Summary
Vi tillhandahåller ett detaljerat protokoll för induktion av långvarig potentiering i CA1-regionen i hippocampus och efterföljande isolering av kärn anrikade fraktioner från tetanized område av segmentet. Kan användas för detta tillvägagångssätt för att bestämma aktiviteten beroende kärnprotein import i cellulära modeller för inlärning och minne.
Abstract
Studera aktivitet beroende proteinuttryck, subcellulär sloka eller fosforylering är viktigt att förstå de bakomliggande cellulära mekanismer för synaptisk plasticitet. Långsiktig potentiering (LTP) och långtidsdepression (LTD) induceras i akut hippocampus skivor är allmänt accepterade som cellulära modeller för inlärning och minne. Det finns många studier som använder levande cell imaging eller immunohistokemi metoder för att visualisera aktivitetsberoende proteindynamik. Men dessa metoder är beroende av lämpligheten av antikroppar för immuncytokemi eller överuttryck av fluorescens-märkta proteiner i enskilda nervceller. Immunoblotting av proteiner är en alternativ metod som ger oberoende bekräftelse av resultaten. Den första begränsande faktor vid framställningen av subcellulära fraktioner från individuella tetanized hippocampus skivor är den låga mängd material. För det andra är avgörande för handläggningen eftersom även mycket korta och små manipulationer av living skivor kan framkalla aktivering av vissa signaleringskaskader. Här beskriver vi en optimerad arbetsflödet i syfte att få en tillräcklig mängd av kärn anrikad fraktion av tillräcklig renhet från CA1-regionen av akuta hippocampus skivor från råtthjärna. Som ett representativt exempel vi visar att ERK1 / 2 fosforylerad form av synapto-kärnprotein budbärare Jacob translokerar aktivt till kärnan vid induktion av LTP och kan detekteras i en nukleär fraktion från CA1 nervceller.
Introduction
Synaptic N-metyl-D-aspartat-receptorer (NMDARs) spelar en avgörande roll i synaptisk plasticitet och cellöverlevnad signalering medan aktivering av extrasynaptic NMDARs kan utlösa neurodegeneration och celldöd. Dessa förändringar beror på hårt kontrollerad / reglerad verksamhet beroende genuttryck och därmed kräver ständig kommunikation mellan aktiverade synapser eller dendriter och kärnan 7. The MAP-kinaser ERK1 / 2 är nedströms effektorer av synaptiska NMDARs signalering och är involverade i NMDAR-aktivering inducerad genexpression, medan signalering via extrasynaptic NMDAR har ingen eller en hämmande effekt på ERK1 / 2 aktivitet 8,11.
Det finns många proteiner som har visat sig skytteltrafik mellan distala dendriter och kärnan. Många av dessa proteiner innehåller en nukleär lokaliseringssignal och är aktivt transporteras längs microtubuli i en dynein och Importin beroende sätt till kärnan 6,9. Interestingly, vissa av dessa budbärare enbart transit till kärnan som svar på specifika synaptiska stimuli. Till exempel är retrograd transport av cykliskt AMP responselement bindande protein 2 (CREB2) induceras av kemiska LTD men inte LTP 12. Lokaliserad NMDAR beroende synaptisk stimulering driver CREB reglerade transkriptions samaktivator (CRTC1) in i kärnan, en translokationsprocessen, som är involverad i den långsiktiga hippocampus plasticitet 4. Det har nyligen visat att proteinet budbäraren Jacob translokerar till kärnan efter både synaptiska och extrasynaptic NMDAR aktivering och reglerar CREB beroende gentranskription 5. Den synaptiska eller extrasynaptic ursprung signalen är kodad i en posttranslationell modifiering av Jacob. Synaptic aktivitet inducerar ERK1 / 2 beroende fosforylering av Jacob vid en avgörande serin vid position 180 (pJacobS 180) vilket är en förutsättning för den efterföljande transloka till kärnan i primär hippocampus kulturen. Dessutom, jagn CA1 nervceller i akuta hippocampus skivor pJacobS 180 translokerar till kärnan efter Schaffer säkerheter LTP men inte LTD 1,10. pS180 Jacob leder till ett ökat uttryck av plasticitet relaterade gener och detta genuttryck matar tillbaka till synaptisk funktion. I skarp kontrast, Jacob som translokerar till kärnan efter extrasynaptic NMDARs aktivering inte fosforyleras vid Ser180 och kan vara förknippade med olika proteinkomplexet i kärnan orsakar 'CREB avstängning "och en tillbakadragning av synaptiska kontakter 10.
