Summary
私たちは、海馬のCA1領域とスライスのtetanizedエリアからの核に富む画分のその後の単離における長期増強の誘導のための詳細なプロトコルを提供する。このアプローチは、学習および記憶の細胞モデルにおいて活性に依存する核タンパク質のインポートを決定するために用いることができる。
Abstract
勉強活動依存性タンパク質の発現、細胞内転座、またはリン酸化がシナプス可塑性の基礎となる細胞メカニズムを理解することが不可欠です。長期増強（LTP）および急性海馬スライスにおいて誘導される長期抑圧（LTD）が広く学習および記憶の細胞モデルとして受け入れられている。活動依存性タンパク質の動態を可視化するために、ライブセルイメージングまたは免疫組織化学の手法を使用する多くの研究があります。しかし、これらの方法は、単一ニューロンにおける蛍光タグ融合タンパク質の免疫細胞または過剰発現のための抗体の適合性に依存している。タンパク質のイムノは調査結果の独立した確認を提供する代替的な方法である。個別のtetanized海馬スライスからの細胞成分分画の製造における最初の制限要因は、材料の量が少ないです。第二に、処理手順は非常に重要ですlとさえ非常に短いとマイナーな操作のためスライスをivingすると、特定のシグナル伝達カスケードの活性化を誘導し得る。ここでは、ラット脳からの急性海馬スライスのCA1領域から十分な純度の核濃縮画分の十分な量を得るために最適化されたワークフローを説明する。代表的な例として、私たちはsynapto-核タンパク質のメッセンジャーのERK1 / 2リン酸化形態はヤコブが積極的にLTPの誘導時に核に移動し、CA1ニューロンの核濃縮画で検出できることを示している。
Introduction
シナプスN-メチル-D-アスパラギン酸受容体（NMDARを）は、シナプスNMDARをの活性化に対し、シグナル伝達、シナプス可塑性および細胞の生存に重要な役割を果たす神経変性および細胞死を誘発することができる。これらの変更は、厳密に制御/調整された活動依存性遺伝子発現に依存し、このようにして活性化シナプスや樹状突起および核7との間に一定の通信を必要とする。 MAPは、ERK1 / 2シグナル伝達シナプスNMDARを下流のエフェクターであるとシナプス外NMDA受容体を介したシグナルがないか、またはERK1 / 2活性8,11に対する阻害効果を有するのに対し、NMDAR活性化によって誘導される遺伝子発現に関与していませんキナーゼ。
遠位樹状突起と核の間を往復することが示されているタンパク質の数があります。これらのタンパク質の多くは、核局在化シグナルを含有し、積極的に核6,9にダイニンとインポーチン依存的に微小管に沿って輸送される。 Interestinglyは、これらのメッセンジャーのいくつかの特定のシナプスの刺激に応答して、核への唯一のトランジット。例えば、サイクリックAMP応答エレメント結合タンパク質2（CREB2）の逆行性輸送は、化学LTDなくLTP 12によって誘導される。ローカライズされたNMDAR依存シナプス刺激は、長期的な海馬可塑4に関与している転座法、核内にCREB調節される転写コアクチベーター（CRTC1）を駆動する。最近、蛋白質メッセンジャーヤコブは、シナプスとシナプス外NMDA受容体活性化の両方の後に核へ移行し、CREB依存性遺伝子の転写5を調節することが示された。信号のシナプスまたはシナプス外起源は、ヤコブの翻訳後修飾で符号化される。シナプス活性は、初代海馬培養物中の核へのその後の転座のための必要条件である180位（pJacobS 180）での重要なセリンでヤコブのERK1 / 2依存性リン酸化を誘導する。また、私nは急性海馬スライスのpJacobSのCA1ニューロンは180はシャファー側枝LTP後に核に移行したが1,10 LTDません。 pS180ヤコブは可塑性関連遺伝子の発現の増加につながり、この遺伝子の発現は、シナプス機能にフィードバックする。著しく対照的に、シナプス外NMDARを活性化がSer180でリン酸化されておらず、核内の異なるタンパク質複合体と関連する可能性があります後に核へ移行ヤコブは原因となる「CREBを遮断'とシナプスの接点10の後退。
