים לimmunocytochemistry או ביטוי יתר של חלבונים מתויגים הקרינה בתאי עצב בודד. Immunoblotting של חלבונים הוא שיטה חלופית המספקת אישור עצמאי של הממצאים. הגורם המגביל הראשון בהכנה של שברים subcellular מפרוסות בהיפוקמפוס tetanized פרט הוא הכמות הנמוכה של חומר. שני, הליך הטיפול הוא קריטי משום שמניפולציות גם מאוד קצרות וקלות של ליטרiving פרוסות עלולה לגרום להפעלה של מפלי איתות מסוימים. כאן אנו מתארים את זרימת עבודה מותאמת על מנת להשיג כמות מספקת של שבריר מועשר הגרעיני של טוהר מספיק מאזור CA1 של פרוסות בהיפוקמפוס חריפות ממוח חולדה. כדוגמא מייצגת אנו מראים כי צורת ERK1 / 2 פוספורילציה של שליח חלבון synapto-גרעיני יעקב באופן פעיל translocates לגרעין על אינדוקציה של LTP וניתן לאתרם בשבריר מועשר גרעיני מתאי עצב CA1.
Introduction
Synaptic N-methyl-D-aspartate-קולטנים (NMDARs) לשחק תפקיד מכריע בפלסטיות הסינפטית והישרדות תא האיתות ואילו הפעלה של NMDARs extrasynaptic יכולים לגרום ניוון מוחיים ומוות של תאים. שינויים אלה תלויים בביטוי גנים תלויים / פעילות מוסדרת לפיקוח הדוק ולכן דורשים תקשורת מתמדת בין הסינפסות מופעלות או דנדריטים והגרעין 7. MAP קינאזות ERK1 / 2 הם effectors במורד הזרם של NMDARs הסינפטי איתות ומעורבות בביטוי גנים הנגרם על ידי NMDAR-הפעלה, ואילו איתות באמצעות NMDAR extrasynaptic יש השפעה מעכבת על ERK1 / 2 פעילות 8,11 לא או.
ישנם מספר החלבונים שהוכחו הסעות בין דנדריטים דיסטלי והגרעין. רבים מחלבונים אלו מכילים אות לוקליזציה גרעינית ומועברים באופן פעיל לאורך microtubuli בdynein ואופן importin תלוי לגרעין 6,9. Interestingly, כמה מהשליחים אלה מעבר רק לגרעין בתגובה לגירויים הסינפטי ספציפיים. לדוגמא, תחבורה מדרדר של אלמנט המחזורי AMP תגובה מחייב חלבון 2 (CREB2) היא מושרה על ידי בע"מ הכימי אך לא 12 LTP. גירוי הסינפטי NMDAR תלוי מקומי מניע coactivator מוסדר CREB תעתיק (CRTC1) לתוך הגרעין, תהליך טרנסלוקציה, העוסק בפלסטיות בהיפוקמפוס לטווח ארוך 4. זה היה הראה לאחרונה כי שליח החלבון יעקב translocates לגרעין אחרי שניהם, הפעלת NMDAR הסינפטי וextrasynaptic ומסדיר שעתוק הגנים תלויים CREB 5. המקור הסינפטי או extrasynaptic של האות מקודד בשינוי posttranslational של יעקב. פעילות הסינפטית גורמת ERK1 / 2 זירחון התלוי של יעקב בסרין מכריע בעמדה 180 (pJacobS 180) שבו הוא נחוץ לטרנסלוקציה לאחר הגרעין בתרבות בהיפוקמפוס העיקרית. יתר על כן, אניn נוירונים CA1 של pJacobS פרוסות בהיפוקמפוס חריפה 180 translocates לגרעין לאחר LTP טחונות שפר אך לא בע"מ 1,10. pS180 יעקב מוביל לביטוי מוגבר של גנים הקשורים פלסטיות וביטוי גנים זה הזנות חזרה לתפקוד הסינפטי. בניגוד חד, יעקב שtranslocates לגרעין לאחר הפעלת NMDARs extrasynaptic לא phosphorylated בSer180 ועשויה להיות קשורה לחלבון מורכב שונה בגרעין גורמת ל'CREB לכבות "ונסיגה של קשרים סינפטיים 10.
