Summary
Spectroscopie par claquage induit par laser effectués sur organe mince et le tissu tumoral a détecté avec succès des éléments naturels et gadolinium injecté artificiellement (Gd), émises à partir de nanoparticules à base de Gd. Images d'éléments chimiques ont atteint une résolution de 100 um et de la sensibilité quantitative sous-mM. La compatibilité de l'installation avec la microscopie optique standard souligne son potentiel pour fournir de multiples images d'un même tissu biologique.
Abstract
spectroscopie d'émission de plasma induit par laser a été appliqué à l'analyse élémentaire d'échantillons biologiques. Spectroscopie de rupture induite au laser (LIBS) effectuée sur des coupes minces de tissus de rongeurs: les reins et tumorales, permet la détection des éléments inorganiques tels que (i) Na, Ca, Cu, Mg, P et Fe, naturellement présente dans le corps et (ii) Si et D.ieu, détectés après l'injection de nanoparticules à base de gadolinium. Les animaux ont été euthanasiés 1 à 24 h après l'injection intraveineuse de particules. Un balayage en deux dimensions de l'échantillon, effectuée en utilisant un micrométrique 3D-platine motorisée, laisse le faisceau laser infrarouge à explorer la surface avec une résolution latérale inférieure à 100 μ m. Images chimique quantitative de D.ieu élément intérieur de l'organe ont été obtenus avec la sensibilité sous-mM. LIBS est une méthode simple et robuste pour étudier la distribution de matériaux inorganiques sans labeli spécifiqueng. En outre, la compatibilité de l'installation avec la microscopie optique standard souligne son potentiel à fournir de multiples images de la même tissu biologique avec différents types de réponse: élémentaire, moléculaires ou cellulaires.
Introduction
Le large développement de nanoparticules pour des applications biologiques exhorté l'amélioration parallèle de techniques analytiques pour leur quantification et de l'imagerie dans des échantillons biologiques. Habituellement, la détection et la cartographie des nanoparticules dans les organes sont fabriqués par fluorescence ou microscopie confocale. Malheureusement, ces méthodes nécessitent l'étiquetage des nanoparticules par un colorant infrarouge proche qui peut modifier la biodistribution des nanoparticules, en particulier pour de très petites nanoparticules en raison de ses propriétés hydrophobes. La détection des nanoparticules marquées, et en particulier les très petites nanoparticules (taille <10 nm), pourrait donc interférer avec leur biodistribution à toute l'échelle du corps, mais aussi au niveau de tissus et cellules. Le développement de nouveaux dispositifs capables de détecter des nanoparticules sans étiquetage offre de nouvelles possibilités pour l'étude de leur comportement et de la cinétique. En outre, le rôle des oligo-éléments tels que le fer et le cuivre dans un cerveau maladiesd maladies neurodégénératives telles que la maladie d'Alzheimer 1, Menkes 2,3, ou 4 Wilson suggèrent l'intérêt d'étudier et de localiser ces éléments dans les tissus.
Diverses techniques ont été utilisées pour fournir la cartographie élémentaire ou microanalyse des matériaux différents. Dans leur article de synthèse publié en 2006, R. Lobinski et al. Donne un aperçu des techniques standard disponibles pour la microanalyse élémentaire en milieu biologique, l'un des environnements les plus difficiles pour les sciences analytiques 5. La microsonde électronique, qui se compose de dispersion d'énergie micro-analyse aux rayons X dans un microscope électronique à transmission, peut être appliquée à de nombreuses études, si la concentration de l'élément est suffisante (> 100-1000 pg / g). Pour atteindre des seuils de détection inférieurs, les techniques suivantes ont été utilisées:
- microsonde faisceau d'ions en utilisant des particules induit par émission de rayons X μ-PIXE (1-10 ug / g) 6
- synchrotron microanalyse de rayonnement μ-SXRF (0,1-1 mg / g) 7
- secondaire spectrométrie de masse d'ions SIMS (0,1 pg / g) 8
- ablation laser couplé par induction spectrométrie de masse LA-ICP-MS (à partir de 0,01 pg / g) 9,10
Les techniques mentionnées ci-dessus fournissent une résolution micrométrique comme indiqué dans le tableau 1 extraite de Lobinski et al.