synapto-核タンパク質のメッセンジャーの核内移行のほとんど発表された研究は、解離神経細胞初代培養で行われてきた。従って、そのような知見は、神経細胞の接続性と機能がはるかに優れた保存された海馬スライスを使用して、生理学的に関連性の高い状態で再現できるかどうかを確認するために興味深いものになるだろう。ここでは、LTPドを評価するための最適化されたプロトコルを提示イムノブロットによるタンパク質メッセンジャーの核移行をペンダント。この方法は、粗核画分中のタンパク質の活性依存性リン酸化を分析するのに適している。具体的には、現在のプロトコルは、急性CA1海馬スライス、誘導、およびLTPの記録の調製を含む。次に、CA1領域が微視的に刺激された領域を分離するために解剖される。私たちは、趙と同僚17で導入された変更でCellLytic核抽出キットにより提供される核を単離するためのプロトコルを組み合わせて変更しました。最適化された手順では、細胞膨張および核の放出を可能にする低張性緩衝液中で解剖し、CA1領域の溶解が含まれています。細胞溶解および核の形態は、顕微鏡検査により決定することができる。核濃縮は、短い遠心分離工程によって達成される。のNeuN及びNSE2、核または細胞質画分の特異的マーカーに対する抗体で免疫ブロットすると、このアプローチは速いとして使用できることを示しこれらの細胞成分分画を分離し、タンパク質リン酸化のような非常に不安定な翻訳後修飾を研究するために、再現性のプロトコル。さらに、この方法は、海馬スライスの解剖CA1領域に由来する小さな組織サンプルのために有利であり、海馬切片の免疫組織化学的に組み合わせて使用することができる。
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Protocol
成体ラットの脳からの急性海馬スライスの調製
- イソフルランでラットを麻酔。注意：クローズexicatorを使用しての手順を実行して、イソフルランを吸入しないでください。動物が完全に麻酔をかけていることを確認します。
- ラットを斬首、すぐに脳を隔離し、mM単位precarbonated（95％O 2/5％CO 2ガス混合物）の氷冷をゲイ液（組成物中にそれを浸す：130のNaCl、4.9のKCl、1.5のCaCl 2·2H 2 O 、0.3のMgSO 4·2H 2 O、11のMgCl 2·6H 2 O、0.23 KH 2 PO 4、0.8のNa 2 HPO 4·7H 2 O、5グルコース·H 2 O、25 HEPES、22 NaHCO 3を、pHが7.32） 30分1,2,10,16のため。
- 嗅内皮質の小脳及び一部を削除します。その内側表面に各半球を下に置き、その後、正中矢状カットで皮質半球を分離します。その後作る各半球13,14の背側縁に沿って50〜70カット（50〜70°の横）。
- セクショニングシステムのスライスプラットフォーム上で新鮮にカット面を各半球を接着。プラットフォームはprecarbogenated、氷冷をゲイのソリューションでカバーしなければならない。
- z軸の振動を最小化するように調整ビブラトームを使用して前方から後方側に350μmの50〜70の横断スライスをカットします。海馬、嗅内皮質subicularとだけでなく、海馬に背外側に位置している皮質を実験13,14に使用するスライスの一部となります。
- U字型や水没型保育器に海馬スライスを移し、carbogenated人工脳脊髄液（単位：mm含むACSFで32℃で少なくとも2時間インキュベートする：110のNaCl、2.5のKCl、2.5のCaCl 2·2H 2 O、1.5マグネシウム4·2H 2 O、1.24 KH 2 PO 4、10mMグルコース·H 2O、27.4 炭酸水素ナトリウム、pH7.3）で1,2,10,16。
2電極のポジショニング、ベースラインの記録、およびLTPの誘導
- 顕微鏡下に取り付けられた水没型の記録室に海馬スライスを転送します。 32℃で少なくとも30分間carbogenated ACSFで（6〜7ミリリットル/分）を灌流する。
- （チップ抵抗は3-5MΩです）ACSFを充填したガラスキャピラリー微小電極を準備します。
- 刺激のためとのfEPSPは1,2,10（ 図2）を記録するのCA1放線層におけるCA1シェーファー担保繊維にACSFを充填したガラス微小電極を配置します。電極間の距離は約300μmであるべきである。
- 3-4 Vの範囲で、二相性の矩形電流パルス（200ミリ秒/極性）を持つシェーファー担保繊維の刺激によってフィールド興奮性シナプス後電位（fEPSPs）を想起
- INPを測定することにより、最大刺激テストを実行しますUT-出力の関係とは、得られた最大のfEPSP-勾配値の40％として、刺激の強さを定義し、実験を通じて一定に保つ。
- 最大刺激試験後、少なくとも15分間のベースライン記録を開始します。実験の間、毎分の刺激テストするための応答を測定します。低周波刺激とベースラインのレコーディングを行ってください。
- 少なくとも30分間のベースラインを記録します。
- 後期LTP誘導は5分あいだの間隔で100Hzで3 1秒刺激トレインからなる高周波数100 Hzの強直誘発を適用するため。 CA1領域内の刺激の場を増やすには5μMのビククリンは強直誘発前の2分で洗浄することができますし、すぐに最後の強直誘発した後に洗浄する必要があります。
