Summary
हम हिप्पोकैम्पस के CA1 क्षेत्र और टुकड़ा के tetanized क्षेत्र से परमाणु समृद्ध अंशों के बाद अलगाव में लंबी अवधि potentiation के शामिल होने के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं. यह दृष्टिकोण गतिविधि सीखने और स्मृति के सेलुलर मॉडल में निर्भर परमाणु प्रोटीन आयात निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
Abstract
पढ़ रही गतिविधि निर्भर प्रोटीन अभिव्यक्ति, subcellular स्थानान्तरण, या फास्फारिलीकरण synaptic plasticity की अंतर्निहित सेलुलर तंत्र को समझने के लिए आवश्यक है. दीर्घकालिक potentiation (एलटीपी) और तीव्र hippocampal स्लाइस में प्रेरित लंबे समय तक अवसाद (लिमिटेड) व्यापक रूप से सीखने और स्मृति के सेलुलर मॉडल के रूप में स्वीकार कर रहे हैं. गतिविधि निर्भर प्रोटीन गतिशीलता कल्पना करने के लिए लाइव सेल इमेजिंग या immunohistochemistry दृष्टिकोण का उपयोग करने वाले कई अध्ययन कर रहे हैं. हालांकि इन तरीकों एकल न्यूरॉन्स में प्रतिदीप्ति टैग प्रोटीन की immunocytochemistry या overexpression के लिए एंटीबॉडी की उपयुक्तता पर भरोसा करते हैं. प्रोटीन की Immunoblotting निष्कर्षों की स्वतंत्र पुष्टि प्रदान करने के लिए एक वैकल्पिक तरीका है. व्यक्तिगत tetanized hippocampal स्लाइस से subcellular भिन्न की तैयारी में पहले सीमित कारक सामग्री की कम राशि है. दूसरा, से निपटने की प्रक्रिया महत्वपूर्ण है एल की भी बहुत कम और छोटे जोड़तोड़ क्योंकिस्लाइस iving कुछ cascades संकेत के सक्रियण प्रेरित हो सकता है. यहाँ हम चूहे के मस्तिष्क से तीव्र hippocampal स्लाइस की CA1 क्षेत्र से पर्याप्त शुद्धता के परमाणु समृद्ध अंश की पर्याप्त मात्रा में प्राप्त करने के लिए एक अनुकूलित कार्यप्रवाह वर्णन. एक प्रतिनिधि उदाहरण के रूप में हम synapto परमाणु प्रोटीन मैसेंजर के ERK1 / 2 phosphorylated फार्म याकूब सक्रिय रूप एलटीपी के शामिल होने पर नाभिक को translocates और सीए 1 न्यूरॉन्स से एक परमाणु समृद्ध अंश में पता लगाया जा सकता है.
Introduction
Synaptic एन मिथाइल-D-aspartate रिसेप्टर्स (NMDARs) synaptic plasticity और सेल अस्तित्व neurodegeneration और कोशिका मृत्यु को गति प्रदान कर सकते हैं extrasynaptic NMDARs की सक्रियता जबकि संकेत में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं. इन परिवर्तनों को कसकर नियंत्रित / विनियमित गतिविधि निर्भर जीन अभिव्यक्ति पर निर्भर करती है और इस प्रकार सक्रिय synapses या डेन्ड्राइट और नाभिक 7 के बीच निरंतर संवाद की आवश्यकता होती है. एमएपी ERK1 / 2 संकेत synaptic NMDARs के बहाव प्रभावोत्पादक हैं और extrasynaptic NMDAR के माध्यम से संकेत नहीं या ERK1 / 2 गतिविधि 8,11 पर एक निरोधात्मक प्रभाव पड़ता है, जबकि NMDAR सक्रियण प्रेरित जीन अभिव्यक्ति में शामिल हैं kinases.
बाहर का डेन्ड्राइट और नाभिक के बीच शटल दिखाया गया है कि प्रोटीन की संख्या में हैं. इन प्रोटीनों की कई एक परमाणु स्थानीयकरण संकेत होते हैं और सक्रिय रूप से नाभिक 6,9 करने के लिए एक dynein और importin निर्भर ढंग से microtubuli साथ ले जाया जाता है. Interestinglवाई, विशिष्ट synaptic उत्तेजनाओं के जवाब में नाभिक को इन दूतों में से कुछ ही पारगमन. उदाहरण के लिए, चक्रीय एएमपी प्रतिक्रिया तत्व बाध्यकारी प्रोटीन 2 (CREB2) के प्रतिगामी परिवहन रासायनिक लिमिटेड लेकिन नहीं एलटीपी 12 से प्रेरित है. स्थानीयकृत NMDAR निर्भर synaptic उत्तेजना लंबी अवधि के हिप्पोकैम्पस प्लास्टिसिटी 4 में शामिल है जो नाभिक, एक स्थानान्तरण प्रक्रिया में CREB विनियमित ट्रांसक्रिप्शनल coactivator (CRTC1) चलाता है. यह हाल ही में प्रोटीन दूत याकूब दोनों के बाद नाभिक, synaptic और extrasynaptic NMDAR सक्रियण को translocates और CREB निर्भर जीन प्रतिलेखन 5 को नियंत्रित करता है कि दिखाया गया था. संकेत के synaptic या extrasynaptic मूल याकूब के posttranslational संशोधन में इनकोडिंग है. Synaptic गतिविधि प्राथमिक हिप्पोकैम्पस संस्कृति में नाभिक के बाद स्थानान्तरण के लिए एक अपेक्षित है जो स्थिति 180 (pJacobS 180) पर एक महत्वपूर्ण सेरीन पर याकूब के ERK1 / 2 निर्भर फास्फारिलीकरण लाती है. इसके अलावा, मैंn सीए 1 Schaffer जमानत एलटीपी के बाद नाभिक को तीव्र hippocampal स्लाइस pJacobS 180 translocates के न्यूरॉन्स लेकिन नहीं 1,10 लि. pS180 याकूब प्लास्टिसिटी संबंधित जीन का एक बढ़ा अभिव्यक्ति की ओर जाता है और इस जीन अभिव्यक्ति synaptic समारोह को वापस खिलाती है. Extrasynaptic NMDARs सक्रियण Ser180 पर phosphorylated नहीं है और पैदा नाभिक में विभिन्न प्रोटीन जटिल के साथ जुड़ा हो सकता है के बाद नाभिक को translocates कि इसके विपरीत, याकूब में 'CREB बंद' और synaptic संपर्कों 10 के त्याग.
