Here we report a protocol to measure oxidative stress in living zebrafish embryos. This procedure allows reactive oxygen species (ROS) detection in both whole embryo tissues and single-cell populations. This protocol will accomplish both qualitative and quantitative analyses.
Høje niveauer af reaktive ilt arter (ROS) kan medføre en ændring i cellulær redox tilstand mod oxidativt stress tilstand. Denne situation medfører oxidation af molekyler (lipid, DNA, protein) og fører til celledød. Oxidativt stress påvirker også udviklingen af en række patologiske tilstande som diabetes, retinopathier, neurodegeneration og kræft. Derfor er det vigtigt at definere redskaber til at undersøge oxidative stress betingelser ikke kun på niveauet af enkelte celler, men også i forbindelse med hele organismer. Her mener vi, at zebrafisk foster som en nyttig in vivo system til at udføre sådanne undersøgelser og præsentere en protokol til at måle in vivo oxidativ stress. Drage fordel af fluorescerende ROS sonder og zebrafisk transgene fluorescerende linjer, vi udvikler to forskellige metoder til at måle oxidativt stress in vivo: i) et "hel foster ROS-afsløring Method" til kvalitativ måling af oxidativt stress og ii) et "encellede ROS afsløring metode "for kvantitative målinger af oxidativ stress. Heri, vi påvise effekten af disse procedurer ved at øge oxidativt stress i væv ved oxidant agenter og fysiologiske eller genetiske metoder. Denne protokol er modtagelig for forward genetiske skærme, og det vil bidrage til at løse årsagssammenhængen af realkreditobligationer i dyremodeller af oxidative stress-relaterede sygdomme såsom neurologiske lidelser og kræft.
Oxidativt stress er specifikt defineret som en tilstand, der skyldes en ubalanceret cellulær redox tilstand. De komplekse redox reaktioner, der rutinemæssigt opstår inde i cellerne bestemme den cellulære redox-tilstand. Redoxreaktioner består af alle kemiske reaktioner, der består i overførsel af elektroner mellem atomer af biologiske molekyler, der producerer reduktion og oxidation af molekyler (dvs. redox reaktioner). Disse reaktioner katalyseres af elektronisk aktiverede arter (dvs. pro-oxidative arter), der er karakteriseret ved en ekstrem strukturel ustabilitet og spontan aktivering af ubalancerede elektroner, der udveksler med nabolandene biomolekyler. Disse uregelmæssige reaktioner resultere i DNA-skader, protein carboxylering og lipid oxidation, og i sidste ende føre til celledød 1. Øgede niveauer af oxidativ stress har været forbundet med aldring og progression af forskellige patologiske tilstande 2. Oxidativ stress harblevet rapporteret til at være ansvarlig for vaskulære ændringer i diabetes og hjerte-kar-sygdomme 3,4. Det spiller også en afgørende rolle i neuronal degeneration i Alzheimers sygdom og Parkinsons sygdom 5.. Desuden har oxidativt stress blevet påvist som en kritisk faktor i styrende kræft progression og metastatiske begivenheder 6,7. Desuden kan inflammation og immunresponser fremkalde og yderligere støtte oxidativt stress 8.