3 LTPの誘導後のスライスの収集とスナップ凍結
- 後期LTPを誘導するテタヌス刺激の3列車の後に2分または30分の記録を停止LTP。
- -80℃で1.5mlチューブとストア内の各スライスを収集します。
海馬のCA1領域から核エンリッチ画分の4の単離
- -80℃から凍結切片と1.5ミリリットルエッペンドルフチューブを取り出し、氷上に保管してください。
- チューブに、プロテアーゼ（PI）およびホスファターゼ（PS）阻害剤を含有する新鮮な冷たいTBS緩衝液を0.5ml加える。 2〜3分間インキュベートし、実体顕微鏡に移す。注意：PIおよびPSでの作業中に保護手袋と白衣を使用してください。
- 2本の針を使用して、海馬のCA1錐体層域を解剖。実体顕微鏡とのCA1領域を切断するための第二の針の下にスライスを保持するための一方の針を使用してください。
- 解剖したCAを収集50μlの溶解緩衝液（：10 HEPES、1.5のMgCl 2、10、PIおよびPSとのKCl、pHは7.9、mMの中に含む1×低張溶解バッファー）を含む新しい1.5 mlチューブに（グループごとに）5スライスから1地域。材料のこの量は2-3イムノブロットを実行するのに十分であることに注意してください。
- 慎重なピペッティングを上下することにより採取した組織を均質化する。 200μlのピペットを使用してください。細胞が膨潤することを可能にするために5-7分間氷上でライセートをインキュベートする。
- 、溶解液2μlのを取り、顕微鏡スライド上にドロップし、明視野顕微鏡下で細胞の膨潤を可視化する。細胞の適切な腫れで核が無傷の構造ラウンドとして表示されます。
- 'ホモジネート分画」として新しい1.5mlチューブにサンプルを20μlを収集します。 4×SDSサンプル緩衝液の変性8を添加する。
- 1分間11000 rpmで、残りの溶解物を遠心。
- 慎重に、TRトップ（ 'サイトゾル画分」）から上清を収集ansfer新しいチューブに4倍サンプル緩衝液20μlを加える。
- 低張性緩衝液60μlの中でペレットを再懸濁し、4倍のサンプル緩衝液20μlを加える。この画分は、「核濃縮画分」と呼ばれる。
- ホモジネート、細胞質ゾル、核濃縮された画分は、後で免疫ブロッティングのために℃〜-20℃または-80℃で保存することができる。
Synapto核タンパク質のための5。半定量免疫ブロッティング
- サンプルをDefreeze 95°Cで5分間それらを沸騰。
- 各画分からの5μlを取り、アミド黒のテストまたはBCA試験によりタンパク質濃度を決定する。
- SDS-PAGE上ホモジネートからのタンパク質サンプルを同量、細胞質および核に富む画分をロードします。コントロールとLTPスライスからのサンプルを、直接比較のために同じゲル上に配置する必要があります。
- 標準ウェスタンブロッティングの手順を実行します（ウェット転送を推奨します）。
- トンを有する膜をプローブ好きな彼は、抗体。その後、同じブロット（または同じ試料を並行して実行される）、細胞質マーカーを用いてプローブすることができます - ニューロン特異enolase2（NSE2）および核マーカー - のNeuNおよびローディング対照としてアクチン抗体。
6。データ解析
- LTP誘導の効率は、Clampfitソフトウェアによって分析することができる。ベースライン記録の平均勾配は、二元配置ANOVAを使用して強直誘発後の斜面と比較して、p <0.05での有意差があると考えした。のfEPSPの勾配値は、平均±SEMとして図に描かれた
- イムノブロットの定量化のために、オートラジオグラフィーフィルムのいずれかをスキャンし、LICORシステムをImageJのまたは蛍光バンドによってタンパク質バンドの積分密度を分析する。免疫反応性バンドの値がロードおよびブロッティング制御のために正規化されるべきである。 nonparametricalマンホイットニーU検定を使用してもよい制御およびLTP群の比較のために。
| バッファの名前 | 試薬 | 濃度（mM）の | 額 | コメント/説明 |
| をゲイ液 （pH：7.3〜7.4） | NaClを | 130 | 7.6グラム | 除菌 |
| 千ミリリットル | 塩化カリウム | 4.9 | 0.37グラム | |
| のCaCl 2·2H 2 O | 1.5 | 0.22グラム | ||
| の MgSO 4·2H 2 O | 0.3 | 0.0739グラム | ||
| のMgCl 2·6H 2 O | 11 | 2.24グラム | ||
| KH 2 PO 4 | 0.23 | 0.0313グラム | ||
| のNa 2 HPO 4·7H 2 O | 0.8 | 0.2145グラム | ||