Synapto परमाणु प्रोटीन मैसेंजर के परमाणु आयात पर अधिकांश प्रकाशित अध्ययन अलग न्यूरोनल प्राथमिक संस्कृतियों में किया गया है. न्यूरोनल कनेक्टिविटी और समारोह में ज्यादा बेहतर संरक्षित कर रहे हैं जहां इसलिए यह इस तरह के निष्कर्ष हिप्पोकैम्पस स्लाइस का उपयोग physiologically अधिक प्रासंगिक परिस्थितियों में reproduced किया जा सकता है देखने के लिए दिलचस्प होगा. यहाँ हम एलटीपी-de आकलन करने के लिए एक अनुकूलित प्रोटोकॉल पेशimmunoblotting द्वारा प्रोटीन दूतों के परमाणु स्थानान्तरण लटकता हुआ. इस पद्धति का भी एक कच्चे परमाणु अंश में प्रोटीन की गतिविधि पर निर्भर फास्फारिलीकरण विश्लेषण करने के लिए उपयुक्त है. विशेष रूप से, वर्तमान प्रोटोकॉल तीव्र सीए 1 hippocampal स्लाइस, प्रेरण, और एलटीपी की रिकॉर्डिंग की तैयारी शामिल है. अगला, सीए 1 क्षेत्र microscopically प्रेरित क्षेत्र को अलग करने के विच्छेदित है. हम संयुक्त और झाओ और उनके सहयोगियों ने 17 से पेश परिवर्तन के साथ CellLytic परमाणु निकालना किट द्वारा प्रदान की जाने वाली परमाणु अलगाव के लिए प्रोटोकॉल संशोधित. अनुकूलित प्रक्रिया सेल सूजन और नाभिक की रिहाई की अनुमति hypotonic बफर में विच्छेदित सीए 1 क्षेत्रों की सेल भी शामिल है. सेल और नाभिक आकारिकी सूक्ष्म परीक्षण से निर्धारित किया जा सकता है. परमाणु संवर्धन एक छोटी centrifugation कदम से हासिल की है. NeuN और NSE2, परमाणु या साइटोसोलिक भिन्न की विशिष्ट मार्कर के खिलाफ एंटीबॉडी के साथ विश्लेषण Immunoblotting इस दृष्टिकोण एक उपवास के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है कि इंगित करता हैऔर प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य प्रोटोकॉल इन subcellular भिन्न को अलग करने और प्रोटीन फास्फारिलीकरण की तरह बहुत अस्थिर posttranslational संशोधनों का अध्ययन करने के लिए. साथ ही, इस विधि हिप्पोकैम्पस स्लाइस की विच्छेदित सीए 1 क्षेत्रों से पाने छोटे ऊतकों के नमूनों के लिए फायदेमंद है और हिप्पोकैम्पस स्लाइस की immunohistochemistry के लिए संयोजन में इस्तेमाल किया जा सकता है.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
वयस्क चूहे के मस्तिष्क से तीव्र hippocampal स्लाइस की 1. तैयारी
- Isoflurane के साथ चूहों anesthetize. चेतावनी: एक बंद exicator का उपयोग प्रक्रिया को पूरा करें, isoflurane साँस लेना नहीं है. जानवर पूरी तरह से anesthetized है कि सुनिश्चित करें.
- जल्दी, चूहे सिर काटना मस्तिष्क को अलग, और precarbonated (95% 2 हे / 5% सीओ 2 गैस मिश्रण) ठंडा मिमी में Gey समाधान (रचना में विसर्जित: 130 NaCl, 4.9 KCl, 1.5 2 CaCl · 2H 2 हे , 0.3 4 MgSO · 2H 2 हे, 11 2 MgCl · 6 2 हे, 0.23 के.एच. 2 4 पीओ, 0.8 ना 2 HPO 4 · 7 2 हे, 5 ग्लूकोज · एच 2 ओ, 25 HEPES, 22 NaHCO 3, पीएच 7.32) 30 मिनट 1,2,10,16 के लिए.