Mest publicerade studier om den nukleära importen av synapto-nukleärt protein budbärare har gjorts i dissocierade neuronala primära kulturer. Därför skulle det vara intressant att se om dessa fynd kan reproduceras i fysiologiskt mer relevanta förhållanden med hjälp av hippocampus skivor där nervkopplingar och funktion är mycket bättre bevarade. Här presenterar vi ett optimerat protokoll för bedömning av LTP-devidhängande nukleär translokation av protein budbärare genom immunoblotting. Denna metod är också lämplig för att analysera aktiviteten beroende fosforylering av proteiner i en rå kärnfraktion. Specifikt handlar det nuvarande protokollet beredningen av akuta CA1 hippocampus skivor, induktion och inspelning av LTP. Därefter CA1 regionen mikroskopiskt dissekeras att isolera den stimulerade området. Vi kombinerade och ändrat protokollet för kärnkrafts isolering från CellLytic Nuclear Extraction Kit med ändringar som införts av Zhao och kollegor 17. Den optimerade förfarande omfattar lys av dissekerade CA1 regioner hypoton buffert möjliggör cellsvullnad och frisättning av kärnor. Cellys och kärnorna morfologi kan bestämmas genom mikroskopisk undersökning. Kärn berikning uppnås genom en kort centrifugeringssteg. Immunanalys med antikroppar mot NeuN och NSE2, specifika markörer av nukleära eller cytosoliska fraktioner, indikerar att denna metod kan användas som en snabboch reproducerbar protokoll för att isolera dessa subcellulära fraktioner och studera mycket labila posttranslationella modifieringar som proteinfosforylering. Dessutom är denna metod fördelaktig för små vävnadsprover som härrör från dissekerade CA1 regioner i hippocampus skivor och kan användas i kombination med immunohistokemi av hippocampus skivor.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1 Beredning av akut hippocampus Slices från Adult Rat Brain
- Bedöva råttorna med isofluran. VARNING: Utför proceduren med en sluten exicator, inte andas isofluran. Se till att djuret är helt sövd.
- Halshugga råttan, snabbt isolera hjärnan, och doppa den i precarbonated (95% O 2/5% CO 2 gasblandning) iskall Gey lösning (sammansättning i mM: 130 NaCl, 4,9 KCl, 1,5 CaCl2 · 2H 2 O , 0,3 MgSO 4 • 2 H2O, 11 MgCl2 6 H2O, 0,23 KH 2 PO 4, 0,8 Na 2 HPO 4 · 7H 2 O, 5 glukos • H2O, 25 HEPES, 22 NaHCOg 3, pH 7,32) under 30 min 1,2,10,16.
- Ta bort lillhjärnan och en del av entorhinal cortex. Separera kortikala halvklot med en mid-sagittal snitt, sedan placera varje halvklotet ner på sin mediala ytan. Därefter gören 50-70 ° cut (50-70 ° tvärs) längs ryggens kanten av varje hemisfär 13,14.
- Limma varje halvklotet med nyklippt ytan på skiv plattform snittsystemet. Plattformen bör omfattas av precarbogenated iskall Gey lösning.
- Skär 350 nm 50-70 ° tvärgående skivor från främre till bakre sidan med en vibratome justeras för att minimera z-axeln svängning. Den hippocampus formation, subicular och entorhinal cortex, liksom cortex som ligger dorsolaterala till hippocampus kommer att ingå i de skivor som används för försök 13,14.
