Summary
Мы предоставляем подробный протокол для индукции длительной потенциации в СА1 области гиппокампа и последующего выделения ядерных обогащенных фракций от tetanized области среза. Этот подход может быть использован для определения активности в зависимости импорт ядерного белка в клеточных моделей обучения и памяти.
Abstract
Изучение активности выражение зависимый белок, субклеточная транслокация или фосфорилирования важно понять основные клеточные механизмы синаптической пластичности. Долгосрочный потенциация (LTP) и длительная депрессия (ООО), индуцированный в острых срезов гиппокампа широко признаны как клеточных моделях обучения и памяти. Существуют многочисленные исследования, которые используют живых изображений сотовый или иммуногистохимии подходы к визуализации активности динамику зависимые белковые. Однако эти способы основаны на пригодность антител для иммуноцитохимии или гиперэкспрессией флуоресценции с метками белков в отдельных нейронов. Иммуноблоттинг белков является альтернативным методом обеспечили подтверждение выводов. Первый ограничивающим фактором в получении субклеточных фракций из отдельных tetanized срезах гиппокампа является низкое количество материала. Во-вторых, процедура обработки имеет решающее значение, потому что даже очень коротких и незначительных манипуляций лiving ломтики может вызвать активацию определенных сигнальных каскадов. Здесь мы описываем оптимизированный рабочий процесс, чтобы получить достаточное количество ядерного обогащенной фракции достаточной чистоты от СА1 области острых срезах гиппокампа из мозга крысы. В качестве типичного примера показывают, что ERK1 / 2 фосфорилированный форма synapto-ядерного белка мессенджера Jacob активно перемещает к ядру при индукции LTP и могут быть обнаружены в ядерном обогащенной фракции от СА1 нейронов.
Introduction
Synaptic N-метил-D-аспартат-рецепторы (NMDARs) играют ключевую роль в синаптической пластичности и выживаемость клеток сигнализации в то время активации внесинаптических NMDARs может вызвать нейродегенерации и гибель клеток. Эти изменения зависят от жестко контролируемой / регулируемой деятельности выражения зависит генов и, следовательно, требуют постоянного общения между активированными синапсов или дендритов и ядра 7. MAP киназ ERK1 / 2 являются нижестоящими эффекторами синаптических NMDARs сигнализации и не участвуют в экспрессии генов NMDAR-активация-индуцированной, в то время как сигнализации через внесинаптического NMDAR не имеет или тормозящее действие на ERK1 / 2 деятельности 8,11.
Есть ряд белков, которые были показаны, чтобы курсировать между дистальных дендритов и ядра. Многие из этих белков содержит сигнал ядерной локализации и активно транспортируется вдоль микротрубочками в динеина и импортина-зависимым образом в ядро 6,9. Interestinglу, некоторые из этих мессенджеров только транзит в ядре в ответ на конкретные синаптических раздражители. Например, ретроградная транспорт циклического АМФ элемента ответа связывающий белок 2 (CREB2) индуцируется химической ООО, но не LTP 12. Локализованные NMDAR-зависимой синаптической стимуляции приводит CREB-регулируется транскрипции коактиватор (CRTC1) в ядро, процесс транслокации, которая участвует в долгосрочной гиппокампа пластичности 4. Недавно было показано, что посланник белок Иаков транслоцируется в ядро после как, синаптической и внесинаптического активации NMDAR и регулирует CREB зависит транскрипцию гена 5. Синаптической или внесинаптического происхождение сигнала кодируется в посттрансляционной модификации Иакова. Синаптической активности индуцирует ERK1 / 2 зависимое фосфорилирование Иакова в решающий серин в положении 180 (pJacobS 180), который является необходимым условием для последующего транслокации в ядро в первичной гиппокампа культуры. Более того, ян CA1 нейронов острых срезов гиппокампа pJacobS 180 перемещается в ядро после Шаффер залога ЛТП, но не LTD 1,10. pS180 Иаков приводит к повышенной экспрессии пластичности связанных генов и это выражение гена каналы обратно в синаптической функции. В резком контрасте, Иаков, что перемещается в ядро после внесинаптического NMDARs активация не фосфорилируется в Ser180 и могут быть связаны с различными белкового комплекса в ядре в результате чего 'CREB отключить' и втягивание синаптических контактов 10.
