कोशिका की सतह प्रोटिओमिक्स के लिए glycopeptide कैद
Summary
कोशिका की सतह प्रोटीन जैविक रूप से महत्वपूर्ण और व्यापक रूप से ग्लाइकोसिलेटेड हैं. हम सतही नियंत्रण रेखा एमएस आधारित प्रोटिओमिक विश्लेषण के लिए इन प्रोटीनों, solubilize को समृद्ध, और deglycosylate को यहां एक glycopeptide कब्जा दृष्टिकोण का परिचय.
Abstract
बाह्य मैट्रिक्स प्रोटीन सहित कोशिका की सतह प्रोटीन,, इस तरह के विकास, भेदभाव, और प्रसार जैसे सभी प्रमुख सेलुलर प्रक्रियाओं और कार्यों, में भाग लेते हैं. इन प्रोटीनों की एक व्यापक लक्षण वर्णन biomarker खोज, सेल प्रकार की पहचान, और दवा लक्ष्य चयन है, साथ ही सेलुलर जीव विज्ञान और शरीर विज्ञान के बारे में हमारी समझ अग्रिम की मदद करने के लिए अमीर जानकारी प्रदान करता है. सतह प्रोटीन, तथापि, क्योंकि उनकी स्वाभाविक कम बहुतायत, उच्च hydrophobicity, और भारी बाद translational संशोधनों की महत्वपूर्ण विश्लेषणात्मक चुनौतियों मुद्रा. सतह प्रोटीन पर प्रचलित ग्लाइकोसिलेशन का लाभ उठाते हुए, हम यहाँ कई मौजूदा एन glycoproteomics साधन के फायदे को एकीकृत एक उच्च throughput glycopeptide कब्जा दृष्टिकोण का परिचय. हमारे विधि सतह प्रोटीन से व्युत्पन्न glycopeptides को समृद्ध और नियंत्रण रेखा एमएस का उपयोग सतही प्रोटिओमिक्स के लिए उनके ग्लाइकान निकाल सकते हैं. सुलझाया एन glycoproteome inf शामिलप्रोटीन की पहचान और मात्रा के साथ ही ग्लाइकोसिलेशन की अपनी साइटों के ormation. यह विधि कैंसर, स्टेम सेल, और दवा विषाक्तता सहित क्षेत्रों में अध्ययन की एक श्रृंखला के लिए लागू किया गया है. विधि की सीमा नमूनों की एक अपेक्षाकृत बड़ी मात्रा साइटोसोलिक प्रोटीन पर केंद्रित अध्ययन की तुलना में इस विश्लेषण के लिए आवश्यक है कि इस तरह की सतह झिल्ली प्रोटीन की कम बहुतायत में है.
Introduction
कोशिका की सतह प्रोटीन बाह्य वातावरण के साथ बातचीत और एक सेल के अंदर करने के लिए बाहर से संकेत रिले. इस प्रकार, बाह्य मैट्रिक्स प्रोटीन सहित इन प्रोटीन, सेलुलर जीव विज्ञान और प्रसार, विकास, प्रवास, भेदभाव से बहुत आगे है उम्र बढ़ने और से लेकर शरीर क्रिया विज्ञान के सभी पहलुओं में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं. सतह प्रोटीन अन्य कोशिकाओं, प्रोटीन और छोटे अणुओं 1-3 के साथ बातचीत से कार्य करते हैं. दवाओं के 60% से अधिक सेल सतह प्रोटीन 4 के लिए लक्षित कर रहे हैं के रूप में सेल सतह प्रोटीन की आणविक लक्षण वर्णन, जीव के लिए बल्कि दवा कंपनियों के लिए न केवल महान ब्याज की है.
इसके बेहतर संवेदनशीलता, सटीकता, और प्रोटीन और पेप्टाइड्स की पहचान के लिए throughput के साथ मिलकर जन स्पेक्ट्रोमेट्री (एमएस), वैश्विक प्रोटिओमिक पढ़ाई 5,6 के लिए एक शक्तिशाली उपकरण किया गया है. फिर भी, सतह प्रोटीन के रूप में, एमएस आधारित प्रोटिओमिक्स के लिए महत्वपूर्ण चुनौतियां खड़ीसबसे सतह प्रोटीन कम मात्रा में और भारी संशोधनों के साथ मौजूद हैं. सतह प्रोटीन की झिल्ली फैले क्षेत्रों उन्हें हाइड्रोफोबिक प्रस्तुत करना; यह विशेष रूप से multipass transmembrane प्रोटीन के लिए मामला है. यह एक साबुन की मदद के बिना जलीय समाधान में झिल्ली प्रोटीन भंग करने के लिए इस प्रकार कठिन है; हालांकि डिटर्जेंट का प्रयोग आम तौर पर प्रोटीन की पहचान में HPLC और एमएस 1,7,8 के प्रदर्शन को दबा. इसलिए, झिल्ली प्रोटीन खराब प्रत्यक्ष नियंत्रण रेखा एमएस आधारित प्रोटिओमिक्स में विशेषता किया गया है.
