Summary
ספקטרוסקופיה התמוטטות מושרה לייזר מבוצעת על איבר דק ורקמת גידול זוהתה בהצלחה אלמנטים טבעיים וגדוליניום המוזרק באופן מלאכותי (ה '), שהונפקו מחלקיקים המבוססים על ה'. תמונות של יסודות כימיים הגיעו לרזולוציה של 100 מיקרומטר ורגישות תת מ"מ כמותית. התאימות של ההתקנה עם מיקרוסקופיה אופטית סטנדרטית, מדגישה את הפוטנציאל שלה כדי לספק מספר רב של תמונות מאותה רקמה ביולוגית.
Abstract
ספקטרוסקופית פליטה של פלזמה מושרה לייזר הייתה מוחלת על ניתוח יסודי של דגימות ביולוגיות. ספקטרוסקופיה התמוטטות מושרה לייזר (LIBS) שבוצע בסעיפים דקים של רקמות מכרסמים: כליות וגידול, מאפשר זיהוי של אלמנטים אורגניים כגון (i) Na, Ca, Cu, Mg, P, ופה, באופן טבעי בגוף ו (Ii) Si וה ', שאותרו לאחר ההזרקה של חלקיקים המבוסס על גדוליניום. החיות מורדמים 1-24 שעות לאחר הזרקה תוך ורידית של חלקיקים. סריקה דו ממדית של המדגם, שבוצעה באמצעות 3D בשלב micrometric ממונע, אפשר לקרן לייזר אינפרא אדום לחקור את פני השטח ברזולוציה רוחב של פחות מ -100 μ מ '. תמונות כימיות הכמותי של אלמנט הקב"ה בתוך האיבר התקבלו עם רגישות תת מ"מ. LIBS מציע שיטה פשוטה וחזקה כדי ללמוד את ההפצה של חומרים אורגניים ללא כל labeli ספציפיng. יתר על כן, את התאימות של ההתקנה עם מיקרוסקופיה אופטית סטנדרטית, מדגישה את הפוטנציאל שלה כדי לספק תמונות מרובות של אותו הרקמה ביולוגית עם סוגים שונים של תגובה: יסודות, מולקולריים, או סלולריים.
Introduction
הפיתוח הרחב של חלקיקים עבור יישומים ביולוגיים דחק בשיפור המקביל של שיטות אנליטיות לכימותם והדמיה בדגימות ביולוגיות. בדרך כלל זיהוי והמיפוי של חלקיקים באיברים מבוצעים על ידי הקרינה או confocal. למרבה הצער שיטות אלה דורשים התיוג של חלקיקים על ידי צבע אינפרא אדום קרוב שיכול לשנות את biodistribution של חלקיקים, במיוחד לחלקיקים קטנים מאוד בשל המאפיינים הידרופובי שלה. הגילוי של חלקיקים שכותרתו, ובעיקר חלקיקים קטנים מאוד (גודל <10 ננומטר), ובכך עלול להפריע לbiodistribution שלהם בכל קנה המידה הגוף, אלא גם ברמת הרקמות ותאים. הפיתוח של מכשירים חדשים מסוגלים לזהות חלקיקים ללא כל תיוג מציע אפשרויות חדשות לחקר ההתנהגות וקינטיקה שלהם. יתר על כן, תפקידיו של יסודות קורט כגון ברזל ונחושת במוח מחלותמחלות ניווניות כגון ד 1 אלצהיימר, מנקס 2,3, או 4 וילסון מציעות ריבית ללמוד ולמקם רכיבים אלה ברקמות.
