Summary
الليزر التي يسببها انهيار الطيفي التي أجريت على الجهاز رقيقة وأنسجة الورم بنجاح الكشف عن العناصر الطبيعية وحقن الجادولينيوم مصطنع (ش ج)، صدر من مقرها النانوية ش ج. وصلت الصور من العناصر الكيميائية قرار من 100 ميكرون والكمية حساسية الفرعية ملي. توافق الإعداد مع المجهر الضوئي القياسية ويؤكد قدرته على تقديم صور متعددة من نفس الأنسجة البيولوجية.
Abstract
تم تطبيق التحليل الطيفي الانبعاثات من البلازما التي يسببها الليزر لتحليل العناصر من العينات البيولوجية. الليزر التي يسببها انهيار الطيفي (LIBS) التي أجريت على أقسام رقيقة من الأنسجة القوارض: الكلى والأورام، يسمح للكشف عن عناصر غير عضوية مثل (ط) نا، الكالسيوم، النحاس، والمغنيسيوم والفوسفور، والحديد، موجودة بشكل طبيعي في الجسم و (ب) سي وكلمة المدير العام، الكشف عن بعد حقن جزيئات الجادولينيوم القائم. الموت الرحيم كانت الحيوانات 1-24 ساعة بعد الحقن في الوريد من الجسيمات. تفحص ثنائي الأبعاد من العينة، التي أجريت باستخدام المصغر مرحلة 3D بمحرك، سمحت شعاع ليزر الأشعة تحت الحمراء استكشاف السطح مع قرار الجانبية أقل من 100 μ م. تم الحصول على الصور العنصر الكيميائي والكمي كلمة المدير العام داخل الجهاز مع حساسية الفرعية ملي. يقدم LIBS طريقة بسيطة وقوية لدراسة توزيع المواد غير العضوية دون أي labeli محددةنانوغرام. وعلاوة على ذلك، وتوافق الإعداد مع المجهر الضوئي القياسية ويؤكد قدرته على تقديم صور متعددة من الأنسجة البيولوجية نفسه مع أنواع مختلفة من الاستجابة: عنصري، الجزيئية أو الخلوية.
Introduction
وحث تطوير واسعة من التطبيقات البيولوجية النانوية لتحسين موازية من التقنيات التحليلية لتحديد قيمتها والتصوير في العينات البيولوجية. عادة ما تكون مصنوعة الكشف ورسم الخرائط من الجسيمات النانوية في الأجهزة عن طريق مضان المجهري متحد البؤر أو. للأسف هذه الأساليب تتطلب وضع العلامات من الجسيمات النانوية عن طريق صبغة الأشعة تحت الحمراء القريبة التي يمكن تعديل biodistribution من الجسيمات النانوية، وخاصة بالنسبة للجزيئات صغيرة جدا وذلك بسبب خصائصه مسعور. الكشف عن الجسيمات النانوية المسمى، وخصوصا جزيئات صغيرة جدا (حجم <10 نانومتر)، وبالتالي قد تتداخل مع biodistribution بهم على نطاق الجسم كله ولكن أيضا على الصعيدين الأنسجة والخلايا. تطوير أجهزة جديدة قادرة على الكشف عن الجسيمات النانوية دون أي وسم يقدم إمكانيات جديدة لدراسة سلوكهم وحركية. وعلاوة على ذلك، فإن دور العناصر النزرة مثل الحديد والنحاس في الدماغ والأمراض لوالأمراض العصبية مثل مرض الزهايمر د 1، مينكس 2،3، أو 4 ويلسون توحي الفائدة لدراسة وحصر هذه العناصر في الأنسجة.