מחקרים שפורסמו ביותר על היבוא הגרעיני של שליח חלבון synapto-גרעיני נעשו בתרבויות עיקריות עצביות ניתק. לכן זה יהיה מעניין לראות אם ניתן לשחזר בממצאים כאלה מבחינה פיזיולוגית יותר רלוונטי תנאי שימוש בפרוסות בהיפוקמפוס בי קישוריות ותפקוד עצביים הם הרבה יותר טוב נשמר. כאן אנו מציגים פרוטוקול מותאם להערכת LTP-deתלוי טרנסלוקציה הגרעינית של שליחי חלבון על ידי immunoblotting. שיטה זו מתאימה גם לניתוח זירחון התלוי פעילות של חלבונים בשבריר גרעיני גולמי. באופן ספציפי, את הפרוטוקול הנוכחי כרוך הכנת פרוסות חריפות בהיפוקמפוס CA1, אינדוקציה, והקלטה של LTP. בשלב הבא, אזור CA1 הוא גזור מיקרוסקופי כדי לבודד את האזור מגורה. שלבנו והותאמנו הפרוטוקול לבידוד גרעיני שסופק על ידי CellLytic גרעיני הפקת ערכה עם שינויים שהוכנסו על ידי זאו ועמיתים 17. הליך אופטימיזציה כולל תמוגה של אזורי CA1 גזורים במאגר hypotonic מאפשרת נפיחות תא ושחרור של גרעינים. תמוגה תא ומורפולוגיה גרעינים ניתן לקבוע על ידי בדיקה מיקרוסקופית. העשרה גרעינית מושגת על ידי צעד צנטריפוגה קצר. Immunoblotting ניתוח עם נוגדנים נגד NeuN וNSE2, סמנים ספציפיים של שברים גרעיניים או cytosolic, מצביע על כך שגישה זו יכולה לשמש כמהירהוהפרוטוקול לשחזור לבודד את השברים subcellular אלה וללמוד שינויי posttranslational מאוד יציבים כמו זרחון חלבון. בנוסף, בשיטה זו יש יתרון לדגימות רקמה קטנות הנובעות מאזורי CA1 גזורים של פרוסות בהיפוקמפוס וניתן להשתמש בו בשילוב לאימונוהיסטוכימיה של פרוסות בהיפוקמפוס.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
.1 הכנת אקוטית בהיפוקמפוס פרוסות ממוח חולדה למבוגרים
- הרדימי חולדות עם isoflurane. זהירות: בצע את ההליך באמצעות exicator סגור, לא לשאוף isoflurane. ודא כי בעל החיים הוא מורדמים לחלוטין.
- לערוף את העכברוש, במהירות לבודד את המוח, ולטבול אותו בprecarbonated (95% O 2/5% 2 תערובת גז CO) קר כקרח הפתרון של הגיי (הרכב במ"מ: 2H 2 O 130 NaCl, 4.9 KCl, 1.5 CaCl 2 · , 0.3 MgSO 4 · 2H 2 O, 11 MgCl 2 · 6 שעות 2 O, 0.23 KH 2 PO 4, 0.8 Na 2 HPO 4 · 7H 2 O, גלוקוז 5 · H 2 O, 25 HEPES, 22 NaHCO 3, pH 7.32) ל30 דקות 1,2,10,16.
- הסר את המוח הקטן וחלק של קליפת המוח entorhinal. הפרד את ההמיספרות בקליפת המוח עם חתך באמצע sagittal, ואז למקם את כל חצי הכדור על המשטח המדיאלי שלה. לאחר מכן להפוך את50-70 ° חתך (רוחבי 50-70 °) לאורך קצה הגב של אונה כל 13,14.
- הדבק כל חצי הכדור עם משטח שזה עתה נקצץ על פלטפורמת החיתוך של מערכת חתך. הפלטפורמה צריכה להיות מכוסה על ידי הפתרון של הגיי קר כקרח precarbogenated.
- חותך 350 מיקרומטר 50-70 ° פרוסות רוחביים מקדמיים לאחוריים צד באמצעות vibratome המותאם ללמזער תנודת ציר z. ההיווצרות בהיפוקמפוס, הקורטקס subicular וentorhinal, כמו גם את קליפת המוח שממוקם דורסולטרלי להיפוקמפוס תהיה חלק מהפרוסות המשמשות לניסויים 13,14.