Reconstruction 3D des enquêtes 2D série pourrait également être proposé pour la reconstruction des tissus plus profonds 11. Cependant, tous les appareils et systèmes exigent des professionnels qualifiés, modérés à l'équipement très coûteux et des expériences durables (généralement plus de 4 h pour un 100 um x 100 um pour μ-SXRF et 10 mm x 10 mm pour LA-ICP-MS ) 12. Au total, ces exigences font microanalyse élémentaire très contraignant et incompatible avec les systèmes d'imagerie optique classiques,la microscopie à fluorescence ou microscopie non linéaire. Un autre point que nous ne pouvons mentionner ici est que la capacité de mesure quantitative est encore assez limitée et dépend de la disponibilité des normes de laboratoire adaptation matricielle. La poursuite de la généralisation de l'utilisation de la microanalyse élémentaire dans les processus de l'industrie, de la géologie, de la biologie et autres domaines d'applications va générer des percées conceptuelles et technologiques importants.
Le but de la présente manuscrit est de proposer des solutions pour la cartographie élémentaire quantitative (ou microanalyse élémentaire) dans les tissus biologiques avec une instrumentation de table entièrement compatible avec la microscopie optique classique. Notre approche est basée sur la spectroscopie par claquage laser (technologie LIBS). Dans LIBS, une impulsion de laser est focalisé sur l'échantillon d'intérêt pour créer la ventilation et l'étincelle de la matière. Le rayonnement émis atomique dans le plasma est ensuite analysé par un spectromètre et l'élémentaireconcentrations mentales peuvent être récupérées avec des mesures d'étalonnage effectuées au préalable 13,14. Les avantages de la LIBS comprennent sensibilité (pg / g pour presque tous les éléments), la compacité, la préparation des échantillons très basique, l'absence de contact avec l'échantillon, une réponse instantanée et précisément localisée (micro) analyse de surface. Toutefois, l'application de l'imagerie chimique des tissus reste difficile car l'ablation laser de tissu doit être finement contrôlée pour effectuer des cartes à haute résolution spatiale avec sensibilité dans la gamme pg / g 15,16.
Avec une telle solution, l'adjonction de traceurs ou d'agents d'étiquetage n'est pas nécessaire, ce qui permet de détecter des éléments inorganiques directement dans leur environnement naturel dans les tissus biologiques. L'instrument LIBS développée dans notre laboratoire offre une résolution de courant inférieure à 100 um avec une sensibilité estimée pour Gd-dessous de 35 pg / g, ce qui équivaut à 0,1 mM 16, qui permetla cartographie des grands échantillons (> 1 cm 2) dans les 30 min. En outre, le logiciel maison facilite l'acquisition et l'exploitation des données. Cet instrument est utilisé pour détecter, carte, et de quantifier la distribution tissulaire de gadolinium nanoparticules à base de (Gd) de 17 à 18 dans les reins et les échantillons de tumeur de petits animaux, de 1 à 24 h après l'injection intraveineuse de particules (taille <5 nm) . Les éléments inorganiques, qui sont incorporées à un tissu biologique, tels que Fe, Ca, Na et P, ont également été détectées et imagée.
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Protocol
1. Préparation de l'échantillon biologique
Toutes les expériences décrites dans cette étude ont été approuvés par le Comité de protection et d'utilisation des animaux de la CECCAPP (Lyon, France) (autorisation # LYONSUD_2012_004), et les expériences ont été réalisées sous la supervision de personnes autorisées (L. Sancey, DDPP autorisation # 38 05 32).
- Ajouter 1 ml de H 2 O à 100 pmol de nanoparticules à base de gadolinium-(Gd), attendre 15 minutes, et ajouter 20 ul de HEPES 50 mM, NaCl 1,325 M, CaCl2 20 mM à 100 pi de H 2 O et 80 pi de la solution primaire de nanoparticules à base de Gd pour obtenir une solution de 200 pi à 40 mM prêts à injecter (Ville: Villeurbanne, au laboratoire).
- Injecter la solution de nanoparticules à base de Gd-200 de pi par voie intraveineuse à des rongeurs porteurs de tumeurs anesthésiés (Ville: Lyon Sud (Oullins), à 15 km de laboratoire).