I levende celler, der pro-oxidative arter stammer fra ilt (ROS, reaktive ilt arter) eller kvælstof (RNS, reaktive nitrogen arter). ROS indbefatter hydroxyl-radikal, superoxid anion (OH). (O 2 -) og hydrogenperoxid (H2O 2). Den primære RNS er lattergas (NO).. En række sekundære reaktive arter kan genereres ved spontane interaktioner between ROS og RNS eller frie metalioner 9. For eksempel superoxidanionen reagerer med nitrogenoxid for at danne peroxynitrate (ONOO -), mens H 2 O 2 reagerer med Fe2 + genererer hydroxylradikaler. ROS og RNS på grund af deres evne til at reagere med flere biomolekyler, betragtes en farlig trussel for opretholdelse af den fysiologiske redoxtilstand 10. For at opretholde redoxtilstanden celler er udstyret med en række afgiftende antioxidant molekyler og enzymer. Superoxid dismutase (SOD), katalase, glutathion-peroxidase og Peroxiredoxins væsentlige udgør antioxidanten enzymatisk-arsenal, der giver cellulære beskyttelse mod pro-oxidative arter herunder H 2 O 2, OH og Oono -. 11.. Også anti-oxidant molekyler som vitamin C og E, polyphenoler og CoenzymeQ10 (CoQ10) er af afgørende betydning at slukke ROS og deres farlige dederivater 12,13. Imidlertid er en overdreven produktion af ROS og RNS eller en dysfunktion i antioxidant-system, skifter cellulær redox-state mod oxidativ stress 14.
Udover deres negative konnotationer, kan ROS spille forskellige fysiologiske roller i celler af forskellig oprindelse. Celler producerer normalt ROS som signalmolekyler at mægle normale biologiske begivenheder såsom vært forsvar og sår reparation 15-17. Reaktive arter produceres normalt i celler ved intracellulære enzymer, såsom NOX (NADPH oxidase) og XO (Xantine Oxidase) som reaktion på signalering faktorer, vækstfaktorer og intracellulære udsving i calciumniveauer 18,19. Det er blevet rapporteret, at ROS differentielt kan modulere aktiviteten af vigtige nukleare faktorer, såsom p53 eller cellulære bestanddele, såsom ATM-kinase, en master regulator af respons på DNA-skade 20. Analogt ROS stor indflydelse cellulær signalering ved at formidle the oxidation og inaktivering af protein tyrosinphosphataser (PTP'er), der er etableret som kritiske regulatorer af signaltransduktion 21. Desuden proteom baserede metoder viser, at RNS også er ansvarlige for specifikke protein modifikationer og ændringer af molekylære signalering. RNS reagerer med cystein thiolgrupperne ændre dem i S-nitrothiols (SNO) og udløser molekylære veje samtidig med patologiske tilstande såsom inflammatoriske og autoimmune sygdomme 22,23.
Da celledyrkningsforsøg kun delvist gengive de mange faktorer, der handler in vivo, er det af stor interesse for at udføre redox studier i dyremodeller 24,25. For at opnå dette, har zebrafisk blevet betragtet som en passende hvirveldyr model til at studere oxidative stress dynamik 26. Zebrafisken er en ny model system, der giver flere fordele til at studere cellulære og genetiske begivenheder i hvirveldyr development og sygdom. Store klynger af embryoer kan genereres og ugenligt til forsøg behov. Desuden den ekstraordinære optisk klarhed af zebrafisk embryoner, samt deres lille størrelse, giver enkelt celle billedbehandling og dynamisk tracking i en hel organismer 27. I det sidste årti, har et betydeligt antal zebrafisk mutanter blevet genereret til at modellere humane patologiske tilstande som kræft og genetiske sygdomme 28-31. Vigtigst er det, har et væld af transgene linier blevet produceret til at tillade omfattende muligheder af genetiske og biologiske manipulationer 32. For eksempel er transgene vævsspecifikke zebrafisk linjer regelmæssigt anvendes til in vivo-undersøgelser. Disse linjer udtrykker et fluorescerende protein under kontrol af en udvalgt promotor, som giver mulighed for at identificere enkelte celler in vivo, såvel som den anatomiske struktur, de omfatter.