- העבר את פרוסות בהיפוקמפוס לU-צורה וחממת סוג שקועה ודגירה של לפחות שעה 2 ב 32 מעלות צלזיוס עם מלאכותי נוזל השדרתי carbogenated (ACSF המכיל במ"מ: 110 NaCl, KCl 2.5, 2.5 CaCl 2 · 2H 2 O, 1.5 MgSO 4 · 2H 2 O, 1.24 KH 2 PO 4, 10 גלוקוז · H 2O, 27.4 3 NaHCO, pH 7.3) 1,2,10,16.
.2 מיקום של אלקטרודות, Baseline הקלטה, ואינדוקציה של LTP
- העבר את הפרוסה בהיפוקמפוס לתא הקלטת הסוג שקוע רכוב תחת מיקרוסקופ. Perfuse (6-7 מ"ל / דקה) עם ACSF carbogenated לפחות 30 דקות ב32 ° C.
- הכן microelectrodes נימי זכוכית מלא ACSF (התנגדות קצה היא 3-5 MΩ).
- הנח microelectrodes זכוכית מלא ACSF בסיבי CA1 שפר-בטוחות לגירוי ובradiatum שכבת CA1 לfEPSP הקלטת 1,2,10 (איור 2). המרחק בין האלקטרודות צריך להיות על 300 מיקרומטר.
- לעורר שדה פוטנציאלים מעוררים Postsynaptic (fEPSPs) על ידי גירוי של סיבי שפר-טחונות עם פולסים biphasic מלבניים הנוכחיים (200 אלפיות שני / קוטביות) בטווח של 3-4 V.
- בצע את בדיקת הגירוי המקסימלי על ידי מדידת inpמערכת יחסים וut-פלט להגדיר את כוח הגירוי כ40% מערכי fEPSP-שיפוע מרביים שהושגו ולשמור אותו קבוע לאורך כל הניסוי.
- בגין ההקלטה הבסיסית לפחות 15 דקות לאחר בדיקת הגירוי המקסימלי. מדוד את התגובות לגירויים לבדוק בכל דקה לאורך כל הניסוי. לבצע הקלטות תחילת המחקר עם גירוי בתדר נמוך.
- רשום את הבסיס לדקות לפחות 30.
- לזירוז המאוחר LTP להחיל בתדירות גבוהה 100 tetanization הרץ בהרכב של שלוש רכבות גירוי 1 שניות ב 100 הרץ עם מרווח intertrain 5 דקות. כדי להגדיל את השדה של גירוי בתוך אזור 5 bicuculline מיקרומטר CA1 ניתן לכבס ב2 דקות לפני tetanization ויש לשטוף מייד לאחר tetanization האחרון.
.3 אוסף של פרוסות לאחר האינדוקציה של LTP והקפאת ההצמדה
- Stop LTP הקלטת 2 דקות או 30 דקות אחרי שלוש רכבות של גירוי tetanic גרימה המאוחר LTP.
- אסוף כל פרוסה בצינור 1.5 מ"ל ולאחסן ב -80 מעלות צלזיוס.
.4 בידוד של שברים מועשרים גרעיניים מאזור CA1 של ההיפוקמפוס
- קח 1.5 צינורות מ"ל אפנדורף עם פרוסות קפואות מ-80 מעלות צלזיוס ולשמור אותם על קרח.
- הוסף 0.5 מ"ל של פרוטאז הטרי הקר TBS מאגר המכיל (PI) ומעכבי phosphatase (PS), לתוך הצינור. דגירה של 2-3 דק 'ולהעביר לסטראו. זהירות: כפפות מגן שימוש וחלוק מעבדה תוך כדי עבודה עם PI וPS.
- לנתח את אזור pyramidale שכבת CA1 של ההיפוקמפוס באמצעות שתי מחטים. השתמש במחט אחת להחזקת הפרוסה תחת סטראו והמחט השנייה לחיתוך אזור CA1.
- לאסוף את CA גזור1 אזורים מ5 פרוסות (לכל קבוצה) לתוך צינור 1.5 מ"ל חדש המכיל 50 מאגר תמוגה μl (1X חיץ hypotonic תמוגה מכיל מ"מ: 10 HEPES, 1.5 MgCl 2, 10 KCl, pH 7.9, עם PI וPS). שים לב שסכום זה של חומר יהיה מספיק כדי לרוץ 2-3 immunoblots.
- Homogenize רקמות שנאספו על ידי pipetting למעלה ולמטה זהירים. השתמש בפיפטה 200 μl. דגירה lysate על קרח למשך 5-7 דקות, כדי לאפשר לתאים להתנפח.