טכניקות שונות שימשו כדי לספק מיפוי או microanalysis יסודות של חומרים שונים. במאמר הביקורת שפורסם ב2006, ר 'Lobinski et al. סיפק סקירה של טכניקות סטנדרטיות זמינות עבור microanalysis יסודות בסביבה ביולוגית, אחת מהסביבות המאתגרות ביותר עבור מדעים אנליטיים 5. Microprobe האלקטרון, אשר מורכב מmicroanalysis רנטגן נפיצה אנרגיה במיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים, יכול להיות מיושם על מחקרים רבים אם ריכוז המרכיב מספיק (> 100-1,000 מיקרוגרם / g). כדי להגיע למגבלות זיהוי נמוכות יותר, בטכניקות הבאות היו בשימוש:
- μ-PIXE (1-10 מיקרוגרם / g) microprobe אלומת יונים באמצעות חלקיקים המושרה רנטגן פליטה 6
- synchrotron microanalysis קרינת μ-SXRF (0.1-1 מיקרוגרם / גרם) 7
- ספקטרומטריית מסת יונים משני Sims (0.1 מיקרוגרם / גרם) 8
- אבלציה לייזר אינדוקטיבי מצמידים ספקטרומטריית מסת LA-ICP-MS (עד 0.01 מיקרוגרם / g) 9,10
הטכניקות הנ"ל מספקות רזולוציה micrometric כפי שמוצגות בטבלת 1 שחולץ מן Lobinski et al.
שחזור 3D של חקירות 2D סידוריים יכול להיות גם הציע לבנייה מחדש של רקמות עמוקות יותר 11. עם זאת, כל המכשירים והמערכות דורשים שני אנשי מקצוע מוסמכים, בדרגה בינוני עד ציוד יקר מאוד וניסויים לטווח ארוכים (בדרך כלל יותר מ 4 שעות ל100 מיקרומטר x 100 מיקרומטר לμ-SXRF ו10 מ"מ x 10 מ"מ לLA-ICP-MS ) 12. בסך הכל, דרישות אלה הופכים microanalysis יסודות מאוד מגבילים ועולה בקנה אחד עם מערכות הדמיה אופטית קונבנציונליות,מיקרוסקופ פלואורסצנטי או מיקרוסקופיה לא לינארית. נקודה נוספת שאנו יכולים להזכיר כאן היא שיכולת מדידת כמותית היא עדיין די מוגבלת ותלויה בזמינות של סטנדרטים מעבדה בהתאמה מטריצה. הכללה נוספת של השימוש בmicroanalysis יסודות בתהליכים בתעשייה, גיאולוגיה, ביולוגיה ותחומים אחרים של יישומים תפיק פריצות דרך רעיוניות וטכנולוגית משמעותיות.
מטרתו של כתב היד הנוכחית היא להציע פתרונות למיפוי הכמותי יסודות (או microanalysis יסודות) ברקמות ביולוגיות עם מכשור שולחן תואם באופן מלא עם מיקרוסקופיה אופטית קונבנציונלית. הגישה שלנו מבוססת על ספקטרוסקופיית לייזר המושרה ההתמוטטות (טכנולוגית LIBS). בLIBS, דופק לייזר הוא על המדגם של עניין ממוקד כדי ליצור את ההתמוטטות וניצוץ של החומר. הקרינה האטומית הנפלטת בפלזמה מנותחת לאחר מכן על ידי ספקטרומטר וelemenניתן לאחזר ריכוזי טל עם מדידות כיול מבוצעות מראש 13,14. היתרונות של LIBS כוללים רגישות (מיקרוגרם / גרם כמעט לכל אלמנטים), קומפקטיות, הכנת מדגם בסיסית מאוד, היעדר מגע עם המדגם, תגובה מיידית ומקומי דווקא ניתוח (מיקרו) לפני השטח. עם זאת, היישום של הדמיה כימית רקמה נותר מאתגר מאז אבלציה הלייזר של רקמה חייבת להיות מבוקר היטב לבצע מפות עם רזולוציה מרחבית גבוהה יחד עם רגישות בטווח מיקרוגרם / g 15,16.