وقد استخدمت تقنيات مختلفة لتوفير الخرائط عنصري أو التحليل الدقيق من مواد مختلفة. في ورقة استعراضها نشرت في عام 2006، R. Lobinski وآخرون. تقديم لمحة عامة عن التقنيات القياسية المتوفرة عن التحليل الدقيق عنصري في البيئة البيولوجية، واحدة من أكثر البيئات تحديا للعلوم التحليلية 5. ومسبار مجهري الإلكترون، الذي يتكون من الطاقة التشتت التحليل الدقيق للأشعة السينية في المجهر الإلكتروني النافذ، يمكن تطبيقها على العديد من الدراسات إذا كان تركيز عنصر غير كافية (> 100-1،000 ميكروغرام / غرام). لتصل إلى أقل حدود الكشف، وقد استخدمت الأساليب التالية:
- شعاع ايون مجهري باستخدام الجسيمات الناجمة عن الأشعة السينية الانبعاثات μ-عنصورة (1-10 ميكروغرام / غرام) 6
- SYNchrotron التحليل الدقيق الإشعاع μ-SXRF (0.1-1 ميكروغرام / غرام) 7
- SIMS الثانوية مطياف الكتلة ايون (0.1 ميكروغرام / غرام) 8
- التذرية الليزر بالحث مطياف الكتلة ICP-LA-MS (وصولا الى 0.01 ميكروغرام / غرام) 9،10
توفير التقنيات المذكورة أعلاه القرار المصغر كما هو مبين في الجدول رقم 1 المستخرجة من Lobinski وآخرون.
ويمكن أيضا أن تقترح إعادة الإعمار 3D التحقيقات 2D المسلسل لإعادة بناء الأنسجة العميقة 11. ومع ذلك، وجميع الأجهزة والأنظمة تتطلب كل من المهنيين المؤهلين، معتدلة الى معدات باهظة الثمن للغاية وتجارب طويلة الأمد (عادة أكثر من 4 ساعات للحصول على 100 ميكرون × 100 ميكرون لμ-SXRF و 10 ملم × 10 ملم لLA-ICP-MS ) 12. تماما، هذه المتطلبات تجعل التحليل المجهري عنصري تقييد جدا ومتوافق مع أنظمة التصوير الضوئي التقليدية،المجهر مضان أو غير الخطية المجهري. نقطة أخرى أننا يمكن أن نذكر هنا هو أن القدرة على القياس الكمي لا يزال محدودا للغاية، ويعتمد على توفر معايير المختبر مطابقة مصفوفة. فإن التعميم مزيد من استخدام التحليل المجهري عنصري في عمليات الصناعة والجيولوجيا والبيولوجيا وغيرها من المجالات من تطبيقات توليد اختراقات المفاهيمية وتكنولوجية كبيرة.
الغرض من هذا المخطوط هو اقتراح حلول لرسم الخرائط عنصري الكمي (أو التحليل الدقيق عنصري) في الأنسجة البيولوجية مع الأجهزة المكتبية متوافقة تماما مع المجهر الضوئي التقليدية. ويستند نهجنا على انهيار الطيفي المستحث بالليزر (LIBS التكنولوجيا). في LIBS، وتركز نبضة ليزر على عينة من الفائدة لخلق انهيار والشرارة للمادة. يتم تحليل الإشعاع الذري المنبعث في البلازما في وقت لاحق من قبل مطياف وelemenويمكن استرجاع تركيزات التل مع معايرة أداء مسبقا 13،14. وتشمل مزايا LIBS حساسية (ميكروغرام / غرام تقريبا لجميع العناصر)، الاكتناز، وإعداد العينات الأساسية جدا، وعدم وجود اتصال مع العينة، استجابة فورية وموضعية على وجه التحديد (الصغرى) تحليل السطح. ومع ذلك، فإن تطبيق التصوير كيميائية في أنسجة يبقى تحديا منذ التذرية الليزر من الأنسجة يجب أن يسيطر على أداء ناعما خرائط لقرار مكانية عالية جنبا إلى جنب مع حساسية في ميكروغرام / g نطاق 15،16.