- 1-24 heures après l'injection, les souris sacrifier uned placer les échantillons biologiques dans l'isopentane refroidi par de l'azote liquide. Conserver les échantillons à - 80 ° C (Ville: Lyon Sud (Oullins), à 15 km du laboratoire).
- Couper l'échantillon (Ville: généralement Grenoble, 100 km de laboratoire, je vais essayer d'avoir un accès à Lyon Sud) en 100 diapositives um d'épaisseur et de mettre les diapositives biologiques sur des plats en plastique spécifiques (boîte de Pétri). Conserver à -80 ° C.
Remarque: plats en plastique sont essentiellement un échantillon de polymère très pur. Ils sont utilisés pour éviter les interférences avec les éléments contenus dans le tissu.
2. Préparation de l'échantillon pour l'étalonnage
- Préparer les flacons avec des doses croissantes de nanoparticules à base de Gd dans de l'eau (0 nM, 100 nM, 500 nM, 1 uM, 5 uM, 10 uM, 50 uM, 100 uM, 500 uM, 1 mM et 5 mM).
- Mettez un ul-goutte de chaque solution régulièrement espacées de 3 mm sur la boîte de Pétri 5.
- À sec à la température ambiante pendant 20 min.
3. LIBS Expérience
- Initialisation de la configuration du LIBS
- Paramètres laser. Après la mise sur les instruments, attendre 10-20 min pour l'impulsion laser stabilisation de l'énergie et de refroidissement de la caméra ICCD à -20 ° C. Régler l'énergie d'impulsion avec l'atténuateur.
Remarque: Les paramètres du laser optimales pour les tissus de cartographie sont 5 ns durée d'impulsion, 1064 nm longueur d'onde, et l'énergie d'impulsion d'environ 4 mJ. Le laser utilise un laser Nd est typique: YAG laser nanoseconde. - LIBS Paramètres. Régler la position de focalisation du laser (par rapport à la surface de l'échantillon) pour obtenir le diamètre du cratère plus petit (environ 50 pm ou moins).
Remarque: Ce qui correspond à une focalisation d'impulsions laser de 100 um en dessous de la surface de l'échantillon. - Paramètres du spectromètre. Utilisez le spectromètre Czerny-Turner combiné avec un 1200 traits / mm et une résolution de la caméra ICCD temporelle. Contrôler tous ces dispositifs par ordinateur. Réglez la valeur de la fente d'entrée à 40 um. Définissez la plage spectrale rements concernant l'élément à analyser. Utilisez la gamme spectrale couvrant 325 à 355 nm pour détecter Dieu avec une grande sensibilité, ainsi que Na, Cu et Ca. Définissez les paramètres de l'ICCD avec un retard de 300 ns, une porte de 2 ps, et un gain de 200.
- Paramètres laser. Après la mise sur les instruments, attendre 10-20 min pour l'impulsion laser stabilisation de l'énergie et de refroidissement de la caméra ICCD à -20 ° C. Régler l'énergie d'impulsion avec l'atténuateur.
- Cartographie mesure
- Placer l'échantillon biologique sur le support d'échantillon motorisé LIBS.
- Ajuster la hauteur de l'échantillon en fonction de la position de focalisation du laser.
- Prenez une photo à haute résolution de la tranche d'échantillon.
- Réglez le module de cartographie du logiciel d'acquisition LIBS pour effectuer une carte avec typiquement 100 x 100 points de mesure espacés par une résolution d'environ 100 um.
- Lancement de l'acquisition. De ce point tout automatiser; le déplacement séquence ainsi que l'enregistrement du spectre et l'épargne. 40 min sont nécessaires pour une mise en correspondance des points de 10 000 (équivalent à 1 cm 2 à une résolution de 100 um). Regrouper tous les spectres enregistrés dans un même fichier.
- Lorsque finished, prendre une deuxième photo de la tranche d'échantillon
- Calibration Mesure
Avec les mêmes paramètres expérimentaux, mesurer les échantillons d'étalonnage (pour plus de détails de préparation, voir rubrique 2). Effectuer une carte ou un disque 25 spectres (obtenus à partir de sites de mesure dans la partie centrale de la goutte) dans chacune des gouttes d'étalonnage.
4 LIBS analyse de spectre. Construire des images chimiques
- Record de tous les spectres LIBS de la cartographie du tissu et de les charger dans le logiciel d'analyse LIBS. Soustraire la ligne de base pour chaque spectre et construire les images chimiques avec échelle d'intensité relative en utilisant une fausse couleur.