עם פתרון כזה, ספוח של קליעים נותבים או סוכני תיוג אינו נחוץ, המאפשר איתור מרכיבים אורגניים ישירות בסביבה המקומית שלהם ברקמות ביולוגיות. מכשיר LIBS שפותח במעבדה שלנו מציע רזולוציה נוכחית נחות 100 מיקרומטר עם רגישות המשוערת לקב"ה מתחת 35 מיקרוגרם / g, שווה ערך ל 0.1 מ"מ 16, המאפשרהמיפוי של דגימות גדולות (> 1 סנטימטר 2) בתוך 30 דקות. בנוסף, תוכנת תוצרת בית מאפשרת הרכישה וניצול של הנתונים. מכשיר זה משמש לאיתור, המיפוי ולכמת את רקמות ההפצה של גדוליניום מבוסס חלקיקים (ה ') 17-18 בכליות ודגימות גידול מבעלי חיים קטנים, 1-24 שעות לאחר הזרקה תוך ורידית של החלקיקים (גודל <5 ננומטר) . אלמנטים אורגניים, שמכילים באופן מהותי ברקמה ביולוגית, כמו Fe, Ca, Na, ו-P, יש גם זוהו וצלמו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. הכנת דוגמאות ביולוגית
כל הניסויים שתוארו במחקר זה אושרו על ידי ועדת הטיפול בבעלי חיים ושימוש בCECCAPP (ליון, צרפת) (# אישור LYONSUD_2012_004), והניסויים בוצעו תחת הפיקוח של אנשים מורשים (L. Sancey, # אישור DDPP 38 05 32).
- הוסף 1 מיליליטר של H 2 O לשל חלקיקים המבוססים על גדוליניום (ה ') 100 μmol, חכה 15 דקות, ולהוסיף 20 μl של 50 HEPES מ"מ, NaCl 1.325 M, CaCl 2 20 מ"מ לשל H 2 O 100 μl ו80 μl הפתרון העיקרי של חלקיקים המבוססים על ה 'כדי להשיג פתרון 200 μl ב40 מ"מ מוכן ללהזריק (עיר: וילרבאן, במעבדה).
- להזריק את הפתרון מבוסס חלקיקי הקב"ה 200 μl לווריד למכרסמי נושאות גידולים בהרדמה (עיר: Lyon Sud (Oullins), 15 קילומטר מהמעבדה).
- 1-24 שעות לאחר ההזרקה, להקריב את העכבריםd לשים את הדגימות הביולוגיות לisopentane מקורר על ידי חנקן נוזלי. לאחסן דגימות ב-- 80 ° C (סיטי: ליון Sud (Oullins), 15 קילומטר מהמעבדה).
- פורסים את המדגם (עיר: בדרך כלל גרנובל, מהמעבדה 100 קילומטר; אני אנסה יש גישה בליון Sud) ב100 שקופיות מיקרומטר עבות ולשים את השקופיות הביולוגיות על מנות ספציפיות פלסטיק (צלחת פטרי). חנות ב -80 ° C.
הערה: מנות פלסטיק הן בעצם מדגם פולימר טהור מאוד. הם נמצאים בשימוש כדי למנוע הפרעה עם אלמנטים כלולים ברקמות.
2. הכנת דוגמאות לכיול
- הכן בקבוקונים עם הגדלת מינון של nanoparticle מבוסס הקב"ה למים (0 ננומטר, 100 ננומטר, 500 ננומטר, 1 מיקרומטר, 5 מיקרומטר, 10 מיקרומטר, 50 מיקרומטר, 100 מיקרומטר, 500 מיקרומטר, 1 מ"מ, ו5 מ"מ).
- שים 5 μl שחרר של כל פתרון במרווח קבוע של 3 מ"מ בצלחת פטרי.
- יבש בטמפרטורת חדר למשך 20 דקות.
3. ניסוי LIBS
- אתחול התקנת LIBS
- הגדרות לייזר. לאחר המעבר במכשירים, חכה 10-20 דקות לייצוב אנרגיה דופק לייזר והרגעות של המצלמה ICCD ל-20 ° C. התאם את האנרגיה הדופק עם המחליש.