Большинство опубликованных исследований по ядерной импорта synapto-ядерного белка посланника было сделано в диссоциированных нейронов первичных культурах. Поэтому было бы интересно посмотреть, если такие выводы могут быть воспроизведены в физиологически более актуальными условия, используя срезах гиппокампа, где нейронная связь и функция гораздо лучше сохраняются. Здесь мы представим оптимизированный протокол для оценки LTP-деКулон ядерную транслокацию белка посланников иммуноблоттингом. Этот способ также подходит для анализа активности зависимое фосфорилирование белков в сырой ядерной фракции. В частности, текущий протокол включает получение острых срезов СА1 гиппокампа, индукции и записи ЛТП. Далее, СА1 область под микроскопом рассекают, чтобы изолировать область стимулированного. Мы объединили и изменение протокол для ядерной изоляции, предоставленную CellLytic ядерной Extraction Kit с изменениями, внесенными Чжао и его коллеги 17. Оптимизированная процедура включает лизис расчлененных СА1 регионов в гипотонического буфера, позволяющее клеток опухоли и высвобождение ядер. Лизис клеток и морфологию ядра может быть определена с помощью микроскопического исследования. Ядерный обогащение достигается стадией короткого центрифугирования. Иммуноблоттинг анализ с антителами против NeuN и NSE2, специфических маркеров ядерных или цитозольных фракций, указывает на то, что этот подход может быть использован в качестве быстрогои воспроизводимый протокол изолировать эти субклеточные фракции и учиться очень неустойчивые посттрансляционные модификации как фосфорилирования белков. Кроме того, этот способ выгоден маленькие образцы ткани, вытекающих из вскрытых СА1 регионах срезах гиппокампа и могут быть использованы в комбинации с иммуногистохимии в срезах гиппокампа.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1 Подготовка острого срезов гиппокампа от взрослых мозга крысы
- Обезболить крыс изофлураном. ВНИМАНИЕ: Выполните процедуру, используя закрытую ексикаторе, не вдыхать изофлурана. Убедитесь, что животное полностью под наркозом.
- Обезглавить крысу, быстро изолировать мозг, и погрузить его в precarbonated (95% O 2/5% CO 2 газовой смеси) ледяной решение Гея (состав в мм: 130 NaCl, 4,9 KCl, 1,5 CaCl 2 · 2H 2 O , 0.3 MgSO 4 · 2H 2 O, 11 MgCl 2 · 6H 2 O, 0,23 KH 2 PO 4, 0,8 Na 2 HPO 4 · 7H 2 O, 5 Глюкоза · H 2 O, 25 HEPES, 22 NaHCO 3, рН 7,32) в течение 30 мин 1,2,10,16.
- Удалить мозжечка и часть энторинальной коры. Отделите корковых полушария с середины-сагиттальной вырезать, затем поместите каждое полушарие вниз на ее медиальной поверхности. После этого сделать50-70 ° вырезать (50-70 ° поперечная) вдоль верхнего края каждого полушария 13,14.
- Клей каждое полушарие с свежескошенной поверхности на нарезки платформе системы секционирования. Платформа должна быть покрыта precarbogenated решения ледяным Гея.
- Вырезать 350 мкм 50-70 ° поперечных срезов спереди назад сторона, используя vibratome скорректирован с целью минимизации г-оси колебаний. Гиппокампа, subicular и энторинальной коры головного мозга, а также коры головного мозга, которые расположены дорсолатеральной в гиппокампе будет часть срезов, используемых для экспериментов 13,14.