| グルコース·H 2 O | 5 | 0.9909グラム | ||
| HEPES | 25 | 5.96グラム | ||
| 炭酸水素ナトリウム | 22 | 1.85グラム | ||
| ACSF液（pH：7.3〜7.4） | NaClを | 110 | 6.428グラム | 除菌 |
| 千ミリリットル | 塩化カリウム | 2.5 | 0.1865グラム | |
| のCaCl 2·2H 2 O | 2.5 | 0.368グラム | ||
| の MgSO 4·2H 2 O | 1.5 | 0.370グラム | ||
| KH 2 PO 4 | 1.24 | 0.169グラム | ||
| グルコース·H 2 O | 10 | 1.9817グラム | ||
| 炭酸水素ナトリウム | 27.4 | 2.3グラム | ||
| 1×低張緩衝液 （7.9） | HEPES | 10 | 0.23グラム | |
| 100ミリリットル | のMgCl 2·6H 2 O | 1.5 | 0.0304グラム | |
| 塩化カリウム | 10 | 0.07455グラム |
表1。バッファ。
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Representative Results
私たちは、以前にsynapto-核タンパク質メッセンジャーヤコブはLTPの誘導ではなく、LTD 1以下の核内に蓄積することが示されている。また、シナプス刺激後のヤコブの転座は、MAPK ERK1 / 2およびSer180でのヤコブのリン酸化（ 図1）の活性化が必要である。リン酸化されたヤコブはインポーチン依存的に核に移行し、リン酸化された状態が15αinternexin中間径フィラメント（ 図1）との会合により、長期間にわたって保存することができる。ヤコブのリン酸化状態は、活動依存性遺伝子および細胞生存の発現に重要である。興味深いことに、シナプス外NMDARをの活性化にも核にヤコブを駆動しますが、この場合、ヤコブはSer180でリン酸化されていないし、その核内蓄積がCREBを誘導する5,10を 「遮断」。上記の結果は、protocoにより得た私たちの最近の研究で確立LS（参照Karpova ら 10モデルの詳細については）。
ヤコブはLTPの誘導後の核に移行することを証明するためには、（ 図2および図3）。誘導し、急性海馬スライスにおけるシャファー側副fEPSPの増強の誘発を測定し、その後、CA1ニューロンからニューロンの核を単離し私たちは、高頻度刺激の適用（2分及び30分）後の2つの異なる時点で比較し、続いて核の単離およびウエスタンブロッティングのために処理したスライスごとにLTPの誘発を記録した（ 図2および3）。細胞質ゾルマーカーニューロン特異的enolase2（NSE）が溶解したCの遠心分離後に得られた上清フラクションで主に存在しているのに対し、神経細胞核マーカーのNeuNの濃縮は、解剖しCA1領域から調製した核濃縮画で見ることができますのエル（ 図4A）。 pS180ヤコブ抗体の特異性は、（詳細はKarpova ら 10を参照）以前に特徴付けられている。 pS180ヤコブレベルは、総CA1タンパク質ホモジネート中および強直誘発（ 図4B）の後に核濃縮画2分で不変のままであったが、私たちはそのヤコブを確認し、30分LTP（ 図4C）の誘導後にpJacobS 180免疫反応性の有意な増加を発見この細胞塑性モデルにおける核へ転位すると、Ser180でリン酸化される。
ヤコブはS180がリン酸化され、図1は、NMDARを信号のシナプス起源をコードしている。海 馬シャファー側副線維結果のテタヌス刺激をシナプスNMDARをし、MAPKのその後の活性化の活性化にERK1 / 2シグナル伝達カスケード。活性化されたERK1 / 2に結合し、セリン180でヤコブをリン酸化し、ジェイコブ-ERK1 / 2複合体は、核に移動し、これが強化されたCREB活性と可塑性関連遺伝子発現の活性化と相関している。
図2の機器やツール、LTP誘導のために使用され、海馬スライスからCA1領域を解剖。 3 -マイクロマニピュレータ及び灌流システム; 4 -リコーディング電極、5 -刺激電極と、6 -水上対物レンズ-ビブラトーム）B1-2）電気生理学とイメージングのセットアップ（2 -顕微鏡A）ビブラトームは、急性海馬スライス（1の調製のために使用; 7 -海馬スライスとスライスホルダー）C）海馬スライスからCA1領域の解剖のために使用される機器（8 STEReomicroscope; 9 - 針とインスリン注射器; 10 -小型手術用はさみ、11 -スカルペル; 12 -プラスチックパスツールピペット; 13 -シン·ヘラ、氷水で満たされた14〜100ミリメートルのプラスチック培養皿、スライスの解剖のために使用さ40ミリメートルのプラスチック培養皿。