- קח 2 μl של lysate, לרדת בשקופית מיקרוסקופית, ולדמיין את הנפיחות של התאים תחת מיקרוסקופ שדה בהיר. עם נפיחות תקינה של תאי הגרעינים מופיעים כעגולים מבנים בשלמותה.
- לאסוף 20 μl של מדגם לתוך צינור 1.5 מ"ל טרי כמו "שבר homogenate '. הוסף 8 μl של denaturing חיץ מדגם SDS 4x.
- צנטריפוגה lysates שנותר ב11,000 סל"ד במשך דקות 1.
- לאסוף את supernatant בזהירות מהחלק העליון ("חלק cytosolic '), TRansfer לתוך צינור חדש ולהוסיף 20 μl של חיץ מדגם 4x.
- Resuspend גלולה ב60 μl של חיץ hypotonic ולהוסיף 20 μl של חיץ מדגם 4x. חלק זה נקרא "חלק גרעיני מועשר".
- Homogenate, cytosolic, ושברים מועשרים גרעיניים יכולים להיות מאוחסנים ב-20 מעלות צלזיוס או -80 מעלות צלזיוס במשך immunoblotting מאוחר יותר.
.5 Immunoblotting Semiquantitative לחלבוני synapto-גרעיניים
- Defreeze הדגימות ולהרתיח אותם במשך 5 דקות ב95 מעלות צלזיוס.
- קח 5 μl כל חלק מן ולקבוע את ריכוז החלבון על ידי amido מבחן שחור או מבחן BCA.
- לטעון כמות שווה של דגימות חלבון מhomogenate, שברים מועשרים cytoplasmic והגרעיניים על SDS-PAGE. דוגמאות משליטה ופרוסות LTP צריכים להיות ממוקמות באותו ג'ל להשוואה ישירה.
- לבצע הליך סופג מערבי סטנדרטי (העברה רטובה מומלצת).
- לחקור את הקרומים עם t הוא הנוגדנים של בחירה. בהמשך לכך באותו כתמים (או אותו דגימות להריץ במקביל) יכולים להיות נחקרים עם הסמן cytoplasmic - enolase2 נוירון ספציפי (NSE2) וסמן גרעיני - NeuN ונוגדן -actin כביקורת טעינה.
ניתוח .6 נתונים
- יעילות של האינדוקציה LTP יכולה להיות מנותחת על ידי תוכנת Clampfit. השיפוע הממוצע של הקלטות תחילת המחקר היה בהשוואה למדרונות לאחר tetanization באמצעות דו כיוונית ANOVA, p <0.05 נחשבו שונים באופן משמעותי. ערכי מדרון fEPSP תוארו בתרשימים כממוצע ± SEM
- לכימות של immunoblots, לסרוק או סרט autoradiographic ולנתח את הצפיפות המשולבת של להקות חלבון על ידי ImageJ או להקות הקרינה עם מערכת Licor. ערכים של להקות immunoreactive צריכים להיות מנורמלים לטעינה מלאה וסופג. לשם השוואה של השליטה וקבוצות LTP עשוי לשמש Mann-Whitney U-מבחן nonparametrical.