- Трансфер срезах гиппокампа к U-образной формы и погружного типа инкубатора и инкубировать в течение не менее 2 ч при 32 ° С с carbogenated искусственного спинномозговой жидкости (ACSF содержащий в мм: 110 NaCl, 2,5 KCl, 2,5 CaCl 2 · 2H 2 O, 1,5 MgSO 4 · 2H 2 O, 1,24 KH 2 PO 4, 10 Глюкоза · H 2O, 27,4 NaHCO 3, рН 7,3) 1,2,10,16.
2 позиционирования электродов, Базовый Запись и индукционные ЛТП
- Передача гиппокампа ломтик в погруженном записи типа камеры, установленной под микроскопом. Заливать (6-7 мл / мин) с carbogenated ACSF по крайней мере 30 мин при 32 ° С.
- Подготовить стеклянный капилляр микроэлектродов, заполненных ACSF (сопротивление наконечник 3-5 МОм).
- Поставьте стакан микроэлектродов, заполненных ACSF в CA1 Шаффер-залоговых волокон для стимуляции и в CA1 рогового radiatum для fEPSP записи 1,2,10 (Рисунок 2). Расстояние между электродами должно быть около 300 мкм.
- Вызывание поле возбуждающих постсинаптических потенциалов (fEPSPs) стимуляцией Шаффер-залоговых волокон с импульсами двухфазных прямоугольных тока (200 мс / полярности) в диапазоне 3-4 В.
- Выполните максимальное тест стимуляции путем измерения вхут-выход отношения и определить силу стимуляции 40% максимальных значений fEPSP-склоновых полученных и держать его постоянным в течение всего эксперимента.
- Начните запись исходных условий для по крайней мере 15 минут после максимального теста стимуляции. Измерение ответов на тестовые стимулы каждую минуту в течение всего эксперимента. Выполните базовые записи с низкочастотной стимуляции.
- Запишите основу для по крайней мере 30 мин.
- Для индукции Поздно БПЛ применяются высокочастотные 100 Гц тетанизации, состоящий из трех 1 сек стимулирования поездов на 100 Гц с 5 мин intertrain интервала. Для увеличения поля стимуляции в СА1 области 5 мкМ бикукуллина можно мыть в 2 мин до тетанизации и следует мыть сразу же после последнего тетанизации.
3 Коллекция фрагментов после индукции LTP и фиксированным замораживания
- Стоп LTP записи 2 мин или 30 мин после трех поездов тетанической стимуляции, вызывающих Поздний БПЛ.
- Собирают каждый кусочек в 1,5 мл пробирку и хранить при -80 ° C.
4 Выделение ядерных Обогащенный фракций от СА1 области гиппокампа
- Возьмите 1,5 мл пробирки Эппендорф с замерзшими ломтиками от -80 ° C и держите их на льду.
- Добавить 0,5 мл свежей холодной TBS-буфера, содержащего протеазы (PI) и ингибиторы фосфатазы (PS), в трубу. Инкубировать в течение 2-3 мин и передать стереомикроскопа. ВНИМАНИЕ: Использовать защитные перчатки и лабораторный халат во время работы с ИП и ПС.
- Рассеките CA1 рогового pyramidale область гиппокампа с помощью двух игл. Используйте одну иглу для проведения срез под стереомикроскопом и второй иглы для резки области СА1.
- Соберите расчлененный CA1 регионы от 5 ломтиков (для каждой группы) в новую пробирку 1,5 мл, содержащую 50 мкл буфера для лизиса (1x гипотонического буфера для лизиса, содержащего в мм: 10 HEPES, 1,5 MgCl 2, 10 KCl, рН 7,9, с PI и PS). Заметим, что это количество материала будет достаточно, чтобы запустить 2-3 иммуноблотах.
- Перемешать собранную ткань благодаря тщательной пипетки вверх и вниз. Используйте 200 мкл пипетки. Инкубируйте лизата на льду в течение 5-7 мин, чтобы позволить клетки набухать.