- Överför hippocampus skivor till en U-form och nedsänkt typ inkubatorn och inkubera under åtminstone 2 h vid 32 ° C med carbogenated artificiell cerebrospinalvätska (ACSF innehållande i mM: 110 NaCl, 2,5 KCl, 2,5 CaCl2 • 2 H2O, 1,5 MgSO 4 • 2 H2O, 1,24 KH 2 PO 4, 10 Glukos · H 2O, 27,4 NaHCOs 3, pH 7,3) 1,2,10,16.
2 Placering av elektroder, Baseline-inspelning, och induktion av LTP
- Överför hippocampus slice till en nedsänkt typ inspelning kammare monterad under ett mikroskop. BEGJUTA (6-7 ml / min) med carbogenated ACSF under minst 30 minuter vid 32 ° C.
- Förbered glaskapillär mikroelektroder fyllda med ACSF (spetsmotståndet är 3-5 Mohm).
- Placera ett glasmikroelektroder fyllda med ACSF i CA1 Schaffer-säkerheter fibrer för stimulans och i CA1 stratum radiatum för fEPSP inspelning 1,2,10 (Figur 2). Avståndet mellan elektroderna bör vara ungefär 300 pm.
- Evoke fält Excitatoriska Postsynaptiska Potentials (fEPSPs) genom stimulering av Schaffer-säkerhets fibrer med bifasisk rektangulära strömpulser (200 msek / polaritet) i ett intervall av 3-4 V.
- Utför den maximala stimuleringstestet genom mätning av input-output relation och definierar stimuleringsstyrkan som 40% av maximal fEPSP-lutningsvärden som erhållits och hålla den konstant under hela experimentet.
- Börja baslinjen inspelningen i minst 15 minuter efter det att maximal stimulering. Mät svaren att testa stimuli varje minut under hela experimentet. Utför utgångsvärdena med lågfrekvent stimulering.
- Spela baslinjen i minst 30 min.
- Tillämpa högfrekvent 100 Hz tetanization bestående av tre 1 sek stimulans tåg vid 100 Hz med en 5 min intertrain intervall för Late-LTP induktion. För att öka området för stimulering inom CA1 region 5 iM bicucullin kan tvättas i 2 min innan tetanization och bör tvättas omedelbart efter sista tetanization.
3 Insamling av skivor efter induktion av LTP och Snap Frysning
- Stoppa LTP inspelning 2 min eller 30 min efter tre tåg i tetanic stimulering framkallar Late-LTP.
- Samla varje skiva i en 1,5 ml rör och förvara vid -80 ° C.
4 Isolering av Nuclear anrikade fraktioner från CA1 regionen Hippocampus
- Ta 1,5 ml Eppendorf-rör med de frusna skivor från -80 ° C och hålla dem på is.
- Lägg 0,5 ml färsk kall TBS-buffert innehållande proteas (PI) och fosfatas (PS)-hämmare, i röret. Inkubera i 2-3 min och överför till en stereomikroskop. VIKTIGT: Använd skyddshandskar och skyddsrock vid arbete med PI och PS.
- Dissekera CA1 stratum pyramidale regionen av hippocampus med två nålar. Använd en nål för att hålla skivan i stereomikroskop och den andra nålen för att skära CA1-området.
- Samla dissekerade CA1-regioner från fem skivor (för varje grupp) i en ny 1,5 ml rör innehållande 50 pl lyseringsbuffert (1x hypotonisk lysbuffert innehållande i mM: 10 HEPES, 1,5 MgCl2, 10 KCl, pH 7,9, med PI och PS). Observera att denna mängd material kommer att vara tillräckligt för att köra 2-3 immunoblots.
- Homogenisera insamlad vävnad genom noggrann pipettering upp och ner. Använd en 200 jil pipett. Inkubera lysatet på is under 5-7 min för att tillåta cellerna att svälla.
