Summary
We geven een gedetailleerd protocol voor inductie van lange termijn potentiëring van de CA1 regio van de hippocampus en de daaropvolgende isolatie van nucleaire verrijkte fracties uit de tetanized gebied van het segment. Deze benadering kan worden gebruikt om activiteit te bepalen afhankelijk kerneiwit invoer cellulaire modellen van leren en geheugen.
Abstract
Bestuderen activiteit afhankelijke eiwitexpressie subcellulaire translocatie of fosforylering essentieel om de onderliggende cellulaire mechanismen van synaptische plasticiteit begrijpen. Lange termijn potentiëring (LTP) en lange termijn depressie (LTD) geïnduceerde acute hippocampale plakken worden algemeen aanvaard als cellulaire modellen van leren en geheugen. Er zijn tal van studies die live cell imaging of immunohistochemie benaderingen gebruiken om de activiteit afhankelijk eiwit dynamiek te visualiseren. Echter deze werkwijzen afhankelijk van de geschiktheid van antilichamen voor immunocytochemie of overexpressie van fluorescentie-gemerkte eiwitten in enkele neuronen. Immunoblotting van eiwitten is een alternatieve methode voor het verstrekken van onafhankelijke bevestiging van de bevindingen. De eerste bepalende factor voor de bereiding van subcellulaire fracties individueel tetanized hippocampale plakken is de lage hoeveelheid materiaal. Ten tweede, de behandeling procedure is cruciaal omdat zelfs zeer korte en kleine manipulaties living plakjes zou activering van bepaalde signaleringscascades induceren. Hier beschrijven we een optimale workflow om voldoende hoeveelheid nucleaire verrijkte fractie van voldoende zuiverheid te verkrijgen van de CA1 regio acute hippocampale plakjes van rattenhersenen. Als een representatief voorbeeld wordt aangetoond dat de ERK1 / 2 gefosforyleerde vorm van het synapto-kerneiwit messenger Jacob actief naar de kern na inductie van LTP en kan worden gedetecteerd in nucleaire verrijkte fractie uit CA1 neuronen.
Introduction
Synaptic N-methyl-D-aspartaat-receptoren (NMDARs) spelen een cruciale rol in synaptische plasticiteit en celoverleving signaleren dat activatie van extrasynaptic NMDARs kan leiden neurodegeneratie en celsterfte. Deze veranderingen hangen af van streng gecontroleerde / gereglementeerde activiteit afhankelijke genexpressie en dus vereisen constante communicatie tussen geactiveerde synapsen of dendrieten en de kern 7. De MAP kinases ERK1 / 2 zijn effectoren van synaptische NMDARs signalering en zijn betrokken bij NMDAR-activatie-geïnduceerde genexpressie, dat signalering via extrasynaptic NMDAR geen of een remmend effect op de ERK1 / 2 activiteit 8,11.
Er zijn een aantal eiwitten die zijn aangetoond shuttle tussen distale dendrieten en de nucleus. Veel van deze eiwitten een nucleair lokalisatiesignaal en actief aan de kern 6,9 getransporteerd langs microtubuli in een dynein en importin afhankelijke wijze. Interestingly, sommige boodschappers alleen worden doorgevoerd naar de kern in reactie op specifieke synaptische stimuli. Bijvoorbeeld wordt retrograde transport van cyclisch AMP respons element bindend eiwit 2 (CREB2) geïnduceerd door chemische LTD maar niet LTP 12. Gelokaliseerde NMDAR synaptische stimulatie drijft-CREB gereguleerde transcriptie coactivator (CRTC1) in de kern, een translocatie proces, dat betrokken is bij de lange termijn hippocampale plasticiteit 4. Recent werd aangetoond dat het eiwit boodschapper Jacob naar de kern nadat beide, synaptische en extrasynaptic NMDAR activatie en regelt CREB afhankelijke gentranscriptie 5. De synaptische of extrasynaptic oorsprong van het signaal gecodeerd in een posttranslationele modificatie van Jacob. Synaptische activiteit induceert ERK1 / 2 afhankelijke fosforylatie van Jacob in een cruciale serine op positie 180 (pJacobS 180) dat een voorwaarde voor de daaropvolgende translocatie naar de kern van primaire hippocampale kweek. Bovendien in CA1 neuronen van acute hippocampus plakjes pJacobS 180 naar de kern na Schaffer onderpand LTP maar niet LTD 1,10. pS180 Jacob leidt tot een verhoogde expressie van plasticiteit gerelateerde genen en deze genexpressie terugvoert synaptische functie. In scherp contrast, Jakob die naar de kern na extrasynaptic NMDARs activering niet is gefosforyleerd op Ser180 en kan worden geassocieerd met verschillende eiwit complex in de kern veroorzaken "CREB uitgeschakeld en een retractie van synaptische contacten 10.