- Возьмите 2 мкл лизата, падение на предметное стекло, и визуализировать опухоль из клеток под ярким поле микроскопа. При правильном набухания клеток ядра появляются как круглые нетронутыми структуры.
- Соберите 20 мкл образца в свежую 1,5 мл трубки как «гомогената фракции '. Добавить 8 мкл денатурирующего буфера 4x образца SDS.
- Центрифуга оставшиеся лизатов при 11000 оборотах в минуту в течение 1 мин.
- Осторожно собрать надосадочную жидкость из верхней ("цитозольной фракции '), TRansfer в новую пробирку и добавить 20 мкл 4х буфера выборки.
- Ресуспендируют осадок в 60 мкл гипотонического буфера и добавить 20 мкл 4х буфера выборки. Эту фракцию называют «ядерного обогащенной фракции '.
- Гомогената цитозольного, и ядерные обогащенные фракции можно хранить при -20 ° С или -80 ° С для последующего иммуноблоттинга.
5 Полуколичественный Иммуноблоттинг для Synapto-ядерных белков
- Разморозить образцы и варить их в течение 5 мин при 95 ° С.
- Возьмем 5 мкл от каждой фракции и определяют концентрацию белка по амидо черным теста или BCA теста.
- Загрузить равное количество образцов белка из гомогената, цитоплазматические и ядерные обогащенных фракций на SDS-PAGE. Образцы от контроля и ломтиками LTP должен быть сделан на том же гель для прямого сравнения.
- Выполните стандартную западную-блоттинга процедуру (мокрый передачи рекомендуется).
- Зонд мембраны с тОн антитело выбора. Затем те же блоты (или же образцы работают параллельно) могут быть проверены с цитоплазматической маркер - нейронов специфической enolase2 (NSE2) и ядерного маркера - NeuN и -actin антител в качестве контроля нагрузки.
Анализ 6. данных
- Эффективность индукции LTP могут быть проанализированы с помощью программного обеспечения Clampfit. Средний уклон исходных записей сравнивали с склоны после тетанизации помощью двусторонней ANOVA, р <0,05 считали значительно отличается. Значения наклона fEPSP были изображены на схемах как среднее ± SEM
- Для количественного определения иммуноблотах, сканировать авторадиографические фильм и анализировать интегральную плотность белковых полос по ImageJ или полос флуоресценции с системой Licor. Значения иммунореактивных полос должно быть нормализовано для загрузки и промокательной управления. Для сравнения контроля и LTP групп непараметрической Манна-Уитни U-тест может быть использован.
| Имя буфера | Реагент | Концентрация (мМ) | Сумма | Комментарии / Описание |
| Гея (рН: 7,3 ~ 7,4) | NaCl | 130 | 7,6 г | стерильной фильтрации |
| 1000 мл | KCl | 4.9 | 0,37 г | |
| CaCl 2 · 2H 2 O | 1.5 | 0,22 г | ||
| MgSO 4 · 2H 2 O | 0.3 | 0,0739 г | ||
| MgCl 2 · 6H 2 O | 11 | 2,24 г | ||
| KH 2 PO 4 | 0.23 | 0,0313 г | ||
| Na 2 HPO 4 · 7H 2 O | 0.8 | 0,2145 г | ||
| Глюкоза · H 2 O | 5 | 0,9909 г | ||
| HEPES | 25 | 5,96 г | ||
| NaHCO 3 | 22 | 1,85 г | ||
| ACSF (рН: 7,3 ~ 7,4) | NaCl | 110 | 6,428 г | стерильной фильтрации |
| 1000 мл | KCl | 2.5 | 0,1865 г | |
| CaCl 2 · 2H 2 O | 2.5 | 0,368 г | ||
| MgSO 4 · 2H 2 O | 1.5 | 0,370 г | ||
| KH 2 PO 4 | 1.24 | 0,169 г | ||
| Глюкоза · H 2 O | 10 | 1,9817 г | ||
| NaHCO 3 | 27.4 | 2,3 г | ||
| 1x гипотонического буфера (рН 7,9) | HEPES | 10 | 0,23 г | |
| 100 мл | MgCl 2 · 6H 2 O | 1.5 | 0,0304 г | |
| KCl | 10 | 0,07455 г |