- Ta 2 pl av lysat, släppa på ett objektglas, och visualisera svullnad av cellerna under en ljus fältmikroskop. Med rätt svullnad av cellerna kärnorna visas som runda intakta strukturer.
- Samla 20 pl prov i en färsk 1,5 ml rör som "homogenisatet fraktion". Lägg 8 | il av denaturerande 4x SDS-provbuffert.
- Centrifugera de återstående lysat vid 11.000 rpm under 1 min.
- Samlas försiktigt supernatanten från toppen ("cytosolisk fraktion"), transfer till ett nytt rör och tillsätt 20 | il 4x provbuffert.
- Resuspendera pelleten i 60 pl av hypoton buffert och tillsätt 20 pl av 4x provbuffert. Denna fraktion hänvisas till som en "kärn anrikad fraktion".
- Homogenat, cytosoliska och nukleära anrikade fraktionerna kan lagras vid -20 ° C eller -80 ° C för senare immunoblotting.
5. semikvantitativ Immunoblotting för Synapto-nukleära proteiner
- Defreeze proverna och koka dem i 5 min vid 95 ° C.
- Ta 5 pl från varje fraktion och bestämma proteinkoncentrationen genom amidosvart test eller BCA test.
- Fyll på lika mängd proteinprover från homogenatet, cytoplasmiska och nukleära anrikade fraktioner på SDS-PAGE. Prover från kontroll och LTP skivor ska placeras på samma gel för direkt jämförelse.
- Utför en standard western-blotting (våt överföring rekommenderas).
- Probe membranen med tHan antikropp val. Därefter samma blöts (eller samma prover löper parallellt) kan sonderas med en cytoplasmatisk markör - neuron specifik enolase2 (NSE2) och nukleära markör - NeuN och aktin antikropp som lastkontroll.
6. Data Analysis
- Effektivitet av LTP-induktion kan analyseras genom Clampfit programvara. Den genomsnittliga lutningen på utgångsvärdena jämfördes med backarna efter tetanization med tvåvägs ANOVA, p <0,05 ansågs signifikant annorlunda. The fEPSP slope värdena avbildas i diagram som medelvärde ± SEM
- För kvantifiering av immunoblottar, skanna den autoradiografiska filmen och analysera den integrerade täthet av proteinbanden från ImageJ eller fluorescensband med Licor-system. Värden för immunreaktiva band bör normaliseras för lastning och läsk kontroll. För jämförelse av kontrollen och LTP grupper en nonparametrical Mann-Whitney U-test skulle kunna användas.
| Namn på bufferten | Reagens | Koncentration (mM) | Mängd | Kommentar / Beskrivning |
| Gey lösning (pH: 7,3 ~ 7,4) | NaCl | 130 | 7,6 g | sterilfiltrering |
| 1000 ml | KCl | 4,9 | 0,37 g | |
| CaCl2 • 2 H2O | 1,5 | 0,22 g | ||
| MgSO 4 · 2H 2 O | 0,3 | 0,0739 g | ||
| MgCl2 · 6H 2 O | 11 | 2,24 g | ||
| KH 2 PO 4 | 0,23 | 0,0313 g | ||
| Na 2 HPO 4 · 7H 2 O | 0,8 | 0,2145 g | ||
| Glukos • H2O | 5 | 0,9909 g | ||
| HEPES | 25 | 5,96 g | ||
| NaHCOs 3 | 22 | 1,85 g | ||
| ACSF (pH: 7,3 ~ 7,4) | NaCl | 110 | 6,428 g | sterilfiltrering |
| 1000 ml | KCl | 2,5 | 0,1865 g | |
| CaCl2 • 2 H2O | 2,5 | 0,368 g | ||
| MgSO 4 · 2H 2 O | 1,5 | 0,370 g | ||
| KH 2 PO 4 | 1,24 | 0,169 g | ||
| Glukos • H2O | 10 | 1,9817 g | ||
| NaHCOs 3 | 27,4 | 2,3 g | ||
| 1x Hypoton buffert (pH: 7,9) | HEPES | 10 | 0,23 g | |
| 100 ml | MgCl2 · 6H 2 O | 1,5 | 0,0304 g | |
| KCl | 10 | 0,07455 g |