- Entorhinal प्रांतस्था के सेरिबैलम और भाग निकालें. फिर इसकी औसत दर्जे की सतह पर प्रत्येक गोलार्द्ध नीचे जगह है, एक मध्य बाण के समान कटौती के साथ कॉर्टिकल गोलार्द्धों अलग. इसके बाद बनानाप्रत्येक गोलार्द्ध 13,14 के पृष्ठीय बढ़त के साथ एक 50-70 ° कटौती (50-70 ° अनुप्रस्थ).
- सेक्शनिंग प्रणाली का टुकड़ा करने की क्रिया मंच पर ताजा कटौती की सतह के साथ प्रत्येक गोलार्द्ध गोंद. मंच precarbogenated ठंडा Gey समाधान द्वारा कवर किया जाना चाहिए.
- Z-अक्ष दोलन को कम करने के लिए समायोजित एक vibratome का उपयोग पक्ष पीछे तक पूर्वकाल से 350 माइक्रोन 50-70 ° अनुप्रस्थ स्लाइस काटें. हिप्पोकैम्पस गठन, subicular और entorhinal cortices, साथ ही हिप्पोकैम्पस को dorsolateral स्थित हैं कि cortices प्रयोगों 13,14 के लिए इस्तेमाल किया स्लाइस का हिस्सा होगा.
- एक यू आकार और जलमग्न प्रकार इनक्यूबेटर हिप्पोकैम्पस स्लाइस स्थानांतरण और carbogenated कृत्रिम मस्तिष्कमेरु द्रव (ACSF मिमी में रोकने के साथ 32 डिग्री सेल्सियस पर कम से कम 2 घंटे के लिए सेते: 2H 2 हे, 1.5 MgSO · 110 NaCl, 2.5 KCl, 2.5 2 CaCl 4 · 2H 2 हे, 1.24 के.एच. 2 4 पीओ, 10 ग्लूकोज · एच 2हे, 27.4 NaHCO 3, पीएच 7.3) 1,2,10,16.
2 इलेक्ट्रोड की स्थिति, आधारभूत रिकॉर्डिंग, और एलटीपी की प्रेरण
- एक खुर्दबीन के नीचे घुड़सवार एक जलमग्न प्रकार रिकॉर्डिंग कक्ष हिप्पोकैम्पस टुकड़ा स्थानांतरण. 32 डिग्री सेल्सियस पर कम से कम 30 मिनट के लिए carbogenated ACSF साथ (6-7 मिलीग्राम / मिनट) छिड़कना.
- (टिप प्रतिरोध MΩ 3-5 है) ACSF से भरा गिलास केशिका microelectrodes तैयार करें.
- उत्तेजना के लिए और fEPSP के लिए सीए 1 परत radiatum रिकॉर्डिंग 1,2,10 (चित्रा 2) में सीए 1 Schaffer-जमानत फाइबर में ACSF से भरा एक गिलास microelectrodes रखें. इलेक्ट्रोड के बीच की दूरी लगभग 300 मीटर होना चाहिए.
- 3-4 वी के एक रेंज में Biphasic आयताकार वर्तमान दालों (200 मिसे / ध्रुवता) के साथ Schaffer-जमानत तंतुओं की उत्तेजना से क्षेत्र उत्तेजक postsynaptic क्षमता (fEPSPs) आह्वान
- Inp मापने के द्वारा अधिकतम उत्तेजना परीक्षण प्रदर्शनकेन्द्र शासित प्रदेशों के उत्पादन रिश्ते और प्राप्त अधिकतम fEPSP ढलान मूल्यों के 40% के रूप में उत्तेजना शक्ति को परिभाषित करने और प्रयोग भर में लगातार रहते हैं.
- अधिकतम उत्तेजना परीक्षण के बाद कम से कम 15 मिनट के लिए आधारभूत रिकॉर्डिंग शुरू. प्रयोग के दौरान हर मिनट उत्तेजनाओं परीक्षण करने के लिए प्रतिक्रियाओं को मापने. कम आवृत्ति उत्तेजना के साथ आधारभूत रिकॉर्डिंग प्रदर्शन करना.
- कम से कम 30 मिनट के लिए आधारभूत रिकार्ड.
- देर एलटीपी शामिल करने के लिए उच्च आवृत्ति एक 5 मिनट intertrain अंतराल के साथ 100 हर्ट्ज पर तीन 1 सेकंड प्रोत्साहन ट्रेनों से मिलकर 100 हर्ट्ज tetanization लागू होते हैं. सीए 1 क्षेत्र 5 माइक्रोन bicuculline भीतर उत्तेजना के क्षेत्र को बढ़ाने के लिए tetanization से पहले 2 मिनट में धोया जा सकता है और तुरंत पिछले tetanization के बाद बाहर धोया जाना चाहिए.
एलटीपी और स्नैप ठंड की प्रेरण के बाद स्लाइस की 3 संग्रह
- बंद करो एलटीपी 2 मिनट या देर एलटीपी उत्प्रेरण धनुस्तंभीय उत्तेजना की तीन गाड़ियों के बाद 30 मिनट की रिकॉर्डिंग.
- -80 डिग्री सेल्सियस पर एक 1.5 मिलीलीटर ट्यूब और दुकान में प्रत्येक टुकड़ा लीजिए.
हिप्पोकैम्पस के CA1 क्षेत्र से परमाणु समृद्ध भागों के 4 अलगाव
- -80 डिग्री सेल्सियस से जमे स्लाइस के साथ 1.5 मिलीलीटर Eppendorf ट्यूब ले लो और उन्हें बर्फ पर रहते हैं.