De meeste gepubliceerde studies over de nucleaire import van synapto-nucleaire eiwit boodschapper zijn gedaan in gedissocieerde neuronale primaire culturen. Daarom zou het interessant zijn om te zien of dergelijke bevindingen kunnen worden gereproduceerd in fysiologisch relevante omstandigheden met behulp van de hippocampus plakjes waar neuronale connectiviteit en functie zijn veel beter bewaard gebleven. Hier presenteren we een geoptimaliseerd protocol voor de beoordeling van LTP-deaanhangende nucleaire translocatie van eiwitten boodschappers door immunoblotting. Deze methode is ook geschikt voor het analyseren van activiteit afhankelijke fosforylering van proteïnen in een ruw nucleaire fractie. Specifiek, het huidige protocol omvat de voorbereiding van acute CA1 hippocampus plakjes, inductie, en de opname van LTP. Vervolgens wordt CA1 regio microscopisch ontleed om de gestimuleerde gebied isoleren. Wij gecombineerd en bewerkt het protocol voor nucleaire isolatie door CellLytic nucleaire Extraction Kit met veranderingen die door Zhao en collega's 17. De geoptimaliseerde procedure omvat de lysis van ontleed CA1 regio hypotone buffer waardoor cel zwelling en afgifte van kernen. Cell lysis en kernen morfologie kan worden bepaald door microscopisch onderzoek. Nuclear verrijking bereikt door een korte centrifugatie stap. Immunoblotting analyse met antilichamen tegen NeuN en NSE2 specifieke merkers van nucleaire of cytosolische fracties, geeft aan dat deze benadering kan worden gebruikt als een snelleen reproduceerbare protocol deze subcellulaire fracties te isoleren en zeer labiele posttranslationele modificaties zoals eiwitfosforylatie bestuderen. Bovendien is deze werkwijze voordelig voor kleine weefselmonsters afkomstig van ontleed CA1 regio van hippocampale plakjes en kan worden gebruikt in combinatie met immunohistochemie van hippocampale plakjes.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1 Voorbereiding van de Acute hippocampus Slices van volwassen hersenen van de rat
- Verdoven van ratten met isofluraan. LET OP: Voer de procedure met behulp van een gesloten exicator, niet inhaleren isofluraan. Zorg ervoor dat het dier volledig verdoofd.
- Onthoofden de rat, isoleert de hersenen, en dompel in gecarboniseerd (95% O 2/5% CO2 gasmengsel) ijskoude Gey-oplossing (samenstelling in mM: 130 NaCl, 4,9 KCI, 1,5 CaCl2 · 2H 2 O 0,3 MgSO4 · 2H 2 O, 11 MgCl2 · 6H 2 O, 0.23 KH 2PO 4, 0,8 Na 2 HPO 4 · 7H 2 O, 5 Glucose · H2O, 25 HEPES, 22 NaHCO3, pH 7,32) gedurende 30 min 1,2,10,16.
- Verwijder het cerebellum en een deel van de entorhinale cortex. Scheid de corticale hemisferen met een mid-sagittale snede, plaats dan elk halfrond neer op zijn mediale oppervlak. Daarna makenEen 50-70 ° snede (50-70 ° dwars) langs de dorsale rand van elk halfrond 13,14.
- Lijm elk halfrond met de vers gesneden oppervlak op het snijden platform van het snijden systeem. Het platform moet worden gedekt door precarbogenated ijskoude Gey's oplossing.