Tabell 1. Buffertar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi har tidigare visat att synapto-kärnprotein budbärare Jacob ackumuleras i kärnan efter induktionen av LTP, men inte LTD 1. Dessutom sloka Jakobs efter synaptiska stimulering kräver aktivering av MAPK ERK1 / 2 och fosforylering av Jacob på Ser180 (Figur 1). Fosforylerad Jacob translokerar till kärnan i en Importin beroende sätt och det fosforylerade tillståndet kan bevaras under utsträckta tidsperioder genom association med det mellanliggande fila αinternexin 15 (figur 1). Den fosfor-delstaten Jacob är viktigt för uttrycket av aktivitetsberoende gener och cellöverlevnad. Intressant aktivering av extrasynaptic NMDARs driver också Jacob in i kärnan, men i det här fallet Jacob inte fosforyleras vid Ser180 och dess kärnackumulering inducerar CREB "stänga av" 5,10. De ovan beskrivna resultaten erhölls genom protocols etablerade i vår senaste undersökning (se Karpova et al. 10 för detaljerad beskrivning av modellen).
För att bevisa att Jacob translokerar in i kärnan efter induktion av LTP, vi induceras och mäts induktionen av Schaffer säkerheter fEPSP potentiering i akuta hippocampus skivor och därefter isolerades neuronala kärnor från CA1-neuroner (figur 2 och 3). Vi jämförde två olika tidpunkter efter applicering av högfrekvent stimulering (2 min och 30 min) och registreras induktionen av LTP för varje skiva som senare bearbetades för nukleär isolering och Western-blotting (fig 2 och 3). Anrikning av neuronala nukleära markören NeuN kan ses i den nukleära anrikade fraktionen ställdes av dissekerade CA1-regionen, medan cytosoliskt markör neuron specifika enolase2 (NSE) är mestadels närvarande i supernatantfraktionen erhålls efter centrifugering av lyserade calnar (Figur 4A). Specificiteten för pS180 Jacob antikropp har karakteriserats tidigare (för detaljer se Karpova et al. 10). pS180 Jacob förblev oförändrat totalt CA1 proteinhomogen och inom kärnkrafts anrikade fraktionen 2 min efter tetanization (Figur 4B), men vi hittade en betydande ökning av pJacobS 180 immunreaktivitet 30 min efter induktion av LTP (Figur 4C), vilket bekräftar att Jacob translokerande till kärnan i denna cellulära plasticitet modell fosforyleras vid Ser180.
Figur 1 Jacob fosforyleras på S180 kodar synaptiska ursprung NMDARs signaler. Tetanic stimulering av hippocampus Schaffer säkerheter fibrer resulterar i aktivering av synaptiska NMDARs och efterföljande aktivering av MAPKERK1 / 2 signalkaskad. Aktiverad ERK1 / 2 binder till och fosforylerar Jacob på serin 180 och Jacob-ERK1 / 2 komplexet translokerar till kärnan och detta korrelerar med förbättrad CREB aktivitet och aktivering av plasticitet relaterade genuttryck.
Figur 2 Utrustning och verktyg som används för LTP induktion och dissekera CA1 regionen från hippocampus skivor. A) Vibratome som används för framställning av akut hippocampus skivor (1 - Vibratome) B1-2) Elektro och bildinställningar (2 - mikroskop, 3 - mikromanipulator och perfusionssystem, 4 - Omkodning elektrod, 5 - Stimulation elektrod, 6 - Vatten objektiv , 7 - Slice hållare med hippocampus slice) C) Utrustning som används för dissekering av CA1-regionen från hippocampus skivor (8 Stereomicroscope; 9 - Insulin spruta med nålar; 10 - Små kirurgiska saxar, 11 - Skalpell, 12 - plast Pasteur pipett, 13 - Tunn spatel, 14-100 mm plastodlingsskål fylld med isvatten, och 40 mm plast kultur maträtt som används för dissektion av skivor.