Таблица 1 Буферы.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ранее мы показали, что synapto-ядерный белок мессенджер Jacob накапливается в ядрах после индукции LTP, но не LTD 1. Кроме того, перемещение Иакова после синаптической стимуляции требует активации МАРК ERK1 / 2 и фосфорилирования Иакова в Ser180 (рис 1). Фосфорилированный Иаков транслоцируется в ядро в импортина-зависимым способом и фосфорилируется состояние может сохраняться в течение длительного периода времени по ассоциации с промежуточной нити αinternexin 15 (рисунок 1). Фосфо-состояние Иакова важно для экспрессии активности зависит от генов и выживание клеток. Интересно, что активация внесинаптических NMDARs также приводит Jacob в ядро, но в этом случае Jacob не фосфорилированные на Ser180 и его накопление ядерного индуцирует CREB 'выключить' 5,10. Результаты, описанные выше, были получены ProtocoLs установленные в нашем недавнем исследовании (см Карпова и др. 10 для подробного описания модели).
Чтобы доказать, что Джейкоб транслоцируется в ядро после индукции LTP, мы индуцированных и измеряется индукцию Шаффер залога fEPSP потенцирования при острых срезов гиппокампа и затем выделяют нейронов ядра из СА1 нейронов (рисунки 2 и 3). Мы сравнили две различные точки времени после применения высокочастотной стимуляции (2 мин и 30 мин) и записаны индукцию LTP для каждого среза, который был впоследствии обработан для ядерной изоляции и Вестерн-блоттинг (фиг.2 и 3). Обогащение ядерного маркера нейронов NeuN можно видеть в ядерном обогащенной фракции, полученной из рассеченной СА1 области, в то время как цитозольного маркера нейронов конкретных enolase2 (NSE), в основном присутствует в надосадочной фракции, полученной после центрифугирования лизированных Cлоктей (4А). Специфика pS180 Jacob антител характеризуется ранее (подробнее см Карпова и др. 10). Уровни pS180 Иаков оставался неизменным в общем объеме CA1 белковых гомогенатах и в ядерной обогащенного фракция 2 мин после тетанизации (Рисунок 4B), но мы нашли значительное увеличение pJacobS 180 иммунореактивности 30 мин после индукции LTP (Рисунок 4C), подтверждающий, что Иакова транслокации в ядро в этой клеточной модели пластичности фосфорилируется в Ser180.
Рис.1 Иаков фосфорилируется в S180 кодирует синаптическую происхождение NMDARs сигналов. Тетанической стимуляцию гиппокампа Шаффер залога волокон приводит к активации синаптических NMDARs и последующей активации МАРКERK1 / 2 сигнального каскада. Активированный ERK1 / 2 связывается и фосфорилирует Jacob на серина 180 и / 2 комплекс Jacob-ERK1 перемещается в ядро, и это коррелирует с повышенной активности CREB и активации экспрессии генов, связанных с пластичности.
Рисунок 2 Оборудование и инструменты, используемые для индукции LTP и рассечения регион СА1 от срезов гиппокампа. А) Vibratome используется для приготовления острых срезов гиппокампа (1 - Vibratome) B1-2) электрофизиологии и настройка изображения (2 - микроскоп; 3 - Микроманипулятор и система перфузии; 4 - Перекодирование электрод; 5 - Стимуляция электрод; 6 - Вода объективом ; 7 - держатель Slice с гиппокампа ломтик) C) Оборудование, используемое для рассечения СА1 области от срезов гиппокампа (8 Stereomicroscope; 9 - Инсулин шприц с иглами; 10 - Малые хирургические ножницы; 11 - Скальпель; 12 - Пластиковые пипетки Пастера, 13 - Тонкий шпатель; 14-100 мм пластик культура блюдо заполнено водой со льдом, и 40 мм пластик культура блюдо используется для рассечения ломтиками.