- जोड़ें ट्यूब में ताजा ठंड टीबीएस बफर युक्त प्रोटीज (पीआई) और फॉस्फेट (पी एस) अवरोधकों के 0.5 मिलीलीटर. 2-3 मिनट के लिए सेते हैं और एक stereomicroscope के लिए स्थानांतरण. चेतावनी: उपयोग सुरक्षात्मक दस्ताने और पीआई और पी एस के साथ काम करते हुए एक प्रयोगशाला कोट.
- दो सुइयों का उपयोग हिप्पोकैम्पस के सीए 1 परत pyramidale क्षेत्र काटना. Stereomicroscope और सीए 1 क्षेत्र को काटने के लिए दूसरी सुई के तहत टुकड़ा रखने के लिए एक सुई का प्रयोग करें.
- विच्छेदित सीए लीजिए50 μl lysis बफर युक्त एक नया 1.5 मिलीलीटर ट्यूब में (प्रत्येक समूह के लिए) 5 स्लाइस से 1 क्षेत्रों (मिमी में युक्त hypotonic lysis बफर 1x: 10 HEPES, 1.5 2 MgCl, 10 KCl, पीआई और पी एस के साथ पीएच 7.9,). सामग्री की इस राशि 2-3 immunoblots चलाने के लिए पर्याप्त होगा कि ध्यान दें.
- नीचे सावधान pipetting ऊपर और द्वारा एकत्र ऊतक homogenize. एक 200 μl विंदुक का प्रयोग करें. कोशिकाओं को प्रफुल्लित करने के लिए अनुमति देने के लिए 5-7 मिनट के लिए बर्फ पर lysate सेते हैं.
- , Lysate के 2 μl लो एक सूक्ष्म स्लाइड पर छोड़ देता है, और एक उज्जवल क्षेत्र खुर्दबीन के नीचे कोशिकाओं की सूजन कल्पना. कोशिकाओं के समुचित सूजन के साथ नाभिक के रूप दौर बरकरार संरचनाओं दिखाई देते हैं.
- 'Homogenate अंश' के रूप में एक ताजा 1.5 मिलीलीटर ट्यूब में नमूना की 20 μl लीजिए. 4x एसडीएस नमूना बफर denaturing के 8 μl जोड़ें.
- 1 मिनट के लिए 11,000 rpm पर शेष lysates अपकेंद्रित्र.
- ध्यान से, टीआर शीर्ष ('साइटोसोलिक अंश') से सतह पर तैरनेवाला इकट्ठाansfer एक नया ट्यूब में और 4x नमूना बफर के 20 μl जोड़ें.
- Hypotonic बफर के 60 μl में गोली Resuspend और 4x नमूना बफर के 20 μl जोड़ें. यह अंश एक 'परमाणु समृद्ध अंश' के रूप में जाना जाता है.
- Homogenate, साइटोसोलिक, और परमाणु समृद्ध भिन्न या -80 बाद में immunoblotting के लिए -20 डिग्री सेल्सियस डिग्री सेल्सियस पर भंडारित किया जा सकता है.
Synapto परमाणु प्रोटीन के लिए 5 Semiquantitative Immunoblotting
- नमूने Defreeze और 95 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए उन्हें फोड़ा.
- प्रत्येक अंश से 5 μl लो और amido काला परीक्षण या बीसीए की परीक्षा से प्रोटीन एकाग्रता का निर्धारण.
- एसडीएस पृष्ठ पर homogenate से प्रोटीन के नमूने के बराबर राशि, cytoplasmic और परमाणु समृद्ध भिन्न लोड करें. नियंत्रण और एलटीपी स्लाइस से नमूने प्रत्यक्ष तुलना के लिए एक ही जेल पर रखा जाना चाहिए.
- एक मानक पश्चिमी सोख्ता कार्यविधि को पूरा (गीला स्थानांतरण की सिफारिश की है).
- टी के साथ झिल्ली की जांचवह चुनाव के एंटीबॉडी. न्यूरॉन विशिष्ट enolase2 (NSE2) और परमाणु मार्कर - - NeuN और एक लोडिंग नियंत्रण के रूप में एक -actin एंटीबॉडी इसके बाद एक ही दाग (या समानांतर में चलाने के लिए एक ही नमूने) एक cytoplasmic मार्कर के साथ जांच की जा सकती है.
6 डेटा विश्लेषण
- एलटीपी प्रेरण की क्षमता Clampfit सॉफ्टवेयर से विश्लेषण किया जा सकता है. आधारभूत रिकॉर्डिंग की औसत ढलान tetanization के बाद ढलानों दो तरह एनोवा, पी का उपयोग कर के साथ तुलना में किया गया था <0.05 काफी अलग माना जाता था. fEPSP ढलान मूल्यों ± SEM के मतलब के रूप में चित्र में दिखाया गया
- Immunoblots की मात्रा का ठहराव के लिए, autoradiographic फिल्म या तो स्कैन और एक Licor प्रणाली के साथ ImageJ या प्रतिदीप्ति बैंड द्वारा प्रोटीन बैंड के एकीकृत घनत्व का विश्लेषण. Immunoreactive बैंड के मूल्यों लदान और सोख्ता नियंत्रण के लिए सामान्यीकृत किया जाना चाहिए. नियंत्रण की तुलना और एलटीपी समूहों के लिए एक nonparametrical मान व्हिटनी यू टेस्ट इस्तेमाल किया जा सकता है.