Figur 3 Tecknad visar den experimentella proceduren. Siffrorna anger steg i protokollet. 2,1-2,8) En akut hippocampus skiva i nedsänkt kammaren med glaselektroder placerade i stratum radiatum för potentiering av Schaffer säkerheter-CA1 synapser. Den infällda bilden representerar prov fEPSP analoga spår, den horisontella stapeln visar 5 ms och den vertikala stapeln visar 0,5 mV. 3,3) Skivorna uppsamlades i 1,5 ml rör efterLTP inspelning och snabbfrystes. 4,3) Dissekering av CA1-regionen från vuxna råtthippocampusskivor. 4,4-4,5) CA1 regioner homogeniseras i hypoton lyseringsbuffert, som orsakar osmotisk svullnad av celler och frisättning av kärnor. 4,8) Centrifugering av lysat vid 11.000 rpm under 1 min. 4.10) Insamling av de cytoplasmiska och nukleära anrikade fraktioner för immunoblotting. 5.3) Lastning av cytoplasmiska och nukleära anrikade fraktioner på SDS-PAGE och efterföljande standard western-blotting.
Figur 4 Induktion av CA1 LTP leder till ansamling av pJacS180 i kärnan. A) Immunoblot för homogenatet, cytosoliska och nukleära anrikade fraktioner av CA1-lysat sonderades med cytosoliska och nukleära markörer. B) Immunoblotanalys av pJac-S180 nivå i homogenatet 2 min och 30 min efter induInsatser för tetanization. C) Immunoblotanalys av pJacS180 nivå inom kärn fraktion 2 min och min efter tetanization. Dessa resultat är en del av kvantifiering grafen publicerats i Karpova m.fl. 10. Dessa representativa immunoblottar ingår inte i den ursprungliga publiceringen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De åtgärder som beskrivs i protokollet ovan ger vägledning hur man förbereder hippocampus akut klippt från unga eller vuxna råttor, framkalla och spela LTP, snabbt dissekera stimulerad område skiva, och förbereda nukleär fraktion för att studera aktivitetsberoende proteindynamik. Detta tillvägagångssätt härrör från kombination av flera olika metoder som används oberoende av varandra. Vi optimerat ett arbetsflöde och ger tillräckligt detaljerad för nybörjaren att inrätta egna experiment för att studera subcellulära omfördelning av proteiner vid induktion av LTP. Som exempel visar vi att den sena formen av LTP inducerar kärn ansamling av S180 fosforyleras Jacob. För att skilja mellan fosforylering av en redan existerande kärnvapen pool av ett givet protein och på flyttning av dess fosforylerade formen efter synaptisk aktivitet, kan kombineras denna metod med kontroll för total nivå på protein av intresse i kärn anrikade fraktionen. Dessutom gäller, Testing prov under olika tidpunkter efter LTP induktion kan vara mycket insiktsfulla för att studera tidsförloppet av protein aktivering / inaktivering eller nukleära omsättning.
Under utarbetandet av kärn anrikade fraktioner från stimulerade skivor finns det flera metodologiska problem som måste lösas. Först, för att öka antalet stimulerade nervceller i CA1-regionen och den mängd av material för immunblotting, tillämpar vi 5 | iM av GABA ^-receptorblockerare biccuculine under tetanization. Biccuculine har visats öka excitatoriska postsynaptiska potentialer 3.
För det andra, är bevarandet av skivor efter induktion av LTP genom snabb frysning ett kritiskt steg för framgångsrika experiment eftersom mekanisk hantering av skivor kan framkalla olika typer av verksamhet som direkt korrelerar med förändringar i protein modifieringar. För att förkorta förfarandet så mycket som möjligt använder vi en metallstång placerades på torris. Slices kan överföras på en droppe ACSF använda plast en pasteurpipett och frysas inom ett fåtal andra när de placeras på förkyld metall.