図3実験手順を示した漫画。数字は、プロトコルの手順を示している。 2.1から2.8）シェーファー側副-CA1シナプスの増強のための放線状層に配置されたガラス電極で水没室における急性海馬スライス。挿入図は、サンプルのfEPSPアナログトレースを表し、水平のバーは5ミリ、縦バーが0.5 mVのことを示します。 3.3）のスライスは後に1.5ミリリットルチューブに採取したLTP記録急速凍結。 4.3）、成体ラット海馬スライスからCA1領域の解剖。 4.4-4.5）CA1領域は、細胞および核の放出の浸透膨潤を引き起こす低張溶解緩衝液中でホモジナイズ。 4.8）1分間11000 rpmで溶解物の遠心分離を。免疫ブロッティングのための細胞質および核に富む画分の4.10）のコレクション。 SDS-PAGEおよびその後の標準ウェスタンブロット法での細胞質および核に富む画分の5.3）読み込み中。
CA1 LTPの図4誘導は、核内のpJacS180が蓄積する。寄り付き後に細胞質ゾルおよび核マーカー。B）ホモジネート2分でpJac-S180レベルのイムノブロット分析し、30分間でプローブしホモジネート、細胞質ゾルおよびCA1溶解物の核に富む画分A）イムノブロット強直誘発。Cのction）強直誘発後に核濃縮画2分と分でpJacS180レベルのイムノブロット分析。これらの結果は、Karpova ら 10に発表され、定量化グラフの一部である。これらの代表的なイムノブロットは、初版発行には含まれていません。
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Discussion
上記のプロトコルに記載の手順は、どのように迅速にスライスの誘導エリアを分析し、活動依存性タンパク質のダイナミクスを研究するための核濃縮画分を準備し、LTPを、若年または成体ラットからスライス海馬急性の準備誘導し、記録するためのガイダンスを提供する。このアプローチは、互いに独立して使用されるいくつかの異なる方法の組み合わせに由来する。私たちは、ワークフローを最適化し、LTPの誘導によって、タンパク質の細胞内再分布を研究するために、独自の実験をセットアップするための初心者のための十分な詳細を提供します。例として、私たちは、LTPの後期形はS180リン酸化されたヤコブの核蓄積を誘導することを実証している。所与のタンパク質の既存の核プールのリン酸化およびシナプス活性後のリン酸化形態の移動を区別するために、このアプローチは、核濃縮画分中の目的のタンパク質の総レベルの制御と組み合わせることができる。また、TESTILTP誘導後の異なる時点にわたるngのサンプルは、タンパク質活性化/不活性化または核ターンオーバーの時間経過を研究するための非常に洞察力に富んだかもしれません。
刺激されたスライスからの核に富む画分の調製時に対処する必要のあるいくつかの方法論的な問題があります。まず、CA1領域における刺激されたニューロンの数およびイムノための材料の量を増加させるために、私たちは強直誘発時に、GABA A受容体ブロッカーbiccuculine5μMのを適用します。 Biccuculineは、興奮性シナプス後電位3を増強することが示されている。
スライスの機械的な取り扱いが直接、タンパク質の改変の変化に相関する活動の異なったタイプを誘発する可能性があるため第二に、急速凍結によるLTPの誘導後のスライスの保存が成功した実験のための重要なステップです。できるだけ多くの手順を短縮するために、ドライアイス上に置き、金属棒を使用。スライスsはプラスチック製のパスツールピペットを用いてACSFのドロップで転送することができ、予冷金属上に置かれたときに非常に少数秒以内に凍結する。
第三の重要なステップは、CA1溶解物中の核の濃縮である。私たちは、顕微鏡下で細胞膨張を監視し、最適な時点を見つけることをお勧めします。組織の均質化が適切に行われなかったとき時には、細胞破片は、まだサンプルに残っています。そして核ペレットを数分間洗浄し、再び溶解緩衝液に再懸濁し、次いで純粋な核画分を得るために遠心分離することができる。
全体的に、このプロトコルは、さらにシナプス可塑性の異なるsynapto核メッセンジャータンパク質の役割をエクスプローラに助けることができる。同様の手順を適用することができるだけでなく、高頻度刺激誘発性LTPが、LTD、シータバーストLTP、短期可塑性モデル、および他のようなシナプス可塑性のすべての他の形態。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| CED 1401 AD/DA converter | Cambridge Electronics Design, UK | ||