| बफर का नाम | अभिकर्मक | एकाग्रता (मिमी) | राशि | टिप्पणियाँ / विवरण |
| Gey समाधान (पीएच: ~ 7.4 7.3) | NaCl | 130 | 7.6 जी | बाँझ निस्पंदन |
| 1000 मिलीलीटर | KCl | 4.9 | 0.37 छ | |
| 2 CaCl · 2H 2 हे | 1.5 | 0.22 छ | ||
| 4 MgSO · 2H 2 हे | 0.3 | 0.0739 जी | ||
| 2 MgCl · 6 2 हे | 11 | 2.24 छ | ||
| के.एच. 2 4 पीओ | 0.23 | 0.0313 जी | ||
| ना 2 HPO 4 · 7 2 हे | 0.8 | 0.2145 जी | ||
| ग्लूकोज · एच 2 ओ | 5 | 0.9909 जी | ||
| HEPES | 25 | 5.96 छ | ||
| 3 NaHCO | 22 | 1.85 छ | ||
| ACSF (पीएच: ~ 7.4 7.3) | NaCl | 110 | 6.428 ग्राम | बाँझ निस्पंदन |
| 1000 मिलीलीटर | KCl | 2.5 | 0.1865 जी | |
| 2 CaCl · 2H 2 हे | 2.5 | 0.368 ग्राम | ||
| 4 MgSO · 2H 2 हे | 1.5 | 0.370 ग्राम | ||
| के.एच. 2 4 पीओ | 1.24 | 0.169 ग्राम | ||
| ग्लूकोज · एच 2 ओ | 10 | 1.9817 जी | ||
| 3 NaHCO | 27.4 | 2.3 जी | ||
| 1x Hypotonic बफर (पीएच 7.9) | HEPES | 10 | 0.23 छ | |
| 100 मिलीलीटर | 2 MgCl · 6 2 हे | 1.5 | 0.0304 जी | |
| KCl | 10 | 0.07455 ग्राम |
तालिका 1 बफ़र.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
हम पहले synapto परमाणु प्रोटीन दूत याकूब एलटीपी की प्रेरण नहीं बल्कि लिमिटेड 1 निम्नलिखित नाभिक में जम जाता है कि पता चला है. इसके अलावा, synaptic उत्तेजना के बाद याकूब का स्थानान्तरण Ser180 (चित्रा 1) में MAPK ERK1 / 2 की सक्रियता और याकूब के फास्फारिलीकरण की आवश्यकता है. Phosphorylated याकूब एक importin निर्भर ढंग से नाभिक को translocates और phosphorylated राज्य 15 αinternexin मध्यवर्ती रेशा साथ एसोसिएशन (चित्रा 1) से समय की विस्तारित अवधि में संरक्षित रखा जा सकता है. याकूब के phospho राज्य गतिविधि पर निर्भर जीन और सेल अस्तित्व की अभिव्यक्ति के लिए महत्वपूर्ण है. दिलचस्प बात यह है extrasynaptic NMDARs की सक्रियता भी नाभिक में याकूब ड्राइव, लेकिन इस मामले में याकूब Ser180 पर phosphorylated नहीं है और अपने परमाणु संचय CREB लाती 5,10 'बंद'. ऊपर वर्णित परिणाम protoco द्वारा प्राप्त किया गयाहमारे हाल के अध्ययन में स्थापित LS (देखें Karpova एट अल. 10 मॉडल का विस्तृत विवरण के लिए).
याकूब एलटीपी के शामिल होने के बाद नाभिक में translocates कि साबित करने के लिए, हम (आंकड़े 2 और 3). प्रेरित और तीव्र hippocampal स्लाइस में Schaffer जमानत fEPSP potentiation की प्रेरण मापा और बाद में सीए 1 न्यूरॉन्स से neuronal नाभिक पृथक हम उच्च आवृत्ति उत्तेजना का आवेदन (2 मिनट और 30 मिनट) के बाद दो अलग अलग समय अंक की तुलना में और बाद में परमाणु अलगाव और पश्चिमी सोख्ता के लिए संसाधित किया गया था कि प्रत्येक टुकड़ा के लिए एलटीपी की प्रेरण दर्ज (आंकड़े 2 और 3). साइटोसोलिक मार्कर न्यूरॉन विशिष्ट enolase2 (एनएसई) lysed सी के centrifugation के बाद प्राप्त सतह पर तैरनेवाला अंश में ज्यादातर मौजूद है जबकि न्यूरोनल परमाणु मार्कर NeuN का संवर्धन, विच्छेदित CA1 क्षेत्र से तैयार परमाणु समृद्ध अंश में देखा जा सकता हैएल्स (चित्रा -4 ए). (विवरण Karpova एट अल देखने के लिए. 10) pS180 याकूब एंटीबॉडी की विशिष्टता पहले से बताया गया है. pS180 याकूब स्तर कुल सीए 1 प्रोटीन homogenates में और tetanization (चित्रा 4 बी) के बाद परमाणु समृद्ध अंश 2 मिनट में अनछुए रह गए, लेकिन हम चाहते हैं कि याकूब की पुष्टि, 30 मिनट एलटीपी (चित्रा 4C) के शामिल होने के बाद pJacobS 180 immunoreactivity में उल्लेखनीय वृद्धि पाया इस सेलुलर plasticity मॉडल में नाभिक को translocating Ser180 पर phosphorylated है.