Рисунок 3 мультфильм демонстрируя экспериментальную процедуру. Цифры указывают шаги в протоколе. 2.1-2.8) острый гиппокампа ломтик в затопленную камеру со стеклянными электродами, помещенными в роговом radiatum для потенцирования Шаффер залога-СА1 синапсов. На вставке представляет образец fEPSP аналоговые следы, горизонтальная полоса указывает 5 мс, а вертикальная полоса указывает 0,5 мВ. 3,3) Срезы были собраны в 1,5 мл пробирки, послеЗапись LTP и замораживали. 4.3) Вскрытие региона CA1 от взрослых ломтиками гиппокампа крысы. 4,4-4,5) CA1 области гомогенизировали в гипотонического буфера для лизиса, что приводит к осмотическому набуханию клеток и высвобождения ядер. 4,8) Центрифугирование лизатов при 11000 оборотах в минуту в течение 1 мин. 4.10) Коллекция цитоплазматических и ядерных обогащенных фракций для иммуноблотинга. 5.3) Загрузка цитоплазматических и ядерных обогащенных фракций на SDS-PAGE и последующего стандартной западной-блоттинга.
Рисунок 4 Индукция СА1 LTP приводит к накоплению pJacS180 в ядре. А) Вестернблот для гомогената, цитозольной и ядерных обогащенных фракций СА1 лизата зондируют цитозольного и ядерных маркеров. B) Иммуноблот анализ уровня pJac-S180 в гомогенат 2 мин и 30 мин после промводств из тетанизация. C) Иммуноблот анализ уровня pJacS180 в ядерной обогащенного фракция 2 мин и мин после тетанизации. Эти результаты являются частью количественного графике, опубликованном в Карпова и др 10. Эти представительные иммуноблоты не включены в по первоначальной публикации.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Описанные в предыдущем протоколе дать указания, как подготовить гиппокампа острый нарезанный из молодых или взрослых крыс, индуцировать и запись LTP, быстро вскрыть вынужденное площадь среза, и подготовить ядерную обогащенную фракцию для изучения активности динамику зависимые белковые. Такой подход вытекает из комбинации нескольких различных методов, используемых независимо друг от друга. Мы оптимизировали рабочий процесс и обеспечить достаточную детализацию для новичка, чтобы создавать свои собственные эксперименты по изучению субклеточной перераспределение белков при индукции LTP. В качестве примера мы покажем, что поздняя форма LTP индуцирует ядерная накопление S180 фосфорилируется Иакова. Чтобы различать фосфорилирования уже существующей атомной пула данного белка и его транслокации фосфорилированной форме после синаптической активности, такой подход может быть объединен с управлением для общего уровня белка, представляющего интерес в ядерной фракции, обогащенной. Более того, исОбразцы нг более различные моменты времени после индукции LTP может быть очень проницательным для изучения временной ход белка активации / инактивации или ядерного оборота.
Во время подготовки ядерных обогащенных фракций от стимулированных ломтиками есть несколько методологических вопросов, которые необходимо решать. Прежде всего, чтобы увеличить количество нейронов, стимулированных в области СА1 и количество материала для иммуноблоттинга, мы используем 5 мкМ ГАМК рецепторов блокатор biccuculine во тетанизации. Biccuculine было показано, чтобы добавлять возбуждающие постсинаптические потенциалы 3.
Во-вторых, сохранение ломтиками после индукции LTP при быстром замораживании является важным шагом для успешных экспериментов, поскольку механические обработка срезов может вызвать различные виды деятельности, непосредственно коррелирует с изменениями в модификации белка. Чтобы сократить процедуру, насколько это возможно, мы используем металлический стержень размещен на сухом льду. Sliceс могут быть переданы в капле ACSF использованием пластиковых пипетки Пастера и быть заморожены в течение очень немногих вторая при размещении на prechilled металла.