| שם של החיץ | מגיב | ריכוז (מ"מ) | הסכום | תגובות / תיאור |
| הפתרון (pH: 7.3 ~ 7.4) של הגיי | NaCl | 130 | 7.6 גרם | סינון סטרילי |
| 1,000 מ"ל | KCl | 4.9 | 0.37 גרם | |
| CaCl 2 · 2H 2 O | 1.5 | 0.22 גרם | ||
| 4 MgSO · 2H 2 O | 0.3 | .0739 גרם | ||
| MgCl 2 · 6 שעות 2 O | 11 | 2.24 גרם | ||
| KH 2 PO 4 | 0.23 | .0313 גרם | ||
| Na 2 HPO 4 · 7H 2 O | 0.8 | .2145 גרם | ||
| גלוקוז · H 2 O | 5 | .9909 גרם | ||
| HEPES | 25 | 5.96 גרם | ||
| NaHCO 3 | 22 | 1.85 גרם | ||
| ACSF (pH: 7.3 ~ 7.4) | NaCl | 110 | 6.428 גרם | סינון סטרילי |
| 1,000 מ"ל | KCl | 2.5 | .1865 גרם | |
| CaCl 2 · 2H 2 O | 2.5 | 0.368 גרם | ||
| 4 MgSO · 2H 2 O | 1.5 | 0.370 גרם | ||
| KH 2 PO 4 | 1.24 | 0.169 גרם | ||
| גלוקוז · H 2 O | 10 | 1.9817 גרם | ||
| NaHCO 3 | 27.4 | 2.3 גרם | ||
| 1x hypotonic חיץ (pH: 7.9) | HEPES | 10 | 0.23 גרם | |
| 100 מ"ל | MgCl 2 · 6 שעות 2 O | 1.5 | .0304 גרם | |
| KCl | 10 | .07455 גרם |
טבלה 1 חוצצים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
יש לנו הראינו בעבר כי שליח חלבון synapto-גרעיני יעקב מצטבר בגרעין בעקבות האינדוקציה של LTP אבל לא 1 בע"מ. יתר על כן, טרנסלוקציה של יעקב לאחר גירוי הסינפטי דורשת הפעלה של MAPK ERK1 / 2 וזירחון של יעקב בSer180 (איור 1). פוספורילציה יעקב translocates לגרעין באופן importin תלוי ומדינת פוספורילציה יכולה להישמר על פני תקופות זמן ארוכות על ידי עמותה עם נימה ביניים αinternexin 15 (איור 1). Phospho מדינתו של יעקב היא חשובה לביטוי של גני פעילות תלויה והישרדות תא. מעניין, הפעלה של NMDARs extrasynaptic גם מניעה יעקב לתוך הגרעין אבל במקרה הזה יעקב הוא לא פוספורילציה בSer180 והצטברות הגרעין שלה גורמת CREB 'כבה' 5,10. התוצאות שתוארו לעיל התקבלו על ידי protocols הוקם במחקר שנערך לאחרונה שלנו (ראה Karpova et al. 10 לתיאור מפורט של המודל).
כדי להוכיח שיעקב translocates לתוך הגרעין לאחר האינדוקציה של LTP, אנחנו מושרה ומדדנו את האינדוקציה של הגברת fEPSP טחונות שפר בפרוסות בהיפוקמפוס חריפה ולאחר מכן מבודדים גרעינים עצביים מתא עצב CA1 (איורים 2 ו -3). אנחנו לעומת שתי נקודות זמן שונות לאחר יישום של גירוי בתדר גבוה (2 דק 'ו30 דקות) ורשמתי הגיוס של LTP לכל פרוסה שהיה מעובד לאחר מכן לבידוד גרעיני וסופגים מערביים (איורים 2 ו -3). העשרה של הסמן גרעיני העצבי NeuN שניתן לראות בחלק הגרעיני המועשר הוכן מאזור CA1 גזור, ואילו enolase2 הספציפי נוירון סמן cytosolic (NSE) הוא בעיקר נוכח בשבריר supernatant מתקבל לאחר צנטריפוגה של ג lysedאמות (איור 4 א). את הספציפיות של נוגדן pS180 יעקב התאפיינו בעבר (לפרטים ראו אל Karpova et. 10). רמות pS180 יעקב נשארו ללא שינוי בסך הכל homogenates חלבון CA1 ובחלק 2 דקות הגרעיניות מועשרים לאחר tetanization (איור 4), אבל מצאנו עלייה משמעותית בimmunoreactivity pJacobS 180 30 דקות אחרי הגיוס של LTP (איור 4C), המאשר כי יעקב translocating לגרעין במודל פלסטיות סלולארי זה פוספורילציה בSer180.
איור 1 יעקב phosphorylated בS180 מקודד את המקור הסינפטי של אותות NMDARs. גירוי Tetanic של תוצאות סיבי טחונות שפר בהיפוקמפוס בהפעלה של NMDARs הסינפטי וההפעלה הבאה של MAPKERK1 / 2 מפל איתות. ERK1 Activated / 2 נקשר ולphosphorylates יעקב בסרין 180 ומורכב יעקב-ERK1 / 2 translocates לגרעין וזה בקורלציה עם פעילות CREB משופרת והפעלה של ביטוי הפלסטי הקשורות גן.