याकूब S180 पर phosphorylated चित्रा 1 NMDARs संकेतों के synaptic मूल encodes. हिप्पोकैम्पस Schaffer जमानत फाइबर परिणामों की धनुस्तंभीय उत्तेजना synaptic NMDARs और MAPK के बाद सक्रियण के सक्रियण मेंERK1 / 2 झरना संकेत. सक्रिय ERK1 / 2 को बांधता है और सेरीन 180 पर याकूब phosphorylates और याकूब-ERK1 / 2 जटिल नाभिक को translocates और इस बढ़ाया CREB गतिविधि और plasticity संबंधित जीन अभिव्यक्ति की सक्रियता के साथ संबद्ध करता है.
चित्रा 2 उपकरण और औजार एलटीपी शामिल करने के लिए इस्तेमाल किया और हिप्पोकैम्पस के स्लाइस से सीए 1 क्षेत्र विदारक. 3 - micromanipulator और छिड़काव प्रणाली; 4 - recoding इलेक्ट्रोड, 5 - उत्तेजना इलेक्ट्रोड, 6 - पानी के उद्देश्य लेंस - Vibratome) B1-2) इलैक्ट्रोफिजियोलॉजी और इमेजिंग सेटअप (2 - माइक्रोस्कोप ए) Vibratome तीव्र hippocampal स्लाइस (1 की तैयारी के लिए इस्तेमाल किया , 7 - हिप्पोकैम्पस टुकड़ा के साथ स्लाइस धारक) सी) hippocampal स्लाइस से सीए 1 क्षेत्र के विच्छेदन के लिए इस्तेमाल किया उपकरण (8 Stereomicroscope; 9 - सुइयों के साथ इंसुलिन सिरिंज; 10 - लघु शल्य कैंची, 11 - स्केल्पल, 12 - प्लास्टिक पाश्चर पिपेट, 13 - पतला रंग, स्लाइस के विच्छेदन के लिए इस्तेमाल किया बर्फ के पानी से भर 14-100 मिमी प्लास्टिक संस्कृति पकवान, और 40 मिमी प्लास्टिक संस्कृति पकवान.
चित्रा 3 कार्टून प्रयोगात्मक प्रक्रिया का प्रदर्शन है. नंबर प्रोटोकॉल में कदम से संकेत मिलता है. 2.1-2.8) Schaffer जमानत-सीए 1 synapses के potentiation के लिए परत radiatum में रखा कांच इलेक्ट्रोड के साथ जलमग्न कक्ष में एक तीव्र hippocampal टुकड़ा. इनसेट क्षैतिज पट्टी 5 मिसे इंगित करता है और खड़ी पट्टी 0.5 एम वी इंगित करता है, नमूना fEPSP अनुरूप निशान का प्रतिनिधित्व करता है. 3.3) स्लाइस के बाद 1.5 मिलीलीटर ट्यूबों में एकत्र किए गए थेएलटीपी रिकॉर्डिंग और जमे हुए तस्वीर. 4.3) वयस्क चूहे के हिप्पोकैम्पस स्लाइस से सीए 1 क्षेत्र के विच्छेदन. 4.4-4.5) सीए 1 क्षेत्रों कोशिकाओं और नाभिक की रिहाई के आसमाटिक सूजन का कारण बनता है जो hypotonic lysis बफर में homogenized. 1 मिनट के लिए 11,000 rpm पर lysates के 4.8) केन्द्रापसारण. Immunoblotting के लिए cytoplasmic और परमाणु समृद्ध अंशों की 4.10) संग्रह. एसडीएस पृष्ठ और बाद में मानक पश्चिमी सोख्ता पर cytoplasmic और परमाणु समृद्ध अंशों की 5.3) लोड हो रहा है.
सीए 1 एलटीपी की चित्रा 4 प्रेरण नाभिक में pJacS180 का संचय होता है. इंदु के बाद साइटोसोलिक और परमाणु मार्करों. बी) homogenate 2 मिनट में pJac-S180 स्तर की immunoblot विश्लेषण और 30 मिनट के साथ जांच homogenate, साइटोसोलिक और सीए 1 lysate के परमाणु समृद्ध भागों के लिए ए) immunoblottetanization. सी की ction) tetanization के बाद परमाणु समृद्ध अंश 2 मिनट और मिनट में pJacS180 स्तर की immunoblot विश्लेषण. इन परिणामों Karpova एट अल 10 में प्रकाशित मात्रा का ठहराव ग्राफ का हिस्सा हैं. ये प्रतिनिधि immunoblots मूल प्रकाशन में शामिल नहीं हैं.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ऊपर प्रोटोकॉल में वर्णित चरणों, हिप्पोकैम्पस तीव्र युवा या वयस्क चूहों से कटा हुआ तैयार टुकड़ा के उत्तेजित क्षेत्र को प्रेरित और रिकॉर्ड एलटीपी, तेजी से काटना, और गतिविधि निर्भर प्रोटीन गतिशीलता के अध्ययन के लिए परमाणु समृद्ध अंश तैयार करने के लिए कैसे मार्गदर्शन प्रदान करते हैं. यह दृष्टिकोण एक दूसरे से स्वतंत्र रूप से इस्तेमाल किया कई अलग अलग तरीकों के संयोजन से निकला है. हम एक कार्यप्रवाह अनुकूलित और एलटीपी के शामिल होने पर प्रोटीन की subcellular पुनर्वितरण का अध्ययन करने के लिए अपने स्वयं के प्रयोगों स्थापित करने के लिए शुरुआत के लिए पर्याप्त विस्तार प्रदान करते हैं. एक उदाहरण के रूप में हम एलटीपी की देर फार्म S180 के परमाणु संचय याकूब phosphorylated लाती है कि प्रदर्शित करता है. एक दिया प्रोटीन के एक पूर्व मौजूदा परमाणु पूल के फास्फारिलीकरण और synaptic गतिविधि के बाद अपने phosphorylated फार्म के स्थानान्तरण के बीच भेद करने के लिए, इस दृष्टिकोण परमाणु समृद्ध अंश में ब्याज की प्रोटीन का कुल स्तर के लिए नियंत्रण के साथ जोड़ा जा सकता है. इसके अलावा, testiएलटीपी प्रेरण के बाद अलग अलग समय बिंदुओं से अधिक एनजी नमूने प्रोटीन सक्रियण / निष्क्रियता या परमाणु कारोबार के समय के पाठ्यक्रम के अध्ययन के लिए बहुत व्यावहारिक हो सकता है.