Третий важный шаг является обогащение ядер в СА1 лизатов. Мы рекомендуем следить ячейку отеки под микроскопом и найти наиболее оптимальную точку времени. Иногда, когда гомогенизации ткани не было сделано надлежащим образом, клеточный дебрис все еще остается в образцах. Затем ядерного осадок может быть повторно суспендировали в буфере для лизиса раз, промывают в течение нескольких минут, а затем центрифугировали, чтобы получить более чистый ядерной фракции.
Общая этот протокол может способствовать дальнейшему исследователю роль различных synapto-ядерный мессенджеров белков в синаптической пластичности. Такая же процедура может быть применена не только к стимуляции индуцированного LTP высокочастотной но всех других форм синаптической пластичности, как ООО, тета-взрыв LTP, краткосрочных моделей пластичности и другие.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| CED 1401 AD/DA converter | Cambridge Electronics Design, UK | ||
| Stereomicroscope | Leica S4E, Germany | ||
| Vibrotome | Leica VT1000S, Germany | ||
| Isolated pulse stimulator | A-M Systems, USA | Model 2100 | |
| Centrifuge | Thermo Scientific | ||
| SDS-PAGE system | Biorad | ||
| Cooler | Julabo | ||
| Bright field Microscope | Nikon Eclipse TS100 | ||
| Cell culture incubator | Thermo Electron Corporation | ||
| Micromanipulator | Luigs & Neumann, SM-5, Germany | ||
| Blotting chamber and electric power supplier | Hoefer Scientific Instruments, San Francisco, CA | ||
| Submerged type recording chamber | custom made | ||
| U-shape and submerged type incubator | custom made | ||
| Small surgical scissors | |||
| Scalpel | |||
| Thin spatula | |||
| Plastic Pasteur pipette | |||
| Plastic culture dish | |||
| Bunsen beaker | |||
| Syringe | |||
| Reagents | |||
| NaCl | Roth | Art.-Nr.3957.1 | ≥99.5%, p.a., ACS, ISO |
| KCl | Roth | Art.-Nr.6781.1 | ≥99.5%, p.a., ACS, ISO |
| CaCl2·2H2O | Merck | 1.02382.0500 | pro analysis |
| MgSO4·2H2O | Merck | 5886.05 | pro analysis |
| MgCl2·6H2O | AppliChem | CAS-NO: 7791-18-6; EC-NO:2320946 | for molecular biology |
| KH2PO4 | Merck | 12034.025 | for molecular biology |
| Na2HPO4·2H2O | Merck | 1.06574.1000 | extra pure |
| Glucose·H2O | Roth | Art.-Nr.6887.1 | for molecular biology |
| HEPES | Roth | Art.-Nr.9105.4 | PUFFERAN, ≥99.5%, p.a. |
| NaHCO3 | Merck | 1.06329.1000 | pro analysis |
| Protease inhibitor cocktail | Roche | ||
| Phosphostop | Roche | ||
| Bicuculline | Tocris Bioscience | ||
| Isoflurane | Baxter | ||
| Antibodies | |||
| Primary antibodies | Company | Catalog Number | Species |
| pJac-s180 | Biogenes | rabbit (diluted 1:100) | |
| NeuN | Milipore | MAB377 | mouse (diluted 1:1,000) |
| NSE | Cell Signaling | D20H2 | rabbit (diluted 1:1,000) |
| Beta-actin | Sigma | A-5441 | mouse (diluted 1:5,000) |
| Secondary antibodies | Company | Catalog Number | Species |
| IgG HRP conjugated | DAKO | goat anti-mouse (1:5,000) | |
| IgG HRP conjugated | NEB | goat anti-rabbit (1:5,000) | |
References
- Behnisch, T., et al. Nuclear translocation of Jacob in hippocampal neurons after stimuli inducing long-term potentiation but not long-term depression. PLoS One. 6 (2), e17276 (2011).