איור 2 ציוד וכלים המשמשים לזירוז LTP ולנתח אזור CA1 מפרוסות בהיפוקמפוס. ) Vibratome המשמש להכנת פרוסות בהיפוקמפוס החריפה (1 - Vibratome) B1-2) אלקטרופיזיולוגיה והתקנת הדמיה (2 - מיקרוסקופ; - מערכת זלוף Micromanipulator ו3; 4 - אלקטרודה קידוד מחדש; 5 - אלקטרודה גירוי; 6 - עדשה אובייקטיבית מים ; 7 - בעל Slice עם פרוס בהיפוקמפוס) C) ציוד המשמש לנתיחה של אזור CA1 מפרוסות בהיפוקמפוס (8 Stereomicroscope; 9 - מזרק אינסולין עם מחטים; 10 - מספריים קטנים כירורגית; 11 - אזמל; 12 - פיפטה פסטר פלסטיק; 13 - מרית דקה; צלחת 14-100 מ"מ תרבות פלסטיק מלא בקרח מים, וצלחת תרבות פלסטיק 40 מ"מ המשמשת לנתיחה של פרוסות.
איור 3 Cartoon מפגין ההליך ניסיוני. מספרים מצביעים על שלבים בפרוטוקול. 2.1-2.8) פרוס בהיפוקמפוס חריפה בתא מתחת למים עם אלקטרודות זכוכית להציב בradiatum השכבה להגברה של סינפסות בטחונות-CA1 שפר. הבלעה מייצגת את העקבות אנלוגיות fEPSP המדגם, הפס האופקי מציין 5 אלפיות שני והקו האנכי מציין 0.5 mV. 3.3) פרוסות נאספו לתוך צינורות 1.5 מ"ל לאחרההקלטה וLTP הצמד קפוא. 4.3) Dissection של אזור CA1 מפרוסות בהיפוקמפוס החולדה בוגרות. 4.4-4.5) אזורי CA1 הומוגני במאגר תמוגה hypotonic, אשר גורם לנפיחות האוסמוטי של תאים ושחרור של גרעינים. 4.8 צנטריפוגה) של lysates ב11,000 סל"ד במשך דקות 1. 4.10) אוסף של השברים מועשרים cytoplasmic והגרעיניים לimmunoblotting. 5.3 טוען) של שברים מועשרים cytoplasmic והגרעיניים על SDS-PAGE ומערבי-סופג סטנדרטיים שלאחר מכן.
איור 4 אינדוקציה של CA1 LTP מובילה להצטברות של pJacS180 בגרעין. ) Immunoblot לhomogenate, cytosolic ושברים מועשרים גרעיניים של lysate CA1 משש עם cytosolic וסמנים גרעיניים. ניתוח immunoblot של רמת pJac-S180 בhomogenate 2 דקות B) ו30 דקות לאחר induction של tetanization. C) ניתוח immunoblot של רמת pJacS180 בדקות גרעיניות מועשרים חלק 2 ודקות לאחר tetanization. תוצאות אלה הן חלק מגרף הכימות פורסם בKarpova et al 10. immunoblots נציג אלה אינם כלולים לפרסום המקורי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
השלבים המתוארים בפרוטוקול לעיל לספק הדרכה כיצד להכין חריף בהיפוקמפוס פרוס מחולדות צעירות או מבוגרים, לעורר והשיא LTP, במהירות לנתח אזור מגורה של הפרוסה, ולהכין חלק מועשר גרעיני ללימוד דינמיקת חלבון תלוי פעילות. גישה זו נובעת משילוב של מספר שיטות שונות המשמשות באופן עצמאי אחד מהשני. אנו מותאמים זרימת עבודה ולספק פירוט מספיק למתחילים כדי להגדיר את הניסויים שלהם ללמוד חלוקה מחדש subcellular של חלבונים על אינדוקציה של LTP. כדוגמא אנו מראים כי הצורה המאוחרת של LTP גורמת הצטברות הגרעינית של S180 phosphorylated יעקב. להבחין בין זירחון של בריכה גרעינית קיימות מראש של חלבון נתון וטרנסלוקציה של צורת פוספורילציה שלה לאחר פעילות הסינפטית, גישה זו יכולה להיות משולבת עם שליטה לרמה כוללת של חלבון של עניין בשבריר המועשר הגרעיני. יתר על כן, מבחן חשמלדגימות ng על נקודות זמן שונות לאחר האינדוקציה LTP יכולות להיות תובנה מאוד ללימוד קורס של הפעלה / איון חלבון או תחלופה גרעינית זמן.