उत्तेजित स्लाइस से परमाणु समृद्ध अंशों की तैयारी के दौरान संबोधित किया जाना चाहिए कि कई पद्धति मुद्दे हैं. सबसे पहले, सीए 1 क्षेत्र में उत्तेजित न्यूरॉन्स की संख्या और immunoblotting के लिए सामग्री की मात्रा को बढ़ाने के लिए, हम tetanization दौरान गाबा रिसेप्टर अवरोधक biccuculine के 5 माइक्रोन लागू होते हैं. Biccuculine उत्तेजक पोस्टअन्तर्ग्रथनी क्षमता 3 बढ़ाने के लिए दिखाया गया है.
स्लाइस के यांत्रिक हैंडलिंग सीधे प्रोटीन के संशोधनों में परिवर्तन के साथ correlating गतिविधियों के विभिन्न प्रकार उत्पन्न हो सकता है, क्योंकि दूसरा, तेजी से ठंड से एलटीपी के शामिल होने के बाद स्लाइस के संरक्षण के सफल प्रयोगों के लिए एक महत्वपूर्ण कदम है. जितना संभव हो उतना प्रक्रिया को छोटा करने के लिए, हम सूखी बर्फ पर रखा एक धातु पट्टी का उपयोग करें. स्लाइसप्लास्टिक पाश्चर पिपेट का उपयोग ACSF की एक बूंद में स्थानांतरित किया जा सकता है और prechilled धातु पर रखा गया जब एक बहुत कुछ सेकंड के भीतर जमे हुए किया.
तीसरा महत्वपूर्ण कदम सीए 1 lysates में नाभिक के संवर्धन है. हम खुर्दबीन के नीचे सूजन सेल की निगरानी करने के लिए और सबसे इष्टतम समय बिंदु को खोजने के लिए सलाह देते हैं. ऊतक के homogenization ठीक से नहीं किया गया था, जब कभी कभी, सेल मलबे में अभी भी नमूने में बनी हुई है. फिर परमाणु गोली कुछ मिनट के लिए धोया, फिर lysis बफर में resuspended, और फिर एक purer परमाणु अंश पाने के लिए centrifuged किया जा सकता है.
कुल मिलाकर इस प्रोटोकॉल आगे synaptic plasticity में अलग synapto परमाणु दूत प्रोटीन की भूमिका एक्सप्लोरर के लिए मदद कर सकते हैं. एक ही प्रक्रिया लागू किया जा सकता है न केवल एक उच्च आवृत्ति उत्तेजना प्रेरित एलटीपी लेकिन लिमिटेड, थीटा फट एलटीपी, लघु अवधि के plasticity मॉडल, और दूसरों की तरह synaptic plasticity के अन्य सभी रूपों के लिए.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| CED 1401 AD/DA converter | Cambridge Electronics Design, UK | ||
| Stereomicroscope | Leica S4E, Germany | ||
| Vibrotome | Leica VT1000S, Germany | ||
| Isolated pulse stimulator | A-M Systems, USA | Model 2100 | |
| Centrifuge | Thermo Scientific | ||
| SDS-PAGE system | Biorad | ||
| Cooler | Julabo | ||
| Bright field Microscope | Nikon Eclipse TS100 | ||
| Cell culture incubator | Thermo Electron Corporation | ||
| Micromanipulator | Luigs & Neumann, SM-5, Germany | ||
| Blotting chamber and electric power supplier | Hoefer Scientific Instruments, San Francisco, CA | ||
| Submerged type recording chamber | custom made | ||
| U-shape and submerged type incubator | custom made | ||
| Small surgical scissors | |||
| Scalpel | |||
| Thin spatula | |||
| Plastic Pasteur pipette | |||
| Plastic culture dish | |||
| Bunsen beaker | |||
| Syringe | |||
| Reagents | |||
| NaCl | Roth | Art.-Nr.3957.1 | ≥99.5%, p.a., ACS, ISO |
| KCl | Roth | Art.-Nr.6781.1 | ≥99.5%, p.a., ACS, ISO |
| CaCl2·2H2O | Merck | 1.02382.0500 | pro analysis |
| MgSO4·2H2O | Merck | 5886.05 | pro analysis |
| MgCl2·6H2O | AppliChem | CAS-NO: 7791-18-6; EC-NO:2320946 | for molecular biology |
| KH2PO4 | Merck | 12034.025 | for molecular biology |
| Na2HPO4·2H2O | Merck | 1.06574.1000 | extra pure |
| Glucose·H2O | Roth | Art.-Nr.6887.1 | for molecular biology |
| HEPES | Roth | Art.-Nr.9105.4 | PUFFERAN, ≥99.5%, p.a. |
| NaHCO3 | Merck | 1.06329.1000 | pro analysis |
| Protease inhibitor cocktail | Roche | ||
| Phosphostop | Roche | ||
| Bicuculline | Tocris Bioscience | ||
| Isoflurane | Baxter | ||
| Antibodies | |||
| Primary antibodies | Company | Catalog Number | Species |
| pJac-s180 | Biogenes | rabbit (diluted 1:100) | |
| NeuN | Milipore | MAB377 | mouse (diluted 1:1,000) |
| NSE | Cell Signaling | D20H2 | rabbit (diluted 1:1,000) |
| Beta-actin | Sigma | A-5441 | mouse (diluted 1:5,000) |