הערה: הפרמטרים הלייזר האופטימליים לרקמות מיפוי הם 5 NSEC משך דופק, 1,064 אורך גל, ואנרגיה דופק של כ -4 MJ. הלייזר משתמש הוא Nd טיפוסי: לייזר YAG שבריר שנייה. - LIBS הגדרות. הגדר את עמדת לייזר התמקדות (ביחס למשטח המדגם) כדי לקבל את קוטר המכתש הקטן (כ -50 מיקרומטר או פחות).
שים לב: זה מתאים מקוד דופק לייזר מתחת לפני השטח המדגם 100 מיקרומטר. - הגדרות ספקטרומטר. השתמש בספקטרומטר צ 'רני טרנר בשילוב עם 1,200 קווים / מ"מ צורם ומצלמה ICCD הרזולוציה גבוהה זמנית. לשלוט בכל התקנים אלה על ידי מחשב. הגדר את ערך חריץ הזנה ל40 מיקרומטר. הגדר את טווח הספקטרום מחדשGarding האלמנט להיות מנותחים. השתמש בטווח הספקטרום מכסה 325-355 ננומטר כדי לזהות את האלוקים ברגישות גבוהה, כמו גם Na, Cu ו Ca. הגדר את הפרמטרים ICCD באיחור של 300 NSEC, שער 2 μsec, ורווח של 200.
- הגדרות לייזר. לאחר המעבר במכשירים, חכה 10-20 דקות לייצוב אנרגיה דופק לייזר והרגעות של המצלמה ICCD ל-20 ° C. התאם את האנרגיה הדופק עם המחליש.
- מדידת מיפוי
- מניחים את המדגם הביולוגי על בעל מדגם LIBS ממונע.
- התאם את הגובה של המדגם בהתאם למיקום מוקד הלייזר.
- קח את תמונה ברזולוציה גבוהה של פרוסת המדגם.
- הגדר את מודול המיפוי של תוכנת רכישת LIBS לבצע מפה עם בדרך כלל 100 x 100 נקודות מדידה במרווחים על ידי רזולוציה של כ -100 מיקרומטר.
- הפעל את הרכישה. מנקודה זו להפוך כל דבר; נע ברצף, כמו גם הקלטת הספקטרום וחיסכון. 40 דקות נדרשות למיפוי של 10,000 נקודות (שווה ערך ל 1 סנטימטר 2 ל100 רזולוציה מיקרומטר). קיבוץ מחדש של כל הספקטרום שנרשם לאותו קובץ.
- כאשר finished, לצלם שני של פרוסת המדגם
- כיול מכשיר מדידה
עם אותם הפרמטרים ניסיוניים, למדוד את דגימות הכיול (לפרטים הכנה, ראה סעיף 2). לבצע מפה או ספקטרום שיא 25 (המתקבל מאתרי מדידה בחלק המרכזי של הירידה) בכל אחת מטיפי הכיול.
4 LIBS ספקטרום ניתוח:. בנייה של תמונות כימיות
- שיא של כל ספקטרום LIBS ממיפוי הרקמות ולטעון אותם בניתוח תוכנת LIBS. הפחת את הבסיס עבור כל ספקטרום ולבנות את התמונות כימיות עם קנה מידה עוצמה יחסי באמצעות צבע שווא.
הערה: אלגוריתם מאחזר עוצמות שורה מסוימות, כגון אלוקים, Cu, Na, או Ca. - לבצע את אותה פעולה על הספקטרום שנמדד מהמדגם המכויל כדי לאפשר חישוב עקומות כיול (יחס בין האינטנסיביות וריכוז) ולבנות aqמפת uantitative או תמונה לקב"ה (או רכיב אחר של ריבית).