Adskillige toksikologiske undersøgelser har allerede brugt than-zebrafisk at vurdere in vivo-virkningen af kemikalier på redox homeostase, hvilket antyder egnetheden af denne hvirveldyr som en dyremodel for området for lægemiddelforskning og oxidativt stress 33-35. Selvom nogle fluorescerende prober er blevet testet til at overvåge oxidativt stress i zebrafisk larver 36,37, er der ingen etablerede assays at påvise og måle niveauet af oxidativt stress i zebrafisk væv og levende celler. Her beskriver vi en procedure for in vivo kvantificering af oxidativt stress i levende celler i zebrafisk embryoner. Billedbehandling værktøjer, FACS sortering, fluorescerende prober og pro-oxidative betingelser er alle sammen til at generere en simpel analyse til påvisning og kvantificering af oxidative arter i zebrafisk embryoner og væv.
Kritiske trin
Proceduren for oxidativt stress detektion i zebrafisk embryoner beskrevet heri omfatter to forskellige metoder. Hele mount ROS-påvisningsmetode er primært en kvalitativ analyse for ROS-detektion, mens enkelt celle ROS-detektionsmetode giver mere specifikke kvantitative målinger (figur 1). Begge metoder giver en hurtig og nem måde at vurdere in vivo ROS-afsløring på zebrafisk embryoner. Men de begge præsentere nogle kritiske trin.
<p class="jov…The authors have nothing to disclose.
Support in Massimo Santoro lab come from HFSP, Marie Curie Action, Telethon and AIRC. We thank Dafne Gays and Emiliano Panieri for critical reading of the manuscript.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Hydrogen peroxide solution | SIGMA | 516813 | DO NOT STORE DILUITIONS |
Hank's Balanced Salt Solution 1X | GIBCO | 14025 | |
Methyl cellulose | SIGMA | M0387 | |
Instant Ocean Aquarium Sea Salt Mixture | INSTANT OCEAN | SS15-10 | |
Tricaine | SIGMA | A5040 | |
Cgeneric ROS-sensitive probe: CellROX Deep Red Reagent | INVITROGEN | C10422 | |
Mitochondria specific ROS-sensitive probe: MitoSOX | INVITROGEN | M36008 | dissolve one vial with 13μl of DMSO |
Hydroethidine | INVITROGEN | D23107 | |
Rotenone | SIGMA | R8875 | Prepare 5mM stock solution in DMSO. |
Dimethyl sulfoxide | SIGMA | D2650 | |
VAS2870; 3-Benzyl-7-(2-benzoxazolyl)thio-1,2,3-triazolo(4,5-d)pyrimidine | EnzoLifeScience | BML-EI395 | dissolve the powder in DMSO; diluite in fish water |
Propidium Iodide | Molecular probes (Life Technologies) | P3566 | |
7-aminoactinomycin D (7-AAD) | Molecular probes (Life Technologies) | A1310 | |
Nrf2a Morpholino | GeneTools | 5'-CATTTCAATCTCCATCATGTCTCAG-3' | Ref: Timme-LaLaragy et al; 2012 (PMID: 22174413); Kobayashi et al; 2002(PMID:12167159 ) |
Collagenase P | ROCHE | 11213857001 | Dissolve the powder at 100mg/ml in sterile HBSS. Store aliquots at -20°C |
Phosphate-Buffered Saline (PBS) | GIBCO | 10010-056 | |
Fetal Bovine Serum | GIBCO | 10082-147 | |
Complete Protease Inhibitor Cocktail Tablets | ROCHE | Dissolve one tablet in 1ml of water | |
0.5% Trypsin-EDTA (10x), no phenol red | GIBCO | 15400-054 | Prepare 1X working solution before usage |
Compound microscope | ZEISS | ||
Stereo microscope with fluorescent illumination | Nikon | AZ100 | |
camera | ZEISS | AxioCamMRm | |
software for fluorescence image acquisition | ZEISS | ZEN 2011 | |
Fluorescence-activated cell sorter | BD FACSCalibur | ||
Centrifuge | Eppendorf | 5417R | |
FACS tubes | BD | 342065 | |
Multiwell Plate | BD Falcon | 353047 | |
Sterilized, non treated Petri dishes 90mm | VWR | 391-1915 | |
Confocal microscope | Leica | Leica SP5 |