مع مثل هذا الحل، ليست هناك حاجة لتجاور من استشفاف أو وكلاء وضع العلامات، والذي يسمح الكشف عن العناصر غير العضوية مباشرة في بيئتها الأصلية في الأنسجة البيولوجية. الصك LIBS ضعت في مختبرنا يقدم القرار الحالي أقل من 100 ميكرون مع حساسية المقدرة لكلمة المدير العام أقل من 35 ميكروغرام / غرام، أي ما يعادل 0.1 ملي 16، والذي يسمحرسم خرائط لعينات كبيرة (> 1 سم 2) في غضون 30 دقيقة. بالإضافة إلى ذلك، برامج محلية الصنع يسهل اقتناء واستغلال البيانات. يتم استخدام هذه الأداة للكشف عن، الخريطة، وتحديد توزيع الأنسجة من الجادولينيوم النانوية (ش ج) المستندة إلى 17-18 في الكلى وعينات الورم من الحيوانات الصغيرة، من 1 إلى 24 ساعة بعد الحقن في الوريد من الجسيمات (حجم <5 نانومتر) . العناصر غير العضوية، والتي ترد في جوهرها في الأنسجة البيولوجية، مثل الحديد، الكالسيوم، الصوديوم، و ف، كما تم الكشف عن وتصويرها.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. إعداد نموذج البيولوجي
تمت الموافقة على جميع التجارب الموضحة في هذه الدراسة من قبل لجنة رعاية الحيوان واستخدام لCECCAPP (ليون، فرنسا) (إذن LYONSUD_2012_004 #)، وأجريت التجارب تحت إشراف الأفراد المصرح لهم (L. Sancey، DDPP إذن # 38 05 32).
- إضافة 1 مل من H 2 O إلى 100 ميكرومول النانوية المستندة إلى الجادولينيوم (ش ج)، وانتظر 15 دقيقة، وإضافة 20 ميكرولتر من HEPES 50 ملي، كلوريد الصوديوم 1.325 M، و CaCl 2 20 ملي إلى 100 ميكرولتر من H 2 O و 80 ميكرولتر من الحل الأساسي للالنانوية يستند GD-للحصول على حل 200 ميكرولتر في 40 ملي جاهزة للحقن (المدينة: فيلوربان، في المختبر).
- حقن جزيئات حل يستند GD-200 ميكرولتر عن طريق الوريد إلى تخدير القوارض الحاملة للورم (المدينة: ليون سود (Oullins)، على بعد 15 كم من المختبر).
- 1-24 ساعة بعد الحقن، والتضحية الفئران ود وضع العينات البيولوجية في نظير البنتان تبريده بواسطة النيتروجين السائل. تخزين العينات في - 80 ° C (المدينة: ليون سود (Oullins)، على بعد 15 كم من المختبر).
- شريحة العينة (المدينة: عادة غرونوبل، و 100 كم من المختبر؛ سأحاول أن يكون لها وصول ليون في الجنوب) في 100 ميكرون سميكة شرائح ووضع الشرائح البيولوجية على أطباق بلاستيكية معينة (طبق بيتري). المحل في -80 درجة مئوية.
ملاحظة: الأطباق البلاستيكية هي في الأساس عينة البوليمر نقية جدا. يتم استخدامها لتجنب التداخل مع العناصر الواردة في الأنسجة.
2. إعداد نموذج للمعايرة
- إعداد قارورة مع زيادة جرعة من جسيمات متناهية الصغر استنادا GD-في الماء (0 نانومتر، 100 نانومتر، 500 نانومتر، 1 ميكرومتر، ميكرومتر 5، 10 ميكرومتر، ميكرومتر 50، و 100 ميكرومتر، 500 ميكرومتر، 1 ملم، و 5 ملم).
- وضع ميكرولتر الإفلات 5 من كل حل متباعدة بصورة منتظمة من قبل 3 ملم على طبق بيتري.
- الجاف في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة.
3. LIBS التجربة
- تهيئة الإعداد LIBS
- إعدادات الليزر. بعد التبديل على الصكوك، انتظر 10-20 دقيقة لتحقيق الاستقرار الطاقة نبضة ليزر وتهدئة للكاميرا ICCD إلى -20 درجة مئوية. ضبط الطاقة النبض مع المخفف.
ملاحظة: المعلمات الليزر الأمثل لأنسجة رسم الخرائط هي 5 NSEC مدة النبضة، 1،064 نانومتر الطول الموجي، والطاقة نبض حوالي 4 ميغا جول. الليزر يستخدم هو بدون تاريخ النموذجية: YAG الليزر نانوثانية. - LIBS إعدادات. تعيين موضع التركيز ليزر (مع الاحترام لسطح العينة) للحصول على فوهة قطرها أصغر (حوالي 50 ميكرون أو أقل).