ग्लाइकोसिलेशन सेल सतह प्रोटीन 9 में जगह लेने के लिए सबसे महत्वपूर्ण और प्रचुर बाद translational संशोधनों में से एक है. ग्लाइकान की भारी जटिलता और विविधता पेप्टाइड्स 'एमएस संकेत 10 बाधा हैं. फिर भी, कई प्रोटिओमिक तरीकों सतह प्रोटीन को समृद्ध करने और पूर्व नियंत्रण रेखा एमएस विश्लेषण करने के लिए प्रोटीन से चीनी moieties निकालने के लिए यह अनूठा संशोधन का इस्तेमाल किया है. ये विधिएस लेक्टिन आधारित संबंध कब्जा 11 और hydrazide आधारित या बोरिक एसिड आधारित रासायनिक कब्जा 12 के साथ ही हाइड्रोफिलिक क्रोमैटोग्राफी विभाजन 8,13 शामिल हैं. ग्लाइकान को दूर करने के लिए नियमित रूप से प्रोटीन के लिए झिल्ली प्रोटीन बदल देती है और काफी एमएस लक्षण वर्णन सरल करता है. ग्लाइकोसिलेशन भी प्रोटीन झिल्ली के विपरीत उच्च विलेयता है कि secreted प्रोटीन में जगह लेता है, क्योंकि कई glycoproteomic तरीकों घुलनशील प्रोटीन के लिए अनुकूलित किया है, और कम glycopeptide चयनात्मकता और प्रोटीन 8,14 झिल्ली तैनात किया जा रहा है जब संवेदनशीलता हो जाते रहे हैं. अन्य तरीकों में भी समृद्ध करने के लिए मौजूद हैं, विशेष रूप से, इस तरह के ultracentrifugation 15 और लेबलिंग रणनीति 16 का उपयोग उन लोगों के रूप में सेल सतह प्रोटीन,. झिल्ली प्रोटीन निस्र्पक के लिए हमारे विधि और अन्य मौजूदा तरीकों के बीच एक विस्तृत तुलना हाल ही में 17 का आयोजन किया, और परिणाम हमारे विधि भी उतना ही अच्छा प्रदर्शन कर सकते हैं संकेत दिया है कि, अगर नहीं गया थासभी तुलना झिल्ली प्रोटिओमिक्स तरीकों की तुलना में, बेहतर है, लेकिन उच्च सादगी के साथ.
शोधकर्ताओं ने इस पद्धति का उपयोग करने में मदद करने के लिए, यहाँ हम विस्तार एक सामान्य प्रोटोकॉल. इस विधि मौजूदा glycoproteomics रणनीतियों के कई फायदे एकीकृत करता है और झिल्ली ग्लाइकोप्रोटीन के लिए विशेष रूप से तैयार कर लिया जाता है, अभी तक विधि secreted प्रोटीन के लिए समान रूप से अच्छी तरह से काम करता है. इस विधि की विशेषताओं में शामिल हैं: 1) झिल्ली प्रोटीन का एक पूरा solubilization, 2) के बजाय एक ठोस कब्जा सब्सट्रेट का उपयोग करते समय संभावित steric बाधा को खत्म करने ग्लाइकोप्रोटीन से glycopeptides का संवर्धन, 3) hydrazide रसायन विज्ञान का उपयोग सहसंयोजक बांड के बीच के लिए फार्म glycopeptides और कब्जा सब्सट्रेट, बंधुआ glycopeptides उच्च glycoselectivity के लिए कड़े washes बर्दाश्त कर सकते हैं, और 4) क्षमता कम नमूना नुकसान और छोटा प्रक्रिया की अवधि के लिए एक ट्यूब में पूरे कब्जा प्रक्रिया का संचालन करने के लिए कि इस तरह के. एक vari का अध्ययन करने के लिए इस विधि को लागू करने के बादकोशिकाओं और ऊतकों सहित जैविक नमूने का ety, हम ग्लाइकोप्रोटीन 8,17,18 के लिए एक उच्च चयनात्मकता (> 90%) मनाया.
Protocol
Representative Results
Discussion
यहाँ हम सेल सतह प्रोटीन की रूपरेखा के लिए एक glycopeptide कब्जा रणनीति का परिचय. विधि स्रावित जैसे रक्त में उन के रूप में प्रोटीन,, साथ ही शरीर के अन्य तरल पदार्थ में या सेल संस्कृति मीडिया में अध्ययन करने के लिए …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस शोध साइमन फ्रेजर विश्वविद्यालय के स्टार्टअप कोष द्वारा समर्थित किया गया है.
Materials
| DTT | Sigma | 646563 | |
| TCEP | Sigma | 646547 | |
| Iodoacetamide | Sigma | A3221 | |
| Rapigest SF | Waters | 186001860 | |
| Sodium periodate | Sigma | 311448 | |
| PNGase F | New England Biolabs | P0704S | |
| Affi-Gel Hz Hydrazide gel | Bio-Rad | 153-6047 | |
| Trypsin | Worthington Biomedical | LS02115 | |
| Sep-Pak C-18 cartridge | Waters | WAT054955 | |
| Oasis MCX cartridge | Waters | 186000252 | |
| Protease inhibitor coctail | Sigma | P8340 | |
| Urea | Amersco | 568 | |
| Sodium sulphite | Caledon | 8360-1 | |
| Invertase | Sigma | I0408 | |
| Alpha-1 trypsin | Sigma | F2006 | |
| Ribonulease B | Sigma | R7884 | |
| Avidin | Sigma | A9275 | |
| Ovalbumin | Sigma | A5503 | |
| Conalbumin | Sigma | C0755 |
References
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