- Snijd 350 micrometer 50-70 ° dwarse plakjes van anterior naar posterior kant met behulp van een vibratome aangepast aan z-as trilling te minimaliseren. De hippocampale formatie, subicular en entorhinale cortex, en de cortex die zich dorsolaterale de hippocampus een deel van de segmenten gebruikt voor experimenten 13,14 zijn.
- Transfer hippocampale plakjes een U-vorm en ondergedompelde soort incubator en incubeer gedurende ten minste 2 uur bij 32 ° C met carbogenated kunstmatige cerebrospinale vloeistof (ACSF die in mM: 110 NaCl, 2,5 KCI, 2,5 CaCl2 · 2H 2 O, 1.5 MgSO 4 · 2H 2 O, 1.24 KH 2 PO 4, 10 Glucose · H 2O, 27.4 NaHCO3, pH 7,3) 1,2,10,16.
2 Plaatsing van de elektroden, Baseline opnemen, en inductie van LTP
- Breng de hippocampus slice om een ondergedompelde soort opname kamer onder een microscoop gemonteerd. Perfuseren (6-7 ml / min) met carbogenated ACSF ten minste 30 minuten bij 32 ° C.
- Bereid glazen capillaire micro-elektroden gevuld met ACSF (top resistentie 3-5 MQ).
- Plaats een glazen micro-elektroden gevuld met ACSF in het CA1 Schaffer-zekerheden vezels voor stimulatie en in de stratum radiatum van CA1 fEPSP opnemen 1,2,10 (figuur 2). De afstand tussen de elektroden moet ongeveer 300 urn.
- Evoke veld prikkelende Postsynaptische Potentials (fEPSPs) door stimulatie van Schaffer-onderpand vezels met tweefasige rechthoekige stroompulsen (200 msec / polariteit) in een range van 3-4 V.
- Voer de maximale stimulatie-test door het meten van de input uitgang relatie en hier de stimulatie sterkte 40% van de maximale fEPSP-hellingswaarden verkregen en houdt deze constant gedurende het experiment.
- Begin de basislijn opname gedurende minstens 15 minuten na de maximale stimulatie test. Meet de respons te testen stimuli elke minuut gedurende het experiment. Voer basislijnregistratie met lage frequentie stimulatie.
- Noteer de basislijn ten minste 30 minuten.
- Voor Late-LTP inductie toepassen hoge frequentie 100 Hz tetanization bestaande uit drie 1 sec stimulustreinen bij 100 Hz met een 5 min intertrain interval. Op het gebied van stimulering binnen CA1 regio 5uM bicuculline verhogen kan in 2 minuten worden gewassen voordat tetanization en dient onmiddellijk na de laatste tetanization worden uitgewassen.
3 Het verzamelen van Schijfjes na inductie van LTP en Snap Bevriezing
- Stop LTP opnemen 2 min of 30 min na drie treinen van tetanische stimulatie induceren van Late-LTP.
- Verzamel elk segment in een 1,5 ml buisje en bewaar bij -80 ° C.
4 Isolatie van Nuclear verrijkte fracties van de CA1 regio van de hippocampus
- Neem 1,5 ml Eppendorf buizen met de bevroren plakjes van -80 ° C en bewaar ze op ijs.
- Voeg 0,5 ml verse koude TBS buffer die protease (PI) en fosfatase (PS) remmers, in de buis. Incubeer gedurende 2-3 minuten en over te dragen aan een stereomicroscoop. LET OP: Gebruik beschermende handschoenen en een laboratoriumjas tijdens het werken met PI en PS.
- Ontleden de CA1 stratum pyramidale regio van de hippocampus met behulp van twee naalden. Gebruik een naald voor het vasthouden van de snee onder de stereomicroscoop en de tweede naald voor het snijden van het CA1 gebied.
- Verzamel de ontleed CA1 regio uit 5 segmenten (per groep) in een nieuwe buis van 1,5 ml die 50 ul lysis buffer (1x hypotone lysisbuffer die in mM: 10 HEPES, 1,5 MgCl2, 10 KCl, pH 7,9, met PI en PS). Merk op dat deze hoeveelheid materiaal voldoende om 2-3 immunoblots draaien zal zijn.