| Stereomicroscope | Leica S4E, Germany | ||
| Vibrotome | Leica VT1000S, Germany | ||
| Isolated pulse stimulator | A-M Systems, USA | Model 2100 | |
| Centrifuge | Thermo Scientific | ||
| SDS-PAGE system | Biorad | ||
| Cooler | Julabo | ||
| Bright field Microscope | Nikon Eclipse TS100 | ||
| Cell culture incubator | Thermo Electron Corporation | ||
| Micromanipulator | Luigs & Neumann, SM-5, Germany | ||
| Blotting chamber and electric power supplier | Hoefer Scientific Instruments, San Francisco, CA | ||
| Submerged type recording chamber | custom made | ||
| U-shape and submerged type incubator | custom made | ||
| Small surgical scissors | |||
| Scalpel | |||
| Thin spatula | |||
| Plastic Pasteur pipette | |||
| Plastic culture dish | |||
| Bunsen beaker | |||
| Syringe | |||
| Reagents | |||
| NaCl | Roth | Art.-Nr.3957.1 | ≥99.5%, p.a., ACS, ISO |
| KCl | Roth | Art.-Nr.6781.1 | ≥99.5%, p.a., ACS, ISO |
| CaCl2·2H2O | Merck | 1.02382.0500 | pro analysis |
| MgSO4·2H2O | Merck | 5886.05 | pro analysis |
| MgCl2·6H2O | AppliChem | CAS-NO: 7791-18-6; EC-NO:2320946 | for molecular biology |
| KH2PO4 | Merck | 12034.025 | for molecular biology |
| Na2HPO4·2H2O | Merck | 1.06574.1000 | extra pure |
| Glucose·H2O | Roth | Art.-Nr.6887.1 | for molecular biology |
| HEPES | Roth | Art.-Nr.9105.4 | PUFFERAN, ≥99.5%, p.a. |
| NaHCO3 | Merck | 1.06329.1000 | pro analysis |
| Protease inhibitor cocktail | Roche | ||
| Phosphostop | Roche | ||
| Bicuculline | Tocris Bioscience | ||
| Isoflurane | Baxter | ||
| Antibodies | |||
| Primary antibodies | Company | Catalog Number | Species |
| pJac-s180 | Biogenes | rabbit (diluted 1:100) | |
| NeuN | Milipore | MAB377 | mouse (diluted 1:1,000) |
| NSE | Cell Signaling | D20H2 | rabbit (diluted 1:1,000) |
| Beta-actin | Sigma | A-5441 | mouse (diluted 1:5,000) |
| Secondary antibodies | Company | Catalog Number | Species |
| IgG HRP conjugated | DAKO | goat anti-mouse (1:5,000) | |
| IgG HRP conjugated | NEB | goat anti-rabbit (1:5,000) | |
References
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