ملاحظة: هذا يناظر تبؤر نبضة ليزر 100 ميكرومتر تحت سطح العينة. - إعدادات مطياف. استخدام مطياف تشيرني تيرنر جنبا إلى جنب مع 1،200 خطوط / مم صريف والزمانية كاميرا عالية الدقة ICCD. السيطرة على جميع هذه الأجهزة عن طريق الكمبيوتر. تعيين قيمة فتحة المدخلات إلى 40 ميكرون. إعادة تعيين نطاق الطيفيصة عنصر ليتم تحليلها. استخدام النطاق الطيفي تغطي 325-355 نانومتر لكشف كلمة المدير العام مع حساسية عالية، وكذلك نا، والنحاس والكالسيوم. تعيين المعلمات ICCD مع تأخير ل300 NSEC، بوابة من 2 μsec، ومكسب من 200.
- إعدادات الليزر. بعد التبديل على الصكوك، انتظر 10-20 دقيقة لتحقيق الاستقرار الطاقة نبضة ليزر وتهدئة للكاميرا ICCD إلى -20 درجة مئوية. ضبط الطاقة النبض مع المخفف.
- قياس رسم الخرائط
- وضع عينة بيولوجية على صاحب العينة LIBS آلية.
- ضبط ارتفاع العينة وفقا للموقف تركيز الليزر.
- اتخاذ عالية الدقة صورة للشريحة العينة.
- تعيين وحدة رسم الخرائط من برنامج الحصول على LIBS لتنفيذ خريطة مع عادة 100 × 100 نقطة القياس متباعدة بقرار من حوالي 100 ميكرون.
- بدء عملية الاستحواذ. من هذه النقطة أتمتة كل شيء؛ المتحرك تسلسل فضلا عن تسجيل الطيف والادخار. ويلزم 40 دقيقة للتعيين من 10،000 نقطة (أي ما يعادل 1 سم 2 للقرار 100 ميكرون). إعادة تجميع كل أطياف سجلت في ملف واحد.
- عندما وinished، التقاط صورة الثاني من شريحة عينة
- قياس المعايرة
مع نفس المعلمات التجريبية، وقياس عينات المعايرة (للحصول على تفاصيل إعداد، انظر القسم 2). تنفيذ خريطة أو سجل 25 الأطياف (تم الحصول عليها من مواقع القياس في مركز من جانب انخفاض) في كل من قطرات المعايرة.
4 LIBS تحليل الطيف: انشاء الصور الكيميائية
- سجل كل أطياف LIBS من تعيين الأنسجة وتحميلها في تحليل البرامج LIBS. طرح خط الأساس لكل الطيف وبناء الصور الكيميائية مع مقياس الكثافة النسبية باستخدام لون كاذبة.
ملاحظة: خوارزمية باسترداد شدة سطر معين، مثل كلمة المدير العام، النحاس، الصوديوم، الكالسيوم أو. - تنفيذ نفس العملية على قياس الأطياف من عينة معايرة للسماح حساب منحنيات المعايرة (العلاقة بين كثافة وتركيز) وبناء عبد القديرخريطة uantitative أو صورة لكلمة المدير العام (أو عنصر آخر من الفائدة).
- تطبيق العلاج الكافي للصور الكيميائية، مثل الاستيفاء أو تمهيد. حفظ شدة أو تركيز الخرائط في شكل صورة (صورة نقطية).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
كما هو مبين في الشكل 1، وشعاع من الثانية: YAG الليزر وتركز في الطول الموجي الأساسية لل1،064 نانومتر رأسيا لأسفل على شريحة الأنسجة بواسطة عدسة الكوارتز 50 مم المسافة البؤرية. كان نبض الطاقة 4 ميغا جول هرتز ومعدل الرسوب 10. من أجل تجنب توليد البلازما في الهواء، وتركز شعاع الليزر نحو 100 ميكرون تحت سطح العينة. لم يلاحظ أي البلازما الجوية في هذه الحالة. خلال التجارب، تم نقل عينة من خطوة المحرك من أجل توليد البلازما واحدة في موقف واحد فقط على عينة (طلقة واحدة). وأظهر الملاحظة المجهرية من الحفر ولدت على الركيزة حفرة يبلغ قطرها أقل من 50 ميكرون. تم تصوير البلازما التي تم إنشاؤها بواسطة زوجين من العدسات على مدخل الألياف الضوئية مرتبطة في الطرف الآخر لطيف تشيرني موالف مجهزة صريف 1،200 ملم في خطوط (اشتعلت النار في 300 نانومتر). وقد شنت كاميرا ICCD على المستوى البؤري الناتج من مقياس الطيفلتسجيل الطيف. خلال القياسات، ويتم رصد ارتفاع سطح العينة (فيما يتعلق موقف التركيز ليزر) باستخدام طريقة المثلثية مع شعاع الحادث بشكل غير مباشر من مستوى منخفض ليزر ديود CW الطاقة على سطح العينة وكاميرا مراقبة اتفاقية مكافحة التصحر. تم تشغيل ICCD بواسطة الليزر Q-التبديل و400 NSEC وتم تعيين 2 μsec التوالي للتأخير والبوابة المعلمات. خلال رسم الخرائط، وتحول عينة من إزاحة 100 ميكرون بعد كل طلقة ليزر. وقد سجلت واحدة من الطيف لكل طلقة ليزر. برامج محلية الصنع وضعت في بيئة تسيطر عليها ابفيف المعدات بأكمله ويسمح لأداء التسلسل الآلي لمسح المنطقة من مصلحة عينة الأنسجة الجانبي لقرار معين.