- Homogeniseren verzamelde weefsel door voorzichtig en neer te pipetteren. Gebruik een pipet 200 ul. Incubeer het lysaat op ijs gedurende 5-7 minuten om de cellen opzwellen.
- Neem 2 pi van het lysaat, vallen op een microscopisch preparaat, en visualiseren van de zwelling van de cellen onder een helderveld microscoop. Met de juiste zwelling van de cellen de kernen weergegeven als ronde structuren intact.
- Verzamel 20 ui monster in een nieuwe 1,5 ml buis "homogenaat fractie. Voeg 8 ul van 4x denaturerende SDS-monsterbuffer.
- Centrifugeer de resterende lysaten bij 11.000 rpm gedurende 1 minuut.
- Verzamel de bovenstaande vloeistof voorzichtig van de top (cytosolfractie), transfer in een nieuwe buis en voeg 20 ui 4x monsterbuffer.
- Resuspendeer de pellet in 60 ul van hypotone buffer en voeg 20 ui 4x monsterbuffer. Deze fractie wordt aangeduid als een 'nucleaire verrijkte fractie.
- Homogenaat, cytosolische en nucleaire verrijkte fracties kunnen worden opgeslagen bij -20 ° C of -80 ° C voor later immunoblotting.
5. Semikwantitatieve Immunoblotting voor Synapto-nucleaire Eiwitten
- Ontdooien monsters en kook ze gedurende 5 minuten bij 95 ° C.
- Neem 5 pl van elke fractie bepaald en de eiwitconcentratie door amido zwart-test of BCA test.
- Laad gelijke hoeveelheid eiwit monsters van homogenaat, cytoplasmatische en nucleaire verrijkte fracties op SDS-PAGE. Monsters van de controle en LTP segmenten moeten op dezelfde gel als directe vergelijking worden geplaatst.
- Voer een standaard western-blotting procedure (natte overdracht wordt aanbevolen).
- Probe de membranen met thij antilichaam van keuze. Vervolgens dezelfde vlekken (of dezelfde monsters lopen parallel) kan worden onderzocht met een cytoplasmatisch marker - neuron specifieke enolase2 (NSE2) en nucleaire marker - NeuN en een actine antilichaam als een laad controle.
6 Data Analysis
- Efficiëntie van LTP inductie kan worden geanalyseerd door Clampfit software. De gemiddelde helling van basislijnregistratie vergeleken met de hellingen na tetanization behulp van twee-weg ANOVA, p <0,05 werd als significant verschillend. De fEPSP helling waarden afgebeeld in schema als het gemiddelde ± SEM
- Voor de kwantificering van immunoblots, scannen ofwel de autoradiografische film en analyseren de geïntegreerde dichtheid van eiwit bands door ImageJ of fluorescentie bands met een Licor systeem. Waarden van immuunreactieve banden moet worden genormaliseerd voor het laden en blotting controle. Ter vergelijking van de controle en LTP groepen een nonparametrical Mann-Whitney U-test kan worden gebruikt.
