Celleoverflateproteiner er biologisk viktig og allment glykosylert. Vi introduserer her en glycopeptide-fangst tilnærming til å oppløse, berike, og deglycosylate disse proteinene for lettvinte LC-MS basert proteomikk analyser.
Celleoverflateproteiner, inkludert ekstracellulære matrix proteiner, delta i alle de store cellulære prosesser og funksjoner, slik som vekst, differensiering og spredning. En omfattende karakterisering av disse proteinene gir fyldig informasjon for biomarkører, celle-type identifikasjon, og narkotika-target utvalg, samt bidra til å fremme vår forståelse av cellebiologi og fysiologi. Overflateproteiner er imidlertid utgjøre betydelige analytiske utfordringer på grunn av deres iboende lave mengde av høy hydrofobisitet, og tunge post-translasjonelle modifikasjoner. Å dra nytte av den rådende glykosylering på overflateproteiner, innfører vi her en høy gjennomstrømming glycopeptide-fangst tilnærming som integrerer fordelene av flere eksisterende N-glycoproteomics midler. Vår metode kan berike glykopeptider utvunnet av overflateproteiner og fjerne sine glykaner for lettvinte proteomikk ved hjelp av LC-MS. Den løst N-glycoproteome omfatter informasjon av protein identitet og kvantitet så vel som sine områder av glykosylering. Denne metoden har vært brukt til en rekke studier i områder, inkludert kreft, stamceller, og narkotika toksisitet. Begrensningen av fremgangsmåten ligger i den lave mengde av overflatemembranproteiner, slik at et relativt stort antall av prøver er nødvendig for denne analyse sammenlignet med studier sentrert på cytosoliske proteiner.
Celleoverflateproteiner kommuniserer med det ekstracellulære miljø og videresende signaler fra utsiden til innsiden av en celle. Således er disse proteinene, inkludert ekstracellulære matriksproteiner, spiller avgjørende roller i alle aspekter av cellulær biologi og fysiologi som strekker seg fra proliferasjon, vekst, migrering, differensiering til aldring og så videre. Overflateproteiner fungere ved å samhandle med andre celler, proteiner og små molekyler 1-3. Molekylær karakterisering av celle-overflateproteiner er av stor interesse ikke bare for biologer, men også for farmasøytiske selskaper, som mer enn 60% av narkotika er målrettet mot celle-overflateproteiner fire.
Tandem massespektrometri (MS), med sin overlegne følsomhet, nøyaktighet og gjennomløp for identifisering av proteiner og peptider, har vært et kraftig verktøy for globale proteomic studier 5,6. Likevel, overflateproteiner utgjøre betydelige utfordringer til MS-baserte proteomikk, somde fleste overflateproteiner finnes i lave mengder og med tunge modifikasjoner. Membran-spenner regioner av overflaten proteiner gjør dem hydrofobe; Dette er særlig tilfelle for multipass transmembrane proteiner. Det er således vanskelig å løse opp membranproteiner i vandige oppløsninger uten hjelp av en detergent; men bruken av vaskemidler generelt undertrykker utførelsen av HPLC og MS 1,7,8 i protein identifikasjon. Derfor har membran proteiner er dårlig karakterisert i direkte LC-MS basert proteomikk.
Glykosylering er en av de viktigste og mest rikelig post-translasjonelle modifikasjoner som finner sted i celle-overflateproteiner 9. Den enorme kompleksitet og heterogenitet av glykaner hemme peptider 'MS signal 10. Likevel har flere proteomikk metoder brukt denne unike modifisering å berike overflateproteiner og å fjerne sukkerdelene fra proteiner før LC-MS analyse. Disse metodes omfatter lektin-basert affinitet capture 11 og hydrazid-baserte eller borsyre-basert kjemisk capture 12 så vel som hydrofile kromatografiske separasjoner 8,13. Fjerning av glykaner forvandles membran proteiner til vanlige proteiner og drastisk forenkler MS karakterisering. Fordi glykosylering forekommer også i utskilte proteiner som har høy oppløselighet i motsetning til membran proteiner, er mange glycoproteomic metoder optimalisert for løselige proteiner, og har en tendens til å ha lavere glykopeptid selektivitet og følsomhet når det blir utplassert til membran proteiner 8,14. Andre metoder finnes også for å berike, særlig celle-overflateproteiner, slik som de ved hjelp av ultrasentrifugering 15 og merking strategier 16. En detaljert sammenligning mellom vår fremgangsmåte og andre eksisterende metoder for å karakterisere membranproteiner ble utført nylig 17, og resultatene indikerte at vår metode kan utføre like godt, om ikkebedre enn alle de sammenlignede membran proteomikk metoder, men med større enkelhet.
For å hjelpe forskere bruker denne metoden, vi detalj her en generell protokoll. Denne fremgangsmåten integrerer flere fordeler på eksisterende glycoproteomics strategier, og er utviklet spesielt for membran-glykoproteiner, men metoden fungerer like godt for utskilte proteiner. Det som kjennetegner denne fremgangsmåten innbefatter: 1) en fullstendig oppløsning av membranproteiner, 2) en berikelse av glykopeptider istedenfor glykoproteiner for å eliminere den potensielle steriske hindring ved bruk av en faststoff fange substrat, 3) ved bruk av kjemi-hydrazid for å danne kovalente bindinger mellom glykopeptider og fange substrat, slik at de bundne glykopeptider tåler høye vaskinger for høy glycoselectivity, og 4) evnen til å utføre hele fangst prosedyren i ett rør for redusert prøvetap og forkortet prosedyre varighet. Etter gjennomføring av denne metoden for å studere en variety av biologiske prøver, inkludert celler og vev, ble det observert en høy selektivitet (> 90%) for å glykoproteiner 8,17,18.
Her introduserer vi en glycopeptide-fangst strategi for profilering celle-overflateproteiner. Fremgangsmåten kan brukes til å studere utskilte proteiner, slik som de i blodet samt i andre kroppsvæsker eller i cellekulturmediet.
Suksessen til den metoden er avhengig av den komplette fordøyelsen av prøver; Derfor, er en SDS-PAGE karakterisering av fordøyelseseffektivitet nødvendig, spesielt for det første tids analyse av en prøve. En komplett fordøyelse kan være utfordrende for memb…
The authors have nothing to disclose.
Denne forskningen har vært støttet av oppstartsfond av Simon Fraser University.
DTT | Sigma | 646563 | |
TCEP | Sigma | 646547 | |
Iodoacetamide | Sigma | A3221 | |
Rapigest SF | Waters | 186001860 | |
Sodium periodate | Sigma | 311448 | |
PNGase F | New England Biolabs | P0704S | |
Affi-Gel Hz Hydrazide gel | Bio-Rad | 153-6047 | |
Trypsin | Worthington Biomedical | LS02115 | |
Sep-Pak C-18 cartridge | Waters | WAT054955 | |
Oasis MCX cartridge | Waters | 186000252 | |
Protease inhibitor coctail | Sigma | P8340 | |
Urea | Amersco | 568 | |
Sodium sulphite | Caledon | 8360-1 | |
Invertase | Sigma | I0408 | |
Alpha-1 trypsin | Sigma | F2006 | |
Ribonulease B | Sigma | R7884 | |
Avidin | Sigma | A9275 | |
Ovalbumin | Sigma | A5503 | |
Conalbumin | Sigma | C0755 |