- החל את הטיפולים מתאימים לתמונות כימיות, כגון אינטרפולציה או החלקה. שמור את המפות בעוצמה או ריכוז בפורמט תמונה (מפת סיביות).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
כפי שניתן לראות בתרשים 1, הקרן של Nd: YAG לייזר באורך הגל הבסיסי של 1,064 ננומטר היה ממוקד אנכי כלפי מטה על פרוסת הרקמה על ידי עדשה של קוורץ 50 מ"מ מרחק מוקד. האנרגיה הדופק הייתה 4 MJ ושיעור החזרה 10 הרץ. על מנת להימנע מהדור של פלזמה באוויר, קרן הלייזר הייתה ממוקדת סביב 100 מיקרומטר מתחת לפני השטח של המדגם. אין אוויר פלזמה נצפתה במצב זה. במהלך הניסויים, המדגם הועבר על ידי מנוע צעד על מנת ליצור פלזמה אחד בעמדה אחת בלבד במדגם (ירייה אחת). תצפית מיקרוסקופית של המכתשים שנוצרו על פני המצע הראתה קוטר מכתש נמוך מ50 מיקרומטר. הפלזמה שנוצרה הייתה צילמה בכמה עדשה אל הכניסה של סיב אופטי המחובר בקצה השני להספקטרוגרף צ'רני-טיונר מצויד בסבכה של 1,200 קווים למ"מ (יקדו ב300 ננומטר). מצלמה ICCD הייתה רכוב על מישור מוקד הפלט של הספקטרוגרףכדי להקליט את הספקטרום. במהלך המדידות, הגובה של מדגם השטח (ביחס למצב מיקוד הלייזר) מנוטר באמצעות שיטה טריגונומטריות עם קרן תקרית באלכסון מדיודה נמוכה CW כוח לייזר על פני השטח המדגם ומצלמה צג ה-CCD. ICCD היה מופעל על ידי Q-מתג הלייזר ו400 NSEC ו2 μsec נקבע בהתאמה לפרמטרי עיכוב ושער. במהלך מיפוי, המדגם היה מוזז על ידי קיזוז של אחרי כל יריית לייזר 100 מיקרומטר. ספקטרום אחד נרשם לכל יריית לייזר. תוכנה ביתית שפותחה בסביבת LabVIEW שלטה בכל הציוד ואפשרה לבצע רצף אוטומטי כדי לסרוק את השטח של עניין של דגימת הרקמה עם רזולוציה רוחב ספציפית.
דוגמא של ספקטרום ירייה אחת, רשם על אזורים שונים של רקמת כליה לאחר ההזרקה הרביעית של חלקיקים המבוססים על ה 'מוצגת באיור 2. חלקיקים היו מסונתזים כdescribed בMignot אח' 17. בקצרה, חלקיקים מורכבים ממטריצת polysiloxane, מחזיקים DOTAGA האלוקים 3 + chelates על פני השטח שלהם. הם פותחו עבור (i) הדמיה רבת מודלים כפי שהם יכולים להיות בשימוש ב-MRI, הדמיה גרעינית ודימות פלואורסצנטי, בנפרד או בו זמנית, וכן (ii) פונקציה טיפולית כradiosensitizer (כלומר הגדלת באופן מקומי את היעילות של ההקרנות) 18. טווח הספקטרום משמש (286-320 ננומטר) מאפשר איתור אלמנטים שונים כגון אלוקים, Ca, Fe, סי, ואל. הספקטרום הכחול נרשם באזור של הכליה (מדולה) המרכזי, הספקטרום האדום תואם את הקרום בכליות (כמוסה) ואת הספקטרום הירוק לאזור הפריפריה (קליפת המוח). כמו כן, ראוי לציין כי בעוצמות הקב"ה, סי, אל, Ca, ופה הם משתנים באופן נרחב באזורים שונים, המצביעים על ההטרוגניות גדולה של ריכוזי המרכיבים האלה בתוך הרקמה. בעיקרון ה 'וסי שמכילות באלוקים הבסיסחלקיקי ד, פה היה ספציפי לכלי הדם, Ca מהמדגם הביולוגי עצמו.