| Naam van de buffer | Reagens | Concentratie (mm) | Bedrag | Commentaar / Beschrijving |
| Gey-oplossing (pH: 7.3 ~ 7.4) | NaCl | 130 | 7,6 g | steriele filtratie |
| 1000 ml | KCl | 4.9 | 0,37 g | |
| CaCl2 · 2H 2 O | 1.5 | 0,22 g | ||
| MgSO4 · 2H 2 O | 0,3 | 0,0739 g | ||
| MgCl2 · 6H 2 O | 11 | 2,24 g | ||
| KH 2 PO 4 | 0.23 | 0,0313 g | ||
| Na 2 HPO 4 · 7H 2 O | 0,8 | 0,2145 g | ||
| Glucose · H2O | 5 | 0,9909 g | ||
| HEPES | 25 | 5,96 g | ||
| NaHCO3 | 22 | 1,85 g | ||
| ACSF (pH: 7.3 ~ 7.4) | NaCl | 110 | 6.428 g | steriele filtratie |
| 1000 ml | KCl | 2,5 | 0,1865 g | |
| CaCl2 · 2H 2 O | 2,5 | 0.368 g | ||
| MgSO4 · 2H 2 O | 1.5 | 0.370 g | ||
| KH 2 PO 4 | 1.24 | 0,169 g | ||
| Glucose · H2O | 10 | 1,9817 g | ||
| NaHCO3 | 27.4 | 2,3 g | ||
| 1x Hypotone buffer (pH: 7,9) | HEPES | 10 | 0,23 g | |
| 100 ml | MgCl2 · 6H 2 O | 1.5 | 0,0304 g | |
| KCl | 10 | 0,07455 g |
Tabel 1 Buffers.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
We hebben eerder aangetoond dat de synapto-kerneiwit messenger Jacob accumuleert in de kern na de inductie van LTP maar niet LTD 1. Bovendien translocatie van Jacob na synaptische stimulatie vereist activatie van MAPK ERK1 / 2 en fosforylering van Jacob op Ser180 (figuur 1). Gefosforyleerd Jacob naar de kern in een importin-afhankelijke wijze en de gefosforyleerde toestand kan worden bewaard gedurende langere tijd door associatie met de intermediaire filament αinternexin 15 (figuur 1). De fosfo-staat Jacob is belangrijk voor de expressie van activiteit-afhankelijke genen en celoverleving. Interessant activatie van extrasynaptic NMDARs drijft ook Jacob in de kern, maar in dit geval Jacob is gefosforyleerd op Ser180 en nucleaire accumulatie veroorzaakt CREB 'uitgeschakeld' 5,10. De hierboven beschreven resultaten werden verkregen door protocoin onze recente studie opgericht ls (zie Karpova et al. 10 voor een gedetailleerde beschrijving van het model).
Om te bewijzen dat Jakob translocatie naar de kern na inductie van LTP, we opgewekt en gemeten inductie van Schaffer zekerheid fEPSP versterking in acute hippocampale plakken en vervolgens geïsoleerd neuronale kernen van CA1 neuronen (figuren 2 en 3). We vergeleken twee verschillende tijdstippen na toepassing van hoogfrequente stimulatie (2 min en 30 min) en nam de inductie van LTP voor elke plak die vervolgens verwerkt voor nucleaire isolatie en western blotting (figuren 2 en 3). Verrijking van de neuronale nucleaire marker NeuN kan worden gezien in de nucleaire verrijkte fractie bereid uit de ontleed CA1 regio, terwijl cytosolische marker neuron specifieke enolase2 (NSE) is vooral aanwezig in het supernatant fractie verkregen na centrifugatie van gelyseerde cells (Figuur 4A). De specificiteit van pS180 Jacob antilichaam is eerder gekarakteriseerd (voor details zie Karpova et al. 10). pS180 Jacob bleven onveranderd in totaal CA1 eiwit homogenaten en in het nucleaire verrijkte fractie 2 min na tetanization (figuur 4B), maar vonden we een significante toename pJacobS 180 immunoreactiviteit 30 minuten na de inductie van LTP (Figuur 4C), hetgeen bevestigt dat Jacob translocatie naar de kern van deze cellulaire plasticiteit model is gefosforyleerd op Ser180.
Figuur 1 Jacob gefosforyleerd op S180 codeert de synaptische oorsprong van NMDARs signalen. Tetanische stimulatie van de hippocampus Schaffer onderpand vezels resulteert in de activering van synaptische NMDARs en daaropvolgende activatie van MAPKERK1 / 2 signalerende cascade. Geactiveerd ERK1 / 2 bindt en fosforyleert Jacob bij serine 180 en Jacob-ERK1 / 2 complex naar de kern en dit correleert met verhoogde CREB activiteit en activatie van plasticiteit gerelateerde genexpressie.
Figuur 2 Apparatuur en instrumenten die worden gebruikt voor LTP inductie en het ontleden van de regio CA1 van hippocampus plakjes. A) Vibratome gebruikt voor de bereiding van acute hippocampus plakjes (1 - Vibratome) B1-2) elektrofysiologie en imaging setup (2 - Een microscoop; 3 - micromanipulator en perfusie systeem; 4 - Hercodering elektrode; 5 - stimulatie-elektrode; 6 - Water objectief ; 7 - Slice houder met hippocampus slice) C) Apparatuur die wordt gebruikt voor de dissectie van CA1 regio van de hippocampus plakjes (8 Stereomicroscope; 9 - Insuline spuit met naalden; 10 - Kleine chirurgische schaar, 11 - scalpel, 12 - Plastic Pasteur pipet, 13 - dunne spatel 14-100 mm plastic kweekschaal gevuld met ijs-water en 40 mm plastic kweekschaal gebruikt voor dissectie van segmenten.