ويرد مثال على أطياف طلقة واحدة، وسجلت في مناطق مختلفة من نسيج الكلى بعد الرابع حقن جزيئات مقرها كلمة المدير العام في الشكل 2. تم توليفها النانوية كما described في ميجنوت وآخرون 17. لفترة وجيزة، وتتكون من جزيئات مصفوفة polysiloxane، وعقد DOTAGA-GD 3 + يخلب على سطحها. يتم تطوير لأنها (ط) التصوير متعدد الوسائط لأنها يمكن أن تستخدم في التصوير بالرنين المغناطيسي، والتصوير النووي والتصوير مضان، بشكل منفصل أو في وقت واحد، و (ب) وظيفة علاجية كما radiosensitizer (أي زيادة محليا كفاءة العلاج الإشعاعي) 18. المدى الطيفي المستخدمة (286-320 نانومتر) يتيح الكشف عن عناصر مختلفة مثل ش ج، الكالسيوم، الحديد، سي، و آل. وسجلت الطيف الأزرق في المنطقة الوسطى من الكلى (النخاع)، يتفق مع الطيف الأحمر إلى الغشاء الكلى (الكبسولة) والطيف الأخضر لمنطقة الطرفية (القشرة). ومن الجدير بالذكر أيضا أن كلمة المدير العام، سي، القاعدة، الكالسيوم، والحديد كثافات متغيرة على نطاق واسع في مناطق مختلفة، مما يشير إلى عدم تجانس كبير من تركيزات هذه العناصر داخل الأنسجة. أساسا كلمة المدير العام وكانت تحتوي على سي في GD-قاعدةد النانوية، وكان الحديد محددة للأوعية الدموية، الكالسيوم من العينة البيولوجية نفسها.
تم تحليل عينات الأنسجة شريحة بقعة بقعة من قبل، والانتقال العينة في موقف X و Y. كان القرار الوحشي يقرب من 100 ميكرون. وقد سجلت واحدة الطيف واحد لكل منصب (قياس طلقة واحدة). تم استخراج شدة خط من الأطياف باستخدام الطرح الخلفية. كانت الصور الكيميائية ثم شيدت من هذه الشدة. ويرد مثال في الشكل 3 لش ج، سي والحديد. وتظهر الخطوط المستخدمة لبناء هذه الصور الكيميائية في الجدول 2. ارتبط التحليل إلى التصوير الملون من عينة بيولوجية قبل التجربة لتحسين التعريب ورسم الخرائط من عناصر مختلفة. في الكلى، فإن الإشارات كلمة المدير العام وسي شارك المترجمة، ولكن هذا التعاون لا تتناسب مع التعريب توزيع الحديد، مما يدل على أن توزيع محددة.