במהלך תקופת ההכנה של שברים מועשרים גרעיניים מפרוסות מגורה יש כמה בעיות מתודולוגיות שצריכות לטפל. ראשית, כדי להגדיל את מספרם של תאי עצב מגורה באזור CA1 וכמות החומר לimmunoblotting, אנחנו מיישמים 5 מיקרומטר של biccuculine חוסם קולטן GABAA במהלך tetanization. Biccuculine הוכח כדי לשפר את פוטנציאל postsynaptic מעורר 3.
שני, שמירה על פרוסות לאחר האינדוקציה של LTP על ידי הקפאה מהירה הוא שלב קריטי עבור ניסויים מוצלחים בגלל טיפול מכאני של פרוסות עלול לגרום לסוגים שונים של פעילויות ישירות מקשרים עם שינויים בשינויים של החלבון. כדי לקצר את ההליך ככל האפשר, אנו משתמשים במוט מתכת שהונח על קרח יבש. Sliceים יכול להיות מועבר בירידה של ACSF באמצעות פלסטיק פיפטה פסטר ויוקפא בתוך מעט מאוד שני כאשר הניח על prechilled מתכת.
השלב הקריטי השלישי הוא ההעשרה של גרעינים בlysates CA1. אנו ממליצים לעקוב אחר תא נפיחות מתחת למיקרוסקופ ולמצוא את נקודת הזמן האופטימלית ביותר. לפעמים כשהומוגניזציה של רקמה לא נעשתה כראוי, פסולת תא עדיין נשארה בדגימות. לאחר מכן גלולה הגרעיני יכולה להיות resuspended במאגר תמוגה שוב, שטף לכמה דקות, ולאחר מכן centrifuged לקבל שבריר גרעיני טהור יותר.
בסך הכל פרוטוקול זה יכול לעזור לExplorer תפקידם של חלבוני שליח synapto-גרעיני שונים בפלסטיות הסינפטית נוסף. ניתן ליישם את אותו ההליך לא רק לLTP גירוי מושרה בתדירות גבוהה אבל כל צורות האחרות של פלסטיות הסינפטית כמו בע"מ,, מודלים פלסטיות פרץ תטא LTP לטווח קצרים, ואחרים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| CED 1401 AD/DA converter | Cambridge Electronics Design, UK | ||
| Stereomicroscope | Leica S4E, Germany | ||
| Vibrotome | Leica VT1000S, Germany | ||
| Isolated pulse stimulator | A-M Systems, USA | Model 2100 | |
| Centrifuge | Thermo Scientific | ||
| SDS-PAGE system | Biorad | ||
| Cooler | Julabo | ||
| Bright field Microscope | Nikon Eclipse TS100 | ||
| Cell culture incubator | Thermo Electron Corporation | ||
| Micromanipulator | Luigs & Neumann, SM-5, Germany | ||
| Blotting chamber and electric power supplier | Hoefer Scientific Instruments, San Francisco, CA | ||
| Submerged type recording chamber | custom made | ||
| U-shape and submerged type incubator | custom made | ||
| Small surgical scissors | |||
| Scalpel | |||
| Thin spatula | |||
| Plastic Pasteur pipette | |||
| Plastic culture dish | |||
| Bunsen beaker | |||
| Syringe | |||
| Reagents | |||
| NaCl | Roth | Art.-Nr.3957.1 | ≥99.5%, p.a., ACS, ISO |
| KCl | Roth | Art.-Nr.6781.1 | ≥99.5%, p.a., ACS, ISO |
| CaCl2·2H2O | Merck | 1.02382.0500 | pro analysis |
| MgSO4·2H2O | Merck | 5886.05 | pro analysis |
| MgCl2·6H2O | AppliChem | CAS-NO: 7791-18-6; EC-NO:2320946 | for molecular biology |
| KH2PO4 | Merck | 12034.025 | for molecular biology |
| Na2HPO4·2H2O | Merck | 1.06574.1000 | extra pure |
| Glucose·H2O | Roth | Art.-Nr.6887.1 | for molecular biology |
| HEPES | Roth | Art.-Nr.9105.4 | PUFFERAN, ≥99.5%, p.a. |
| NaHCO3 | Merck | 1.06329.1000 | pro analysis |
| Protease inhibitor cocktail | Roche | ||
| Phosphostop | Roche | ||
| Bicuculline | Tocris Bioscience | ||
| Isoflurane | Baxter | ||
| Antibodies | |||
| Primary antibodies | Company | Catalog Number | Species |
| pJac-s180 | Biogenes | rabbit (diluted 1:100) | |
| NeuN | Milipore | MAB377 | mouse (diluted 1:1,000) |
| NSE | Cell Signaling | D20H2 | rabbit (diluted 1:1,000) |
| Beta-actin | Sigma | A-5441 | mouse (diluted 1:5,000) |
| Secondary antibodies | Company | Catalog Number | Species |
| IgG HRP conjugated | DAKO | goat anti-mouse (1:5,000) | |
| IgG HRP conjugated | NEB | goat anti-rabbit (1:5,000) | |
References
- Behnisch, T., et al. Nuclear translocation of Jacob in hippocampal neurons after stimuli inducing long-term potentiation but not long-term depression. PLoS One. 6 (2), e17276 (2011).