Figuur 3 Cartoon aantonen van de experimentele procedure. Nummers geven stappen in het protocol. 2,1-2,8) Een acute hippocampus slice in de verzonken kamer met glazen elektroden geplaatst in het stratum radiatum voor versterking van Schaffer onderpand-CA1 synapsen. De inzet is de steekproef fEPSP analoge sporen, de horizontale balk geeft 5 ms en de verticale balk geeft 0,5 mV. 3.3) De schijfjes werden verzameld in 1,5 ml buizen naLTP-opname en snel bevroren. 4.3) Dissectie van de regio CA1 van volwassen rat hippocampus plakjes. 4,4-4,5) CA1 regio gehomogeniseerd in hypotone lysis buffer, die osmotische zwelling van cellen en het vrijkomen van kernen veroorzaakt. 4.8) Centrifugeren van lysaten bij 11.000 rpm gedurende 1 minuut. 4.10) Collectie van de cytoplasmatische en nucleaire verrijkte fracties voor immunoblotting. 5.3) Laden van cytoplasmatische en nucleaire verrijkte fracties op SDS-PAGE en daaropvolgende standaard Western-blotting.
Figuur 4 Inductie van CA1 LTP leidt tot de accumulatie van pJacS180 in de kern. A) Immunoblot voor homogenaat, cytosolische en nucleaire verrijkte fracties van CA1 lysaat onderzocht met cytosolische en nucleaire markers. B) Immunoblotanalyse van pJac-S180 niveau homogenaat 2 min en 30 min na inductie van tetanization. C) Immunoblotanalyse van pJacS180 niveau in nucleaire verrijkte fractie 2 min en min na tetanization. Deze resultaten zijn onderdeel van kwantificering grafiek gepubliceerd Karpova e.a. 10. Deze representatieve immunoblots zijn niet in de oorspronkelijke publicatie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De stappen in het hierboven beschreven protocol een leidraad hoe voor te bereiden hippocampus acute gesneden uit jonge of volwassen ratten, opwekken en opnemen LTP, snel ontleden gestimuleerde gebied van slice, en voor te bereiden nucleaire verrijkte fractie voor activiteit afhankelijk eiwit dynamiek te bestuderen. Deze benadering is afgeleid van een combinatie van verschillende methoden onafhankelijk van elkaar gebruikt. We geoptimaliseerde workflow en bieden voldoende gedetailleerd voor de beginner om het opzetten van hun eigen experimenten om de subcellulaire herverdeling van eiwitten te bestuderen na inductie van LTP. Als voorbeeld laten we zien dat de late vorm van LTP induceert de nucleaire accumulatie van S180 gefosforyleerd Jacob. Ter onderscheiding van de fosforylatie van een bestaand nucleaire pool van een bepaald eiwit en de translocatie van de gefosforyleerde vorm na synaptische activiteit, kan deze benadering worden gecombineerd met controle voor de totale hoeveelheid eiwitten van belang in de nucleaire verrijkte fractie. Bovendien testing monsters op verschillende tijdstippen na LTP inductie kan zeer verhelderend voor het bestuderen van tijdsverloop van eiwit activering / inactivatie of nucleaire omzet.
Tijdens de voorbereiding van de nucleaire verrijkte fracties uit gestimuleerd schijfjes zijn er verschillende methodologische problemen die moeten worden aangepakt. Ten eerste, het aantal gestimuleerde neuronen in het CA1 gebied en de hoeveelheid materiaal voor immunoblotting verhogen, passen we 5 uM GABAA receptor blocker biccuculine tijdens tetanization. Biccuculine is aangetoond prikkelende postsynaptische potentialen 3 versterken.