سيميوتم الحصول على نتائج لار مع عينات الورم. ويرد مثال على القياس على SQ20B أنسجة الورم في الشكل 4. في هذه الحالة، والخريطة الكيميائية للكلمة المدير العام، كما هو موضح مع نطاق اللون كاذبة، وقد تم متراكبة إلى الصورة الضوء الطبيعي. لهذا القياس، فقد تم إجراء التحليل الكمي لاسترداد تركيز الجادولينيوم المحلية (راجع الإجراء في قسم البروتوكول). لهذه التجربة، كانت تدار النانوية مباشرة داخل الورم الذي أزيل 1 ساعة بعد الحقن وشرائح للتحليل. كما رأينا في الشكل 4، والجزيئات تنتشر في الأنسجة من نقطة الحقن في وسط الورم إلى المحيط. 1 ساعة بعد الحقن، ما يقرب من نصف حجم الورم يحتوي على بعض الجسيمات. مثل هذه الخرائط يمكن أن تساعد على توفير المعلومات حول بروتوكول العلاجي. لفعالية الأمثل للعلاج، يجب النانوية منتشر داخل الورم بأكمله؛ بعد 1 ساعة، ها فقط LF الورم يحتوي على بعض الجزيئات، مما يوحي بأن وقتا أطول نشرها ستكون هناك حاجة لنشر الأمثل وبالتالي العلاج الفعال.
الجدول 1. الرئيسية تحل مكانيا التقنيات التحليلية للتصوير عنصري الكيميائية. (Lobinski آخرون 5). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الجدول.
الشكل 1. عرض تخطيطي من الإعداد التجريبية LIBS المستخدمة. (15-شعار روس وآخرون).
: together.within المحافظة على صفحة = "دائما"> 
الشكل 2. LIBS أطياف احد بالرصاص الحصول عليها في ثلاث مناطق مختلفة من نسيج الكلى، وهذه المناطق هي النخاع (الجزء المركزي من الكلى)، الكبسولة باللون الأحمر والقشرة باللون الأخضر. وقد تم نقل أطياف عموديا من أجل الوضوح.
الرقم 3. LIBS رسم الخرائط عنصري من ش ج، سي، والحديد في شريحة من الكلى الماوس أعدت وفقا للشروط المحددة في النص. يتم التعبير عن كثافة حجم الصور الكيميائية في وحدة تعسفية. ويرد التصوير الضوء الطبيعي أيضا في الجانب الأيسر العلوي من هذا الرقم.
الجدول 2. خطوط الطيفية المستخدمة للكشف عن كلمة المدير العام، سي، والحديد في الكلى الماوس (وصفت خطوط الذرية وأنا وصفت خطوط الأيونية الثاني).
الشكل 4. LIBS رسم الخرائط الكمي للكلمة المدير العام داخل شريحة من نسيج الورم. تدير نطاق اللون كاذبة من 0.1 ملي (الأخضر) إلى 20 ملي (البنفسجي).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
تطبيقها على عينة بيولوجية، وهذا الأسلوب يسمح التصوير الكيميائية، أي التعيين والتحديد الكمي، من كلمة المدير العام وسي من حقن جزيئات مقرها كلمة المدير العام في الأجهزة المختلفة. من إعدادات الحرجة الرئيسية، والسيطرة على خصائص الليزر (الطول الموجي والطاقة النبض، والتركيز، والاستقرار) أمر بالغ الأهمية لالاجتثاث الأنسجة دقيقة وغرامة (أي قرار التعيين)، وكذلك للحساسية. يعمل في الطاقة العالية يوفر حساسية أفضل ولكن للأسف يولد القرار المكانية المتدهورة. الى جانب ذلك، يجب أن يتم التحقق نوع مطياف استخدامها بعناية. في الأساس، وتحقيق النطاق العريض (على سبيل المثال باستخدام مطياف ECHELLE) تسمح خيار كبير من الأنواع عنصري ولكن مع انخفاض الحساسية، في حين باستخدام مطياف تشيرني تيرنر (مجهزة ICCD أو PMT) سيسمح الكشف عن عدد أقل من العناصر ولكن مع الكثير أكثر حساسية. ينبغي تعديل كافة الإعدادات المختارة من مجموعة بحثها الطول الموجي لعurpose التحقيق.