Remarque: Un algorithme récupère les intensités des raies spécifiques, tels que D.ieu, Cu, Na, Ca ou. - Effectuez la même opération sur les spectres mesurés à partir de l'échantillon calibré pour permettre le calcul des courbes d'étalonnage (relation entre l'intensité et la concentration) et de construire aqcarte uantitative ou l'image pour D.ieu (ou autre élément d'intérêt).
- Appliquer les traitements adéquats pour les images chimiques, tels que l'interpolation ou de lissage. Sauvez les cartes d'intensité ou de concentration dans le format d'image (bitmap).
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Representative Results
Comme le montre la figure 1, le faisceau d'un laser Nd: YAG à la longueur d'onde fondamentale de 1064 nm a été concentré verticalement vers le bas sur la tranche de tissu par une lentille de quartz de 50 mm de distance focale. L'énergie d'impulsion était de 4 mJ et le taux de répétition de 10 Hz. Afin d'éviter la génération de plasma dans l'air, le faisceau laser a été focalisé autour de 100 um sous la surface de l'échantillon. Pas de plasma d'air a été observée dans cette condition. Au cours des expériences, l'échantillon est déplacé par un moteur pas à pas afin de générer un plasma dans une seule position sur l'échantillon (monocoup). Une observation microscopique des cratères générées sur le substrat a montré un diamètre du cratère inférieur à 50 um. Le plasma généré a été imagée par un couple de lentille sur l'entrée d'une fibre optique connectée à l'autre extrémité à un spectrographe de Czerny-Tuner équipé d'un réseau de diffraction de 1200 lignes par mm (flambé à 300 nm). Une caméra ICCD a été monté sur le plan focal de sortie du spectrographeà enregistrer le spectre. Pendant les mesures, la hauteur de la surface de l'échantillon (en ce qui concerne la position de focalisation du laser) est surveillée en utilisant la méthode trigonométrique avec un faisceau incident de manière oblique à partir d'une diode laser de puissance cw bas sur la surface de l'échantillon et une caméra de surveillance de la CCD. Le ICCD a été déclenché par le laser Q-switch et le 400 ns et ps 2 ont été mis respectivement pour les paramètres de retard et de grille. Au cours d'une cartographie, l'échantillon a été décalée par un décalage de 100 um après chaque tir laser. Un spectre a été enregistré pour chaque tir laser. Logiciel maison développé dans l'environnement LabVIEW contrôle la totalité de l'équipement et autorisé à effectuer séquence automatisée pour balayer la zone d'intérêt de l'échantillon de tissu avec une résolution latérale spécifique.
Exemple de spectres de prise de vue unique, enregistrée sur différentes régions d'un tissu rénal après injection intraveineuse de nanoparticules à base de Gd est représenté sur la Figure 2. Les nanoparticules ont été synthétisés comme described dans Mignot et al 17. Brièvement, les nanoparticules sont constituées d'une matrice de polysiloxane, tenant DOTAGA-Gd 3 + chelates sur leur surface. Elles sont développées pour (i) l'imagerie multi-modale, car ils peuvent être utilisés en IRM, l'imagerie nucléaire et l'imagerie de fluorescence, séparément ou simultanément, et (ii) en tant que fonction thérapeutique Radiosensibilisateur (en augmentant localement l'efficacité de la radiothérapie) 18. Le domaine spectral utilisé (286-320 nm) permet de détecter des éléments différents, tels que Gd, Ca, Fe, Si, Al et. Le spectre bleu a été enregistré dans la région centrale du rein (la médullaire), le spectre rouge correspond à la membrane du rein (capsule) et le spectre vert vers la zone périphérique (cortex). Il est également à noter que les Gd, Si, Al, Ca, Fe et intensités sont très variables à différentes régions, ce qui suggère une grande hétérogénéité de ces éléments concentrations dans le tissu. Fondamentalement D.ieu et Si sont contenant dans le Gd based nanoparticules, Fe était spécifique pour les vaisseaux sanguins, Ca à partir de l'échantillon biologique elle-même.