- Cai, F., Frey, J. U., Sanna, P. P., Behnisch, T. Protein degradation by the proteasome is required for synaptic tagging and the heterosynaptic stabilization of hippocampal late-phase long-term potentiation. Neuroscience. 169 (4), 1520-1526 (2010).
- Chapman, C. A., Perez, Y., Lacaille, J. C. Effects of GABA(A) inhibition on the expression of long-term potentiation in CA1 pyramidal cells are dependent on tetanization parameters. Hippocampus. 8 (3), 289-298 (1998).
- Ch'ng, T. H., Uzgil, B., Lin, P., Avliyakulov, N. K., O'Dell, T. J., Martin, K. C. Activity-dependent transport of the transcriptional coactivator CRTC1 from synapse to nucleus. Cell. 150 (1), 207-221 (2012).
- Dieterich, D. C., et al. Caldendrin-Jacob: a protein liaison that couples NMDA receptor signalling to the nucleus. PLoS Biol. 6 (2), e34 (2008).
- Fainzilber, M., Budnik, V., Segal, R. A., Kreutz, M. R. From synapse to nucleus and back again--communication over distance within neurons. J. Neurosci. 31 (45), 16045-16048 (2011).
- Hardingham, G. E., Bading, H. Synaptic versus extrasynaptic NMDA receptor signalling: implications for neurodegenerative disorders. Nat. Rev. Neurosci. 11 (10), 682-696 (2010).
- Ivanov, A., et al. Opposing role of synaptic and extrasynaptic NMDA receptors in regulation of the extracellular signal-regulated kinases (ERK) activity in cultured rat hippocampal neurons. J. Physiol. 57, 789-798 (2006).
- Jordan, B. A., Kreutz, M. R. Nucleocytoplasmic protein shuttling: the direct route in synapse-to-nucleus signaling. Trends Neurosci. 32 (7), 392-401 (2009).
- Karpova, A., et al. Encoding and transducing the synaptic or extrasynaptic origin of NMDA receptor signals to the nucleus. Cell. 152 (5), 1119-1133 (2013).
- Kim, M. J., Dunah, A. W., Wang, Y. T., Sheng, M. Differential roles of NR2A- and NR2B-containing NMDA receptors in Ras-ERK signaling and AMPA receptor trafficking. Neuron. 46, 745-760 (2005).
- Lai, K. O., Zhao, Y., Ch'ng, T. H., Martin, K. C. Importin-mediated retrograde transport of CREB2 from distal processes to the nucleus in neurons. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105 (44), 17175-17180 (2008).
- Leutgeb, J. K., Frey, J. U., Behnisch, T. LTP in cultured hippocampal-entorhinal cortex slices from young adult (P25-30) rats. J. Neurosci. Methods. 130 (1), 19-32 (2003).
- Leutgeb, J. K., Frey, J. U., Behnisch, T. Single cell analysis of activity-dependent cyclic AMP-responsive element-binding protein phosphorylation during long-lasting long-term potentiation in area CA1 of mature rat hippocampal-organotypic cultures. Neuroscience. 131 (3), 601-610 (2005).
- Perlson, E., Hanz, S., Ben-Yaakov, K., Segal-Ruder, Y., Seger, R., Fainzilber, M. Vimentin-dependent spatial translocation of an activated MAP kinase in injured nerve. Neuron. 45 (5), 715-726 (2005).
- Xiang, Z., et al. Long-term maintenance of mature hippocampal slices in vitro. J. Neurosci. Methods. 98 (2), 145-154 (2000).
- Zhao, M., Adams, J. P., Dudek, S. M. Pattern-dependent role of NMDA receptors in actin potential generation: consequences on extracellular signal-regulated kinase activation. J. Neurosci. 25 (30), 7032-7039 (2005).