| Secondary antibodies | Company | Catalog Number | Species |
| IgG HRP conjugated | DAKO | goat anti-mouse (1:5,000) | |
| IgG HRP conjugated | NEB | goat anti-rabbit (1:5,000) | |
References
- Behnisch, T., et al. Nuclear translocation of Jacob in hippocampal neurons after stimuli inducing long-term potentiation but not long-term depression. PLoS One. 6 (2), e17276 (2011).
- Cai, F., Frey, J. U., Sanna, P. P., Behnisch, T. Protein degradation by the proteasome is required for synaptic tagging and the heterosynaptic stabilization of hippocampal late-phase long-term potentiation. Neuroscience. 169 (4), 1520-1526 (2010).
- Chapman, C. A., Perez, Y., Lacaille, J. C. Effects of GABA(A) inhibition on the expression of long-term potentiation in CA1 pyramidal cells are dependent on tetanization parameters. Hippocampus. 8 (3), 289-298 (1998).
- Ch'ng, T. H., Uzgil, B., Lin, P., Avliyakulov, N. K., O'Dell, T. J., Martin, K. C. Activity-dependent transport of the transcriptional coactivator CRTC1 from synapse to nucleus. Cell. 150 (1), 207-221 (2012).
- Dieterich, D. C., et al. Caldendrin-Jacob: a protein liaison that couples NMDA receptor signalling to the nucleus. PLoS Biol. 6 (2), e34 (2008).
- Fainzilber, M., Budnik, V., Segal, R. A., Kreutz, M. R. From synapse to nucleus and back again--communication over distance within neurons. J. Neurosci. 31 (45), 16045-16048 (2011).
- Hardingham, G. E., Bading, H. Synaptic versus extrasynaptic NMDA receptor signalling: implications for neurodegenerative disorders. Nat. Rev. Neurosci. 11 (10), 682-696 (2010).
- Ivanov, A., et al. Opposing role of synaptic and extrasynaptic NMDA receptors in regulation of the extracellular signal-regulated kinases (ERK) activity in cultured rat hippocampal neurons. J. Physiol. 57, 789-798 (2006).
- Jordan, B. A., Kreutz, M. R. Nucleocytoplasmic protein shuttling: the direct route in synapse-to-nucleus signaling. Trends Neurosci. 32 (7), 392-401 (2009).
- Karpova, A., et al. Encoding and transducing the synaptic or extrasynaptic origin of NMDA receptor signals to the nucleus. Cell. 152 (5), 1119-1133 (2013).
- Kim, M. J., Dunah, A. W., Wang, Y. T., Sheng, M. Differential roles of NR2A- and NR2B-containing NMDA receptors in Ras-ERK signaling and AMPA receptor trafficking. Neuron. 46, 745-760 (2005).
- Lai, K. O., Zhao, Y., Ch'ng, T. H., Martin, K. C. Importin-mediated retrograde transport of CREB2 from distal processes to the nucleus in neurons. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105 (44), 17175-17180 (2008).
- Leutgeb, J. K., Frey, J. U., Behnisch, T. LTP in cultured hippocampal-entorhinal cortex slices from young adult (P25-30) rats. J. Neurosci. Methods. 130 (1), 19-32 (2003).
- Leutgeb, J. K., Frey, J. U., Behnisch, T. Single cell analysis of activity-dependent cyclic AMP-responsive element-binding protein phosphorylation during long-lasting long-term potentiation in area CA1 of mature rat hippocampal-organotypic cultures. Neuroscience. 131 (3), 601-610 (2005).
- Perlson, E., Hanz, S., Ben-Yaakov, K., Segal-Ruder, Y., Seger, R., Fainzilber, M. Vimentin-dependent spatial translocation of an activated MAP kinase in injured nerve. Neuron. 45 (5), 715-726 (2005).
- Xiang, Z., et al. Long-term maintenance of mature hippocampal slices in vitro. J. Neurosci. Methods. 98 (2), 145-154 (2000).
- Zhao, M., Adams, J. P., Dudek, S. M. Pattern-dependent role of NMDA receptors in actin potential generation: consequences on extracellular signal-regulated kinase activation. J. Neurosci. 25 (30), 7032-7039 (2005).