Les échantillons de tranches de tissus ont été analysés point par point, déplacer l'échantillon dans la position X et Y. La résolution latérale est proche de 100 um. Un spectre unique a été enregistrée pour chaque position (mesure de la prise de vue unique). des intensités de lignes ont été extraits à partir des spectres à l'aide d'une soustraction d'arrière-plan. Les images chimiques ont ensuite été construites à partir de ces intensités. Un exemple est montré à la figure 3 pour D.ieu, Si et Fe. Les lignes utilisées pour construire ces images chimiques sont indiqués dans le tableau 2. L'analyse a été corrélée à la photographie en couleur de l'échantillon biologique avant l'expérience afin d'améliorer la localisation et de cartographie des différents éléments. Dans le rein, les signaux de Gd et Si ont été co-localisés, mais ce co-localisation ne correspondaient pas à la distribution du Fe, ce qui indique une distribution spécifique.
SimiLAR résultats ont été obtenus avec des échantillons de tumeurs. Un exemple de mesure sur le tissu tumoral SQ20B est représenté sur la figure 4. Dans ce cas, le plan chimique de Gd, représenté avec une échelle de couleurs fausses, a été superposée à l'image de la lumière naturelle. Pour cette mesure, l'analyse quantitative a été effectuée pour récupérer la concentration en gadolinium local (voir la procédure décrite dans la section de protocole). Pour cette expérience, les nanoparticules ont été administrés directement dans la tumeur, qui a été enlevée 1 h après l'injection et découpé pour l'analyse. Comme on le voit sur la figure 4, les particules diffusées dans le tissu à partir du point au centre de la tumeur à la périphérie d'injection. 1 h après l'injection, à peu près la moitié du volume de la tumeur comportait des particules. Cette cartographie peut aider à fournir des informations sur le protocole thérapeutique. Pour une efficacité optimale du traitement, les nanoparticules doivent se diffuser à l'intérieur de la totalité de la tumeur; après 1 heure, seulement half de la tumeur comportait des particules, ce qui suggère qu'un plus long temps de diffusion serait nécessaire pour une diffusion optimale et donc un traitement efficace.
Tableau 1. Principal résolution spatiale des techniques d'analyse pour l'imagerie élémentaire chimique. (Lobinski et al. 5). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette table.
Figure 1. Représentation schématique du dispositif expérimental LIBS utilisée. (Motto-Ros et al. 15).
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Figure 2. LIBS spectres mono-coup obtenu dans trois régions différentes du tissu rénal. Ces régions sont la moelle (partie centrale du rein), la capsule en rouge et le cortex en vert. Les spectres ont été décalées verticalement par souci de clarté.
Figure 3. LIBS cartographie élémentaire de D.ieu, Si et Fe dans une tranche de rein de souris préparé selon les conditions spécifiées dans le texte. L'intensité de l'échelle des images chimiques est exprimée en unité arbitraire. Une photographie la lumière naturelle est également indiqué dans le coin supérieur gauche de la figure.
Tableau 2. Lignes spectrales utilisées pour la détection de Gd, Si, Fe et dans un rein de souris (lignes atomiques sont marquées I et les lignes ioniques sont étiquetés II).
Figure 4. LIBS de cartographie quantitative de Dieu à l'intérieur d'une tranche de tissu tumoral. L'échelle de couleur s'étend de faux 0,1 mM (vert) à 20 mM (violet).
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Discussion
Appliqué à l'échantillon biologique, cette technique permet l'imagerie chimique, à savoir la cartographie et la quantification, de D.ieu et Si à partir de nanoparticules à base de Gd injectés dans différents organes. Des principaux paramètres critiques, le contrôle des propriétés laser (de longueur d'onde, l'énergie d'impulsion, de focalisation, et de stabilité) est essentiel pour une ablation de tissus fins et précis (c.-à-résolution de la cartographie) ainsi que pour la sensibilité. Travailler à haute énergie offre une meilleure sensibilité mais génère malheureusement résolution spatiale dégradée. Par ailleurs, le type de spectromètre utilisé doit être soigneusement vérifiée. Fondamentalement, une enquête à large bande (en utilisant par exemple un spectromètre échelle) permettra à un large choix d'espèces élémentaires mais avec une faible sensibilité, tout en utilisant un spectromètre Czerny-Turner (équipé d'un ICCD ou un PMT) permettra détecter moins d'éléments, mais avec beaucoup de plus de sensibilité. Tous les paramètres choisis de la gamme de longueur d'onde sondés doivent être ajustés à la pbjectif de l'enquête.