דגימות הרקמה הפרוסה נותחו במקום על ידי נקודה, העברת הדגימה במצב X ו-Y. רזולוציה לרוחב הייתה קרובה ל100 מיקרומטר. ספקטרום אחד נרשם לכל עמדה (מדידת ירייה אחת). עוצמות קו שהוצאו מהספקטרום באמצעות חיסור רקע. התמונות כימיות לאחר מכן נבנו מהעוצמות הללו. דוגמא מוצגת באיור 3 לאלוקים, סי ופה. קווים המשמשים לבניית תמונות כימיות אלו מוצגים בטבלה 2. הניתוח היה בקורלציה לצילום בצבע של המדגם הביולוגי לפני הניסוי כדי לשפר את המיקום והמיפוי של האלמנטים השונים. בכליות, אותות ה 'וסי היו שותף מקומי, אבל שיתוף לוקליזציה זה לא תאם את חלוקת פה, מה שמעיד על החלוקה ספציפית.
סימיתוצאות lar התקבלו עם דגימות גידול. דוגמא למדידה על רקמת גידול SQ20B מוצגת באיור 4. במקרה זה, את המפה הכימית של ה ', המוצגת בסולם צבעי שווא, כבר superposed לתמונת האור הטבעי. למדידה זו, ניתוח כמוני שבוצע כדי לאחזר את הריכוז המקומי גדוליניום (ראה את ההליך בסעיף הפרוטוקול). לצורך ניסוי זה, חלקיקים ניתנו ישירות לתוך הגידול, שהוסר 1 שעות לאחר הזרקה ופרוסים לניתוח. כפי שניתן לראות בתרשים 4, החלקיקים מתפזר ברקמות מנקודת ההזרקה במרכז הגידול לפריפריה. 1 שעות לאחר ההזרקה, כמחצית מנפח הגידול הכילה כמה חלקיקים. כגון מיפוי יכול לעזור לספק מידע על הפרוטוקול הטיפולי. ליעילות אופטימלית של הטיפול, חלקיקים צריכים לפזר בתוך הגידול כולו; אחרי שעה 1, רק חה LF של הגידול הכיל כמה חלקיקים, טוען כי זמן דיפוזיה עוד יידרש לדיפוזיה אופטימלית וטיפול ובכך יעיל.
טבלת 1. ראשי נפתרו מרחבית טכניקות אנליטיות עבור הדמיה יסודות כימית. (Lobinski et al. 5). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של השולחן הזה.
איור 1. מצגת סכמטי של הגדרת ניסוי LIBS בשימוש. (מוטו-Ros et al. 15).
: לשמור-together.within-page = "תמיד"> 
איור 2. ספקטרום יחיד ירה LIBS שהושג בשלושה אזורים שונים של רקמת הכליה. אזורים אלה הם הלשד (חלק מהכליות מרכזי), הכמוסה באדום והקליפה בצבע ירוק. ספקטרה כבר השתנתה בצורה אנכית לבהירות.
איור 3. מיפוי יסודות LIBS ה ', סי, ופה בפרוסת כליות עכבר הוכן בהתאם לתנאים המפורטים בטקסט. העצמה בקנה מידה של תמונות כימיות באה לידי ביטוי ביחידה שרירותית. צילום באור טבעי גם מוצג בפינה השמאלית העליונה של הדמות.
טבלה 2. קווים ספקטרליים המשמשים לזיהוי של ה ', סי, ופה בכליות עכבר (קווים אטומיים מסומנים אני וקווים יוניים מסומנים השני).
איור 4. מיפוי הכמותי LIBS של הקב"ה בתוך פרוסה של רקמת גידול. סולם צבעי השווא יוצא מ0.1 מ"מ (ירוק) ל20 מ"מ (סגול).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
יחול על דגימה ביולוגית, טכניקה זו מאפשרת הדמיה הכימית, כלומר המיפוי והכימות, ה 'וסי מחלקיקים המבוססים על ה' שהוחדרו באיברים שונים. מההגדרות קריטיות העיקריות, השליטה בתכונות לייזר (אורך גל, אנרגיה דופק, התמקדות, ויציבות) היא קריטית לאבלציה מדויקת ועדינה רקמה (כלומר ברזולוציה מיפוי), כמו גם לרגישות. עובדים באנרגיות גבוהות מספק רגישות טובה יותר, אך למרבה הצער יוצר רזולוציה מרחבית מושפלת. חוץ מזה, הסוג של ספקטרומטר משמש יש לבדוק בזהירות. בעיקרון, חקירה בפס רחב (באמצעות למשל ספקטרומטר Echelle) תאפשר מבחר גדול של מיני יסודות, אבל עם רגישות נמוכה, תוך שימוש בספקטרומטר צ 'רני טרנר (מצויד בICCD או PMT) תאפשר איתור פחות אלמנטים, אבל עם הרבה יותר יותר רגיש. כל ההגדרות שנבחרו בטווח אורכי הגל גשש צריכה להיות מותאמות לעמurpose של החקירה.