فيما العينة البيولوجية نفسها، وسمك وصلابة قد تتداخل أيضا مع نوعية من الطيف. سيتم رش عينة رقيقة جدا تماما وسيتم هاجم دعم عينة أيضا من تسديدة ليزر، في حين قد يعانون عينة سميكة جدا من لها في تجانس دستورها التي سيتم ترددت أصداؤها على تجانس في كمية رش المسألة (وجود السفن الكبيرة الخ). من دراسة عنصري، قد يكون من المتوقع اختيار الدعم؛ على سبيل المثال، إذا كان العنصر هو التحقيق سي، يجب أن يودع العينة على البلاستيك النقي ولكن ينبغي تجنب الزجاج حيث أنه يحتوي على كميات كبيرة من سي. وبالمثل، قد يكون مستعدا العينة وثابتة في ظروف محددة لمنع أي مكون من تثبيتي لتلويث مستوى العنصر دراستها.
قد تكون هذه التقنية مفيدة جدا لتحليل عينات ما قبل السريرية. LIBS فصول التوجيه الجامعيتسمح دينار الكشف عن العناصر المعدنية غير طبيعية مثل الحديد والنحاس، وبخاصة في عينات الدماغ. وجود قيود خاصة مع الحديد يجب أن تكون نسبة عالية من الحديد في الهيموغلوبين؛ عينة أعدت بعناية وتقييم مقايسة المعايرة إلزامي. في مجال التكنولوجيات الحيوية المطبق في البيولوجيا أو الطب، يمكن أن تسمح LIBS الكشف عن أي مجمع أو الجسيمات التي تحتوي على عنصر معين مثل الاتحاد الافريقي، كلمة المدير العام، النحاس، الخ
والأجهزة مقعد بين كبار متوافقة تماما مع المجهر الضوئي القياسية، مما يدل على استخدام إمكاناتها الكبيرة في علم الأحياء والطب كأداة للمراقبة متكاملة من العناصر المعدنية التتبع. هذا النوع من التصوير عنصري، والجمع بين قرار الوحشي عالية (<50 ميكرون) مع حدود الكشف منخفضة (في نطاق ملغ / كلغ)، ويشمل عموما مستوى عال من المعدات المطلوبة، مثل التحليل الدقيق الإشعاع السنكروتروني (SXRF) أو الاستئصال بالليزر بالحث الطيف الشامل مترى (LA-ICP-MS)، مما يجعلها مقيدة للغاية ومتوافق مع أنظمة التصوير المجهري متاحة تجاريا. والأجهزة LIBS ليست مكلفة جدا، وهذا يتوقف هذا القرار والحساسية المطلوبة (السعر بين 100 و 200 ك €). حاليا يمكن تحليلها على 1 سم 2 عينة داخل 30-40 دقيقة؛ هذه المرة الاستحواذ قد لا تغيير بعد إضافة التقنيات المجهرية الأخرى مثل الكشف عن مضان والتصوير الملون من العينة. 100 ميكرون القرار المكانية الحالية يظهر بالفعل فعالية لرسم الخرائط من الأنسجة البيولوجية. ومع ذلك، فإن هذا القرار يمكن أن تحسن كبير باستخدام المجهر الضوئي بدلا من عدسة بسيطة لتركيز نبضة ليزر الاجتثاث. يمكن من الناحية النظرية يتم التوصل القرار ميكرومتر، على الرغم من حساسية سوف ينخفض، كما سيتم ذاب أقل من المواد. أن زيادة الدقة إلى 10 ميكرون تسمح لتوطين دقيقة من الجسيمات النانوية التي يتعين مراعاتها على مستوى الخلية.
"jove_content"> وفي الختام، LIBS هي التكنولوجيا الجديدة التي تنطبق على الكشف النوعي والكمي لعناصر في عينات الأنسجة. هذا النهج هو حساسة (ميكروغرام / غرام)، سريع (حاليا 10 القياسات / ثانية)، وبأسعار معقولة، وسهلة لتنفيذ والاستخدام، ومتوافقة تماما مع المجهر الضوئي التقليدية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
والكتاب ليس لديهم ما يكشف.