Ten tweede, het behoud van de schijfjes na inductie van LTP door snel invriezen is een cruciale stap voor een succesvolle experimenten vanwege mechanische behandeling van plakjes verschillende soorten activiteiten direct te correleren met veranderingen in de modificaties eiwit zou kunnen veroorzaken. Om de procedure zo veel mogelijk te bekorten, gebruiken we een metalen staaf die op droog ijs. Slices kunnen in een daling van ACSF worden overgebracht met behulp van plastic een Pasteur pipet en binnen een zeer enkele seconden worden ingevroren wanneer geplaatst op voorgekoeld metaal.
De derde essentiële stap is de verrijking van kernen in CA1 lysaten. Wij raden aan om te controleren cel zwelling onder de microscoop en de meest optimale tijdstip te vinden. Soms wanneer homogenisatie van weefsel niet correct is uitgevoerd, celafval blijft in de monsters. Dan nucleaire pellet worden geresuspendeerd in lysisbuffer opnieuw gewassen gedurende enkele minuten en daarna gecentrifugeerd om een zuiverder nucleaire fractie krijgen.
Algemeen is dit protocol kan helpen om verder ontdekkingsreiziger de rol van verschillende synapto-nucleaire boodschapper eiwitten in synaptische plasticiteit. Dezelfde procedure kan worden toegepast, niet alleen om een hoogfrequente stimulatie geïnduceerde LTP, maar alle andere vormen van synaptische plasticiteit zoals LTD, theta burst LTP, op korte termijn plasticiteit modellen, en anderen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| CED 1401 AD/DA converter | Cambridge Electronics Design, UK | ||
| Stereomicroscope | Leica S4E, Germany | ||
| Vibrotome | Leica VT1000S, Germany | ||
| Isolated pulse stimulator | A-M Systems, USA | Model 2100 | |
| Centrifuge | Thermo Scientific | ||
| SDS-PAGE system | Biorad | ||
| Cooler | Julabo | ||
| Bright field Microscope | Nikon Eclipse TS100 | ||
| Cell culture incubator | Thermo Electron Corporation | ||
| Micromanipulator | Luigs & Neumann, SM-5, Germany | ||
| Blotting chamber and electric power supplier | Hoefer Scientific Instruments, San Francisco, CA | ||
| Submerged type recording chamber | custom made | ||
| U-shape and submerged type incubator | custom made | ||
| Small surgical scissors | |||
| Scalpel | |||
| Thin spatula | |||
| Plastic Pasteur pipette | |||
| Plastic culture dish | |||
| Bunsen beaker | |||
| Syringe | |||
| Reagents | |||
| NaCl | Roth | Art.-Nr.3957.1 | ≥99.5%, p.a., ACS, ISO |
| KCl | Roth | Art.-Nr.6781.1 | ≥99.5%, p.a., ACS, ISO |
| CaCl2·2H2O | Merck | 1.02382.0500 | pro analysis |
| MgSO4·2H2O | Merck | 5886.05 | pro analysis |
| MgCl2·6H2O | AppliChem | CAS-NO: 7791-18-6; EC-NO:2320946 | for molecular biology |
| KH2PO4 | Merck | 12034.025 | for molecular biology |
| Na2HPO4·2H2O | Merck | 1.06574.1000 | extra pure |
| Glucose·H2O | Roth | Art.-Nr.6887.1 | for molecular biology |
| HEPES | Roth | Art.-Nr.9105.4 | PUFFERAN, ≥99.5%, p.a. |
| NaHCO3 | Merck | 1.06329.1000 | pro analysis |
| Protease inhibitor cocktail | Roche | ||
| Phosphostop | Roche | ||
| Bicuculline | Tocris Bioscience | ||
| Isoflurane | Baxter | ||
| Antibodies | |||
| Primary antibodies | Company | Catalog Number | Species |
| pJac-s180 | Biogenes | rabbit (diluted 1:100) | |
| NeuN | Milipore | MAB377 | mouse (diluted 1:1,000) |
| NSE | Cell Signaling | D20H2 | rabbit (diluted 1:1,000) |
| Beta-actin | Sigma | A-5441 | mouse (diluted 1:5,000) |
| Secondary antibodies | Company | Catalog Number | Species |
| IgG HRP conjugated | DAKO | goat anti-mouse (1:5,000) | |
| IgG HRP conjugated | NEB | goat anti-rabbit (1:5,000) | |
References
- Behnisch, T., et al. Nuclear translocation of Jacob in hippocampal neurons after stimuli inducing long-term potentiation but not long-term depression. PLoS One. 6 (2), e17276 (2011).