בנוגע לדגימה הביולוגית עצמו, העובי והקשיות שלה עלולים גם להפריע לאיכות של הספקטרום. מדגם דק מאוד יהיה מרוסס לחלוטין ותמיכת המדגם הייתי להיות מותקפת גם על ידי יריית הלייזר, ואילו מדגם עבה מדי עלול לסבול ב- הומוגניות של החוקה שלה שיהיה הדהדה ב- ההומוגניות של כמות ריססה עניין (נוכחות של כלי גדול וכו '). מהמחקר הבסיסי, הבחירה של התמיכה יכולה להיות צפויה; לדוגמא, אם האלמנט הנחקר הוא Si, המדגם צריך להיות מוגש על פלסטיק טהור אבל זכוכית יש להימנע כפי שהוא מכיל כמויות גדולות של סי. באופן דומה, המדגם עשוי להיות מוכן וקבוע בתנאים מסוימים כדי למנוע כל רכיב של המקבע לזהם את הרמה של האלמנט למד.
טכניקה זו יכולה להיות מאוד שימושית עבור הניתוח של דגימות טרום קליניות. LIBS could יאפשר זיהוי של גורמים חריגים מתכתיים כמו פה וCu, בפרט לדגימות מוח. הגבלה מסוימת בפה צריכה להיות התכולה הגבוהה של Fe בהמוגלובין; המדגם שהוכן בקפידה וההערכה של assay כיול היא חובה. בתחום ביוטכנולוגיות תחול על ביולוגיה או רפואה, LIBS עלול לאפשר זיהוי של כל מתחם או חלקיקים המכיל מרכיב ספציפי כגון Au, אלוקים, Cu, וכו '
מכשור הספסל העליון תואם באופן מלא עם מיקרוסקופיה האופטית הרגילה, שמראה את השימוש בו פוטנציאל הגדול בביולוגיה ורפואה ככלי להתבוננות משלימה של יסודות מתכתיים עקבות. סוג זה של הדמיה יסודות, המשלב ברזולוציה גבוהה לרוחב (<50 מיקרומטר) עם מגבלות נמוכות זיהוי (בטווח של מ"ג / קילוגרם), בדרך כלל כרוך ברמה גבוהה של ציוד הנדרש, כגון קרינת סינכרוטרון microanalysis (SXRF) או אבלציה לייזר מצמידים אינדוקטיבי ספקטרו ההמוני metry (LA-ICP-MS), מה שהופך את זה מאוד מגביל ועולה בקנה אחד עם מערכות הדמיה מיקרוסקופיות זמינות מסחרי. מכשור LIBS הוא לא מאוד יקר, בהתאם לרזולוציה והרגישות הנדרשת (מחיר בין 100 ו€ 200 k). נכון לעכשיו מדגם 2 1 סנטימטר יכול להיות מנותח בתוך 30-40 דקות; זמן רכישה זה לא יכול להשתנות לאחר התוספת של טכניקות מיקרוסקופיות אחרות, כגון גילוי הקרינה והדמיה צבעונית של המדגם. הרזולוציה מרחבית 100 מיקרומטר הנוכחי כבר מראה את היעילות למיפוי של רקמות ביולוגיות. עם זאת, החלטה זו יכולה להיות מאוד משופרת באמצעות מיקרוסקופ אופטי במקום עדשה פשוט להתמקד דופק לייזר אבלציה. באופן תיאורטי ניתן להגיע ברזולוציה מיקרומטר, למרות הרגישות יירד, כפי שפחות חומר יהיה ablated. הגדלת הרזולוציה ל10 מיקרומטר תאפשר לוקליזציה מדויקת של חלקיקים כדי להיבחן ברמת התא.