Acknowledgments
المؤلفين الامتنان الدعم المالي من قبل Labex-Imust.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Laser nanosecond Nd:YAG | Quantel | Brillant | 5 nsec pulse width, wavelength 1,064 nm |
| Spectrometer | Andor Technology | Shamrock 303 | with 1,200 lines/mm blazed at 300 nm grating |
| Detector ICCD | Andor Technology | Istar | 2 nsec temporal resolution |
| LIBS Unit | ILM | Homemade Instrumentation | |
| Gd-based nanoparticles | Nano-H | particles | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | for particle's dilution |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | 21108 | for particle's dilution |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S5886 | for particle's dilution |
| Mice | Charles River | depending of animal breeding | |
| Isoflurane | Coveto / Virbac | for anaesthesia - Isofluranum | |
| Isopentane | Sigma-Aldrich | 59060 | to froze the sample slowly |
| Liquid nitrogen | Air Liquide | to cool down the isopentane | |
| Cryostat | Leica | CM-3050S | to slide the samples |
| Petri dishes | Dutscher | 353004 | to stick the sample |
References
- Smith, M. A., Harris, P. L., Sayre, L. M., Perry, G. Iron accumulation in Alzheimer disease is a source of redox-generated free radicals. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94, 9866-9868 (1997).
- Wang, Y., Zhu, S., Weisman, G. A., Gitlin, J. D., Petris, M. J. Conditional knockout of the Menkes disease copper transporter demonstrates its critical role in embryogenesis. PloS one. 7, (2012).
- Reske-Nielson, E., Lou, H. O., Andersen, P., Vagn-Hansen, P. Brain-copper concentration in Menkes' disease. Lancet. 1, 613 (1973).
- Hayashi, H., et al. Various copper and iron overload patterns in the livers of patients with Wilson disease and idiopathic copper toxicosis. Medical molecular morphology. 46, (2013).
- Lobinski, R., Moulin, C., Ortega, R. Imaging and speciation of trace elements in biological environment. Biochimie. 88, 1591-1604 (2006).
- Devès, G., Bouhacina, T., Ortega, R. STIM mass measurements for quantitative trace element analysis within biological samples and validation using AFM thickness measurements. Spectrochimica Acta B. 59, 1733-1738 (2004).
- Twining, B. S., et al. Quantifying trace elements in individual aquatic protist cells with a synchrotron X-ray fluorescence microprobe. Analytical chemistry. 75, 3806-3816 (2003).
- Guerquin-Kern, J. L., Wu, T. D., Quintana, C., Croisy, A. Progress in analytical imaging of the cell by dynamic secondary ion mass spectrometry (SIMS microscopy). Biochimica et biophysica acta. 1724, 228-238 (2005).
- Binet, M. R., Ma, R., McLeod, C. W., Poole, R. K. Detection and characterization of zinc- and cadmium-binding proteins in Escherichia coli by gel electrophoresis and laser ablation-inductively coupled plasma-mass spectrometry. Analytical biochemistry. 318, 30-38 (2003).
- Becker, J., Gorbunoff, A., Zoriy, M., Izmer, A., Kayser, M. Evidence of near-field laser ablation inductively coupled plasma mass spectrometry (NF-LA-ICP-MS) at nanometre scale for elemental and isotopic analysis on gels and biological samples. J. Anal. Atom. Spectrom. 21, 19-25 (2006).
- Seeley, E. H., Caprioli, R. M. 3D imaging by mass spectrometry: a new frontier. Analytical chemistry. 84, 2105-2110 (2012).
- Pornwilard, M. -M., Weiskirchen, R., Gassler, N., Bosserhoff, A. K., Becker, J. S. Novel bioimaging techniques of metals by laser ablation inductively coupled plasma mass spectrometry for diagnosis of fibrotic and cirrhotic liver disorders. PloS one. 8, (2013).
- Cremers, D. A., Radziemski, L. J. Handbook of laser-induced breakdown spectroscopy. , Wiley. (2006).
- Miziolek, A. W., Palleschi, V. Laser-Induced Breakdown Spectroscopy: Fundamentals and Applications. , (2006).
- Motto-Ros, V., et al. Mapping nanoparticles injected into a biological tissue using laser-induced breakdown spectroscopy. Spectrochimica Acta Part B. , (2013).
- Motto-Ros, V., et al. Mapping of native inorganic elements and injected nanoparticles in a biological organ with laser-induced plasma. Applied Physics Letters. 101, (2012).
- Mignot, A., et al. A top-down synthesis route to ultrasmall multifunctional Gd-based silica nanoparticles for theranostic applications. Chemistry. 19, 6122-6136 (2013).
- Lux, F., et al. Ultrasmall rigid particles as multimodal probes for medical applications. Angew Chem Int Ed Engl. 50, 12299-12303 (2011).