Det tredje viktiga steget är att berika kärnor i CA1 lysat. Vi rekommenderar att övervaka cell svullnad under mikroskop och att hitta den mest optimala tidpunkten. Ibland när homogenisering av vävnad inte gjordes på rätt sätt, förblir cellrester kvar i proverna. Då den nukleära pelleten kan återsuspenderas i lysbuffert igen, tvättades under några minuter, och centrifugerades sedan för att få en renare nukleära fraktionen.
Sammantaget detta protokoll kan bidra till att ytterligare explorer betydelsen av olika synapto kärnkraft budbärare proteiner i synaptisk plasticitet. Samma förfarande kan tillämpas inte bara på en högfrekvent stimulering inducerad LTP, men alla andra former av synaptisk plasticitet som LTD, theta-burst LTP, kortsiktiga plasticitet modeller, och andra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| CED 1401 AD/DA converter | Cambridge Electronics Design, UK | ||
| Stereomicroscope | Leica S4E, Germany | ||
| Vibrotome | Leica VT1000S, Germany | ||
| Isolated pulse stimulator | A-M Systems, USA | Model 2100 | |
| Centrifuge | Thermo Scientific | ||
| SDS-PAGE system | Biorad | ||
| Cooler | Julabo | ||
| Bright field Microscope | Nikon Eclipse TS100 | ||
| Cell culture incubator | Thermo Electron Corporation | ||
| Micromanipulator | Luigs & Neumann, SM-5, Germany | ||
| Blotting chamber and electric power supplier | Hoefer Scientific Instruments, San Francisco, CA | ||
| Submerged type recording chamber | custom made | ||
| U-shape and submerged type incubator | custom made | ||
| Small surgical scissors | |||
| Scalpel | |||
| Thin spatula | |||
| Plastic Pasteur pipette | |||
| Plastic culture dish | |||
| Bunsen beaker | |||
| Syringe | |||
| Reagents | |||
| NaCl | Roth | Art.-Nr.3957.1 | ≥99.5%, p.a., ACS, ISO |
| KCl | Roth | Art.-Nr.6781.1 | ≥99.5%, p.a., ACS, ISO |
| CaCl2·2H2O | Merck | 1.02382.0500 | pro analysis |
| MgSO4·2H2O | Merck | 5886.05 | pro analysis |
| MgCl2·6H2O | AppliChem | CAS-NO: 7791-18-6; EC-NO:2320946 | for molecular biology |
| KH2PO4 | Merck | 12034.025 | for molecular biology |
| Na2HPO4·2H2O | Merck | 1.06574.1000 | extra pure |
| Glucose·H2O | Roth | Art.-Nr.6887.1 | for molecular biology |
| HEPES | Roth | Art.-Nr.9105.4 | PUFFERAN, ≥99.5%, p.a. |
| NaHCO3 | Merck | 1.06329.1000 | pro analysis |
| Protease inhibitor cocktail | Roche | ||
| Phosphostop | Roche | ||
| Bicuculline | Tocris Bioscience | ||
| Isoflurane | Baxter | ||
| Antibodies | |||
| Primary antibodies | Company | Catalog Number | Species |
| pJac-s180 | Biogenes | rabbit (diluted 1:100) | |
| NeuN | Milipore | MAB377 | mouse (diluted 1:1,000) |
| NSE | Cell Signaling | D20H2 | rabbit (diluted 1:1,000) |
| Beta-actin | Sigma | A-5441 | mouse (diluted 1:5,000) |
| Secondary antibodies | Company | Catalog Number | Species |
| IgG HRP conjugated | DAKO | goat anti-mouse (1:5,000) | |
| IgG HRP conjugated | NEB | goat anti-rabbit (1:5,000) | |
References
- Behnisch, T., et al. Nuclear translocation of Jacob in hippocampal neurons after stimuli inducing long-term potentiation but not long-term depression. PLoS One. 6 (2), e17276 (2011).