En ce qui concerne l'échantillon biologique elle-même, de son épaisseur et de la dureté peut également interférer avec la qualité du spectre. Un échantillon très mince serait totalement pulvérisé et le support de l'échantillon serait attaqué aussi par le tir laser, tandis qu'un échantillon trop épaisse pourrait souffrir de son en-homogénéité de sa constitution qui sera répercuté sur le in-homogénéité de la quantité de pulvérisation question (présence de grands navires, etc). De l'étude élémentaire, le choix du support peut être prévu; par exemple, si l'élément étudié est Si, l'échantillon doit être déposée sur le plastique pure, mais le verre doit être éviter car il contient de grandes quantités de silicium. De même, l'échantillon peut être préparé et fixé dans des conditions particulières pour éviter toute composante du fixateur de contaminer le niveau de l'élément étudié.
Cette technique pourrait être très utile pour l'analyse d'échantillons de pré-cliniques. LIBS could permettre la détection d'éléments métalliques tels que Fe anormales et Cu, en particulier dans des échantillons de cerveau. Une limitation particulière avec Fe doit être le contenu élevé de fer dans l'hémoglobine; l'échantillon préparé avec soin et l'évaluation d'un test d'étalonnage est obligatoire. Dans le domaine des biotechnologies appliquées à la biologie ou la médecine, LIBS pourrait permettre la détection de tout composé ou particule qui contient un élément spécifique tel que Au, Gd, Cu, etc
La paillasse instrumentation est entièrement compatible avec la microscopie optique standard, ce qui montre sa grande utilisation potentielle en biologie et en médecine comme un outil pour l'observation complémentaire d'éléments métalliques traces. Ce type d'imagerie élémentaire, combinant haute résolution latérale (<50 um) avec des limites de détection basses (de l'ordre de mg / kg), implique généralement de haut niveau de l'équipement nécessaire, comme microanalyse de rayonnement synchrotron (SXRF) ou ablation laser couplé par induction spectro de massemétrie (LA-ICP-MS), ce qui rend très restrictive et incompatible avec les systèmes disponibles dans le commerce d'imagerie microscopique. L'instrumentation LIBS n'est pas très cher, en fonction de la résolution et la sensibilité requise (prix entre 100 et 200 k €). Actuellement 2 échantillon de 1 cm pourrait être analysé dans 30-40 minutes; ce temps d'acquisition peut pas changer après l'addition d'autres techniques microscopiques telles que la détection et l'imagerie de fluorescence de l'échantillon de couleur. La résolution spatiale de 100 um actuelle montre déjà l'efficacité de la cartographie des tissus biologiques. Toutefois, cette solution pourrait être considérablement amélioré en utilisant un microscope optique à la place d'une simple lentille pour focaliser l'impulsion laser d'ablation. résolution micrométrique peut théoriquement être atteint, même si la sensibilité va baisser, que moins de matériel sera soumis à une ablation. Augmenter la résolution à 10 um permettrait une localisation précise de nanoparticules à observer au niveau de la cellule.
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Disclosures
Les auteurs n'ont rien à révéler.
Acknowledgments
Les auteurs tiennent à remercier le soutien financier par le Labex-Imust.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Laser nanosecond Nd:YAG | Quantel | Brillant | 5 nsec pulse width, wavelength 1,064 nm |
| Spectrometer | Andor Technology | Shamrock 303 | with 1,200 lines/mm blazed at 300 nm grating |
| Detector ICCD | Andor Technology | Istar | 2 nsec temporal resolution |
| LIBS Unit | ILM | Homemade Instrumentation | |
| Gd-based nanoparticles | Nano-H | particles | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | for particle's dilution |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | 21108 | for particle's dilution |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S5886 | for particle's dilution |
| Mice | Charles River | depending of animal breeding | |
| Isoflurane | Coveto / Virbac | for anaesthesia - Isofluranum | |
| Isopentane | Sigma-Aldrich | 59060 | to froze the sample slowly |
| Liquid nitrogen | Air Liquide | to cool down the isopentane | |
| Cryostat | Leica | CM-3050S | to slide the samples |
| Petri dishes | Dutscher | 353004 | to stick the sample |
References
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