- Cai, F., Frey, J. U., Sanna, P. P., Behnisch, T. Protein degradation by the proteasome is required for synaptic tagging and the heterosynaptic stabilization of hippocampal late-phase long-term potentiation. Neuroscience. 169 (4), 1520-1526 (2010).
- Chapman, C. A., Perez, Y., Lacaille, J. C. Effects of GABA(A) inhibition on the expression of long-term potentiation in CA1 pyramidal cells are dependent on tetanization parameters. Hippocampus. 8 (3), 289-298 (1998).
- Ch'ng, T. H., Uzgil, B., Lin, P., Avliyakulov, N. K., O'Dell, T. J., Martin, K. C. Activity-dependent transport of the transcriptional coactivator CRTC1 from synapse to nucleus. Cell. 150 (1), 207-221 (2012).
- Dieterich, D. C., et al. Caldendrin-Jacob: a protein liaison that couples NMDA receptor signalling to the nucleus. PLoS Biol. 6 (2), e34 (2008).
- Fainzilber, M., Budnik, V., Segal, R. A., Kreutz, M. R. From synapse to nucleus and back again--communication over distance within neurons. J. Neurosci. 31 (45), 16045-16048 (2011).
- Hardingham, G. E., Bading, H. Synaptic versus extrasynaptic NMDA receptor signalling: implications for neurodegenerative disorders. Nat. Rev. Neurosci. 11 (10), 682-696 (2010).
- Ivanov, A., et al. Opposing role of synaptic and extrasynaptic NMDA receptors in regulation of the extracellular signal-regulated kinases (ERK) activity in cultured rat hippocampal neurons. J. Physiol. 57, 789-798 (2006).
- Jordan, B. A., Kreutz, M. R. Nucleocytoplasmic protein shuttling: the direct route in synapse-to-nucleus signaling. Trends Neurosci. 32 (7), 392-401 (2009).
- Karpova, A., et al. Encoding and transducing the synaptic or extrasynaptic origin of NMDA receptor signals to the nucleus. Cell. 152 (5), 1119-1133 (2013).
- Kim, M. J., Dunah, A. W., Wang, Y. T., Sheng, M. Differential roles of NR2A- and NR2B-containing NMDA receptors in Ras-ERK signaling and AMPA receptor trafficking. Neuron. 46, 745-760 (2005).
- Lai, K. O., Zhao, Y., Ch'ng, T. H., Martin, K. C. Importin-mediated retrograde transport of CREB2 from distal processes to the nucleus in neurons. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105 (44), 17175-17180 (2008).
- Leutgeb, J. K., Frey, J. U., Behnisch, T. LTP in cultured hippocampal-entorhinal cortex slices from young adult (P25-30) rats. J. Neurosci. Methods. 130 (1), 19-32 (2003).
- Leutgeb, J. K., Frey, J. U., Behnisch, T. Single cell analysis of activity-dependent cyclic AMP-responsive element-binding protein phosphorylation during long-lasting long-term potentiation in area CA1 of mature rat hippocampal-organotypic cultures. Neuroscience. 131 (3), 601-610 (2005).
- Perlson, E., Hanz, S., Ben-Yaakov, K., Segal-Ruder, Y., Seger, R., Fainzilber, M. Vimentin-dependent spatial translocation of an activated MAP kinase in injured nerve. Neuron. 45 (5), 715-726 (2005).
- Xiang, Z., et al. Long-term maintenance of mature hippocampal slices in vitro. J. Neurosci. Methods. 98 (2), 145-154 (2000).
- Zhao, M., Adams, J. P., Dudek, S. M. Pattern-dependent role of NMDA receptors in actin potential generation: consequences on extracellular signal-regulated kinase activation. J. Neurosci. 25 (30), 7032-7039 (2005).