- Cai, F., Frey, J. U., Sanna, P. P., Behnisch, T. Protein degradation by the proteasome is required for synaptic tagging and the heterosynaptic stabilization of hippocampal late-phase long-term potentiation. Neuroscience. 169 (4), 1520-1526 (2010).
- Chapman, C. A., Perez, Y., Lacaille, J. C. Effects of GABA(A) inhibition on the expression of long-term potentiation in CA1 pyramidal cells are dependent on tetanization parameters. Hippocampus. 8 (3), 289-298 (1998).
- Ch'ng, T. H., Uzgil, B., Lin, P., Avliyakulov, N. K., O'Dell, T. J., Martin, K. C. Activity-dependent transport of the transcriptional coactivator CRTC1 from synapse to nucleus. Cell. 150 (1), 207-221 (2012).
- Dieterich, D. C., et al. Caldendrin-Jacob: a protein liaison that couples NMDA receptor signalling to the nucleus. PLoS Biol. 6 (2), e34 (2008).
- Fainzilber, M., Budnik, V., Segal, R. A., Kreutz, M. R. From synapse to nucleus and back again--communication over distance within neurons. J. Neurosci. 31 (45), 16045-16048 (2011).
- Hardingham, G. E., Bading, H. Synaptic versus extrasynaptic NMDA receptor signalling: implications for neurodegenerative disorders. Nat. Rev. Neurosci. 11 (10), 682-696 (2010).
- Ivanov, A., et al. Opposing role of synaptic and extrasynaptic NMDA receptors in regulation of the extracellular signal-regulated kinases (ERK) activity in cultured rat hippocampal neurons. J. Physiol. 57, 789-798 (2006).
- Jordan, B. A., Kreutz, M. R. Nucleocytoplasmic protein shuttling: the direct route in synapse-to-nucleus signaling. Trends Neurosci. 32 (7), 392-401 (2009).
- Karpova, A., et al. Encoding and transducing the synaptic or extrasynaptic origin of NMDA receptor signals to the nucleus. Cell. 152 (5), 1119-1133 (2013).
- Kim, M. J., Dunah, A. W., Wang, Y. T., Sheng, M. Differential roles of NR2A- and NR2B-containing NMDA receptors in Ras-ERK signaling and AMPA receptor trafficking. Neuron. 46, 745-760 (2005).
- Lai, K. O., Zhao, Y., Ch'ng, T. H., Martin, K. C. Importin-mediated retrograde transport of CREB2 from distal processes to the nucleus in neurons. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105 (44), 17175-17180 (2008).
- Leutgeb, J. K., Frey, J. U., Behnisch, T. LTP in cultured hippocampal-entorhinal cortex slices from young adult (P25-30) rats. J. Neurosci. Methods. 130 (1), 19-32 (2003).
- Leutgeb, J. K., Frey, J. U., Behnisch, T. Single cell analysis of activity-dependent cyclic AMP-responsive element-binding protein phosphorylation during long-lasting long-term potentiation in area CA1 of mature rat hippocampal-organotypic cultures. Neuroscience. 131 (3), 601-610 (2005).
- Perlson, E., Hanz, S., Ben-Yaakov, K., Segal-Ruder, Y., Seger, R., Fainzilber, M. Vimentin-dependent spatial translocation of an activated MAP kinase in injured nerve. Neuron. 45 (5), 715-726 (2005).
- Xiang, Z., et al. Long-term maintenance of mature hippocampal slices in vitro. J. Neurosci. Methods. 98 (2), 145-154 (2000).
- Zhao, M., Adams, J. P., Dudek, S. M. Pattern-dependent role of NMDA receptors in actin potential generation: consequences on extracellular signal-regulated kinase activation. J. Neurosci. 25 (30), 7032-7039 (2005).