- Cai, F., Frey, J. U., Sanna, P. P., Behnisch, T. Protein degradation by the proteasome is required for synaptic tagging and the heterosynaptic stabilization of hippocampal late-phase long-term potentiation. Neuroscience. 169 (4), 1520-1526 (2010).
- Chapman, C. A., Perez, Y., Lacaille, J. C. Effects of GABA(A) inhibition on the expression of long-term potentiation in CA1 pyramidal cells are dependent on tetanization parameters. Hippocampus. 8 (3), 289-298 (1998).
- Ch'ng, T. H., Uzgil, B., Lin, P., Avliyakulov, N. K., O'Dell, T. J., Martin, K. C. Activity-dependent transport of the transcriptional coactivator CRTC1 from synapse to nucleus. Cell. 150 (1), 207-221 (2012).
- Dieterich, D. C., et al. Caldendrin-Jacob: a protein liaison that couples NMDA receptor signalling to the nucleus. PLoS Biol. 6 (2), e34 (2008).
- Fainzilber, M., Budnik, V., Segal, R. A., Kreutz, M. R. From synapse to nucleus and back again--communication over distance within neurons. J. Neurosci. 31 (45), 16045-16048 (2011).
- Hardingham, G. E., Bading, H. Synaptic versus extrasynaptic NMDA receptor signalling: implications for neurodegenerative disorders. Nat. Rev. Neurosci. 11 (10), 682-696 (2010).
- Ivanov, A., et al. Opposing role of synaptic and extrasynaptic NMDA receptors in regulation of the extracellular signal-regulated kinases (ERK) activity in cultured rat hippocampal neurons. J. Physiol. 57, 789-798 (2006).
- Jordan, B. A., Kreutz, M. R. Nucleocytoplasmic protein shuttling: the direct route in synapse-to-nucleus signaling. Trends Neurosci. 32 (7), 392-401 (2009).
- Karpova, A., et al. Encoding and transducing the synaptic or extrasynaptic origin of NMDA receptor signals to the nucleus. Cell. 152 (5), 1119-1133 (2013).
- Kim, M. J., Dunah, A. W., Wang, Y. T., Sheng, M. Differential roles of NR2A- and NR2B-containing NMDA receptors in Ras-ERK signaling and AMPA receptor trafficking. Neuron. 46, 745-760 (2005).
- Lai, K. O., Zhao, Y., Ch'ng, T. H., Martin, K. C. Importin-mediated retrograde transport of CREB2 from distal processes to the nucleus in neurons. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105 (44), 17175-17180 (2008).
- Leutgeb, J. K., Frey, J. U., Behnisch, T. LTP in cultured hippocampal-entorhinal cortex slices from young adult (P25-30) rats. J. Neurosci. Methods. 130 (1), 19-32 (2003).
- Leutgeb, J. K., Frey, J. U., Behnisch, T. Single cell analysis of activity-dependent cyclic AMP-responsive element-binding protein phosphorylation during long-lasting long-term potentiation in area CA1 of mature rat hippocampal-organotypic cultures. Neuroscience. 131 (3), 601-610 (2005).
- Perlson, E., Hanz, S., Ben-Yaakov, K., Segal-Ruder, Y., Seger, R., Fainzilber, M. Vimentin-dependent spatial translocation of an activated MAP kinase in injured nerve. Neuron. 45 (5), 715-726 (2005).
- Xiang, Z., et al. Long-term maintenance of mature hippocampal slices in vitro. J. Neurosci. Methods. 98 (2), 145-154 (2000).
- Zhao, M., Adams, J. P., Dudek, S. M. Pattern-dependent role of NMDA receptors in actin potential generation: consequences on extracellular signal-regulated kinase activation. J. Neurosci. 25 (30), 7032-7039 (2005).
