Proteine di superficie cellulare sono biologicamente importante e ampiamente glicosilata. Vi presentiamo qui un approccio glicopeptide-capture per solubilizzare, arricchire, e deglycosylate queste proteine per facili analisi proteomica basati LC-MS.
Proteine di superficie delle cellule, tra cui proteine della matrice extracellulare, partecipano a tutti i principali processi e le funzioni cellulari, come la crescita, la differenziazione e la proliferazione. Una caratterizzazione completa di queste proteine fornisce informazioni ricche per la scoperta di biomarcatori, identificazione del tipo cellulare, e la selezione della droga-obiettivo, oltre a contribuire ad avanzare la nostra comprensione della biologia e fisiologia cellulare. Proteine di superficie, tuttavia, presentano notevoli difficoltà analitiche, a causa della loro intrinsecamente bassa abbondanza, elevata idrofobicità e pesanti modificazioni post-traduzionali. Approfittando della glicosilazione prevalente sulle proteine di superficie, vi presentiamo qui un approccio glicopeptide-capture high-throughput che integra i vantaggi di diversi esistenti mediante N-glycoproteomics. Il nostro metodo può arricchire i glicopeptidi derivati da proteine di superficie e rimuovere i loro glicani per proteomica facili con LC-MS. La N-glycoproteome risolto comprende le informazione di identità proteine e quantità nonché i loro siti di glicosilazione. Questo metodo è stato applicato a una serie di studi in settori quali cancro, cellule staminali, e tossicità da farmaci. La limitazione del metodo risiede nella scarsa abbondanza di proteine di membrana di superficie, tale da richiedere una relativamente grande quantità di campioni per questa analisi rispetto agli studi centrati sulle proteine citosoliche.
Proteine di superficie cellulare interagiscono con l'ambiente extracellulare e trasmettere i segnali dall'esterno verso l'interno di una cella. Così, queste proteine, incluse le proteine della matrice extracellulare, giocano ruoli critici in tutti gli aspetti della biologia e fisiologia vanno dalla proliferazione, crescita, migrazione, differenziazione all'invecchiamento e così via cellulare. Proteine di superficie funzionano interagendo con altre cellule, proteine e piccole molecole 1-3. Caratterizzazione molecolare di proteine della superficie cellulare è di grande interesse non solo per i biologi ma anche per le aziende farmaceutiche, come più del 60% dei farmaci sono mirati alle proteine della superficie cellulare 4.
Spettrometria di massa tandem (MS), con la sua straordinaria sensibilità, precisione e velocità per l'identificazione di proteine e peptidi, è stato un potente strumento per studi di proteomica globali 5,6. Eppure, proteine di superficie pongono sfide significative proteomica basati su MS, comeesistono maggior parte delle proteine di superficie in piccole quantità e con modifiche pesanti. Le regioni membrane-spanning delle proteine di superficie li rende idrofobo; questo è particolarmente il caso per le proteine transmembrana multipass. Perciò è difficile da sciogliere proteine di membrana in soluzione acquosa senza l'aiuto di un detersivo; tuttavia l'uso di detergenti generalmente sopprime le prestazioni di HPLC e MS 1,7,8 nella identificazione delle proteine. Pertanto, proteine di membrana sono stati mal caratterizzato proteomica diretti basati LC-MS.
La glicosilazione è una delle più importanti e abbondanti modificazioni post-traduzionali che avvengono nelle proteine della superficie cellulare 9. L'enorme complessità e l'eterogeneità dei glicani ostacolano segnale peptidi 'MS 10. Tuttavia, diversi metodi di proteomica hanno utilizzato questa modifica unica per arricchire proteine di superficie e per rimuovere le frazioni di zucchero da proteine prima analisi LC-MS. Questi metodos comprendono basato lectina affinità cattura 11 e acido borico-based o basati hydrazide-capture chimica 12 così come separazioni cromatografiche idrofili 8,13. La rimozione di glicani trasforma proteine di membrana alle proteine regolari e semplifica drasticamente la caratterizzazione MS. Poiché glicosilazione avviene anche in proteine secrete che hanno elevata solubilità in contrasto con proteine di membrana, molti metodi glicoproteomica sono ottimizzati per le proteine solubili, e tendono ad avere minore selettività glicopeptidi e sensibilità quando viene distribuito proteine di membrana 8,14. Esistono anche altri metodi per arricchire, in particolare, le proteine di superficie cellulare, come quelli che usano ultracentrifugazione 15 e strategie di etichettatura 16. Un confronto dettagliato tra il nostro metodo e altri metodi esistenti per la caratterizzazione di proteine di membrana è stata condotta recentemente 17, ei risultati hanno indicato che il metodo può eseguire altrettanto bene, se nonmeglio, di tutti i metodi rispetto proteomica membrana, ma con una maggiore semplicità.
Per aiutare i ricercatori utilizzano questo metodo, i dettagli qui un protocollo generale. Questo metodo integra diversi vantaggi di strategie glycoproteomics esistenti ed è stato ideato specificamente per glicoproteine di membrana, ma il metodo funziona ugualmente bene per proteine secrete. Le caratteristiche di questo metodo includono: 1) una completa solubilizzazione delle proteine di membrana, 2) un arricchimento di glicopeptidi invece di glicoproteine per eliminare il potenziale sterico quando si usa un substrato solido cattura, 3) l'uso della chimica idrazide per formare legami covalenti tra glicopeptidi e il substrato di cattura, in modo che i glicopeptidi legati possono tollerare lavaggi stringenti per alta glycoselectivity, e 4) la capacità di condurre l'intera procedura di cattura in una provetta per la perdita di campione ridotto e durata procedura abbreviata. Dopo aver implementato questo metodo per studiare una variabileety di campioni biologici comprese le cellule e tessuti, abbiamo osservato una selettività elevata (> 90%) di glicoproteine 8,17,18.
Qui vi presentiamo una strategia glicopeptide-capture per il profiling di proteine della superficie cellulare. Il metodo può essere applicato per studiare le proteine secrete, come quelle presenti nel sangue, così come in altri fluidi corporei o in cellule di coltura.
Il successo del metodo si basa sulla digestione completa di campioni; Pertanto, una caratterizzazione SDS-PAGE dell'efficienza digestione è necessario, in particolare per l'analisi prima volta di un campi…
The authors have nothing to disclose.
Questa ricerca è stata finanziata dal fondo di avvio della Simon Fraser University.
DTT | Sigma | 646563 | |
TCEP | Sigma | 646547 | |
Iodoacetamide | Sigma | A3221 | |
Rapigest SF | Waters | 186001860 | |
Sodium periodate | Sigma | 311448 | |
PNGase F | New England Biolabs | P0704S | |
Affi-Gel Hz Hydrazide gel | Bio-Rad | 153-6047 | |
Trypsin | Worthington Biomedical | LS02115 | |
Sep-Pak C-18 cartridge | Waters | WAT054955 | |
Oasis MCX cartridge | Waters | 186000252 | |
Protease inhibitor coctail | Sigma | P8340 | |
Urea | Amersco | 568 | |
Sodium sulphite | Caledon | 8360-1 | |
Invertase | Sigma | I0408 | |
Alpha-1 trypsin | Sigma | F2006 | |
Ribonulease B | Sigma | R7884 | |
Avidin | Sigma | A9275 | |
Ovalbumin | Sigma | A5503 | |
Conalbumin | Sigma | C0755 |