"Jove_content"> לסיכום, LIBS הוא טכנולוגיה חדשה ישימה לאיתור והכימות של גורמים בדגימות רקמה. גישה זו היא רגישה (מיקרוגרם / g), מהיר (כיום 10 מדידות / sec), זול, קל ליישום ולשימוש, ותואם באופן מלא עם מיקרוסקופיה אופטית קונבנציונלית.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
יש המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
המחברים בתודה להכיר תמיכה כספית על ידי Labex-Imust.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Laser nanosecond Nd:YAG | Quantel | Brillant | 5 nsec pulse width, wavelength 1,064 nm |
| Spectrometer | Andor Technology | Shamrock 303 | with 1,200 lines/mm blazed at 300 nm grating |
| Detector ICCD | Andor Technology | Istar | 2 nsec temporal resolution |
| LIBS Unit | ILM | Homemade Instrumentation | |
| Gd-based nanoparticles | Nano-H | particles | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | for particle's dilution |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | 21108 | for particle's dilution |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S5886 | for particle's dilution |
| Mice | Charles River | depending of animal breeding | |
| Isoflurane | Coveto / Virbac | for anaesthesia - Isofluranum | |
| Isopentane | Sigma-Aldrich | 59060 | to froze the sample slowly |
| Liquid nitrogen | Air Liquide | to cool down the isopentane | |
| Cryostat | Leica | CM-3050S | to slide the samples |
| Petri dishes | Dutscher | 353004 | to stick the sample |
References
- Smith, M. A., Harris, P. L., Sayre, L. M., Perry, G. Iron accumulation in Alzheimer disease is a source of redox-generated free radicals. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94, 9866-9868 (1997).
- Wang, Y., Zhu, S., Weisman, G. A., Gitlin, J. D., Petris, M. J. Conditional knockout of the Menkes disease copper transporter demonstrates its critical role in embryogenesis. PloS one. 7, (2012).
- Reske-Nielson, E., Lou, H. O., Andersen, P., Vagn-Hansen, P. Brain-copper concentration in Menkes' disease. Lancet. 1, 613 (1973).
- Hayashi, H., et al. Various copper and iron overload patterns in the livers of patients with Wilson disease and idiopathic copper toxicosis. Medical molecular morphology. 46, (2013).
- Lobinski, R., Moulin, C., Ortega, R. Imaging and speciation of trace elements in biological environment. Biochimie. 88, 1591-1604 (2006).
- Devès, G., Bouhacina, T., Ortega, R. STIM mass measurements for quantitative trace element analysis within biological samples and validation using AFM thickness measurements. Spectrochimica Acta B. 59, 1733-1738 (2004).
- Twining, B. S., et al. Quantifying trace elements in individual aquatic protist cells with a synchrotron X-ray fluorescence microprobe. Analytical chemistry. 75, 3806-3816 (2003).
- Guerquin-Kern, J. L., Wu, T. D., Quintana, C., Croisy, A. Progress in analytical imaging of the cell by dynamic secondary ion mass spectrometry (SIMS microscopy). Biochimica et biophysica acta. 1724, 228-238 (2005).
- Binet, M. R., Ma, R., McLeod, C. W., Poole, R. K. Detection and characterization of zinc- and cadmium-binding proteins in Escherichia coli by gel electrophoresis and laser ablation-inductively coupled plasma-mass spectrometry. Analytical biochemistry. 318, 30-38 (2003).
- Becker, J., Gorbunoff, A., Zoriy, M., Izmer, A., Kayser, M. Evidence of near-field laser ablation inductively coupled plasma mass spectrometry (NF-LA-ICP-MS) at nanometre scale for elemental and isotopic analysis on gels and biological samples. J. Anal. Atom. Spectrom. 21, 19-25 (2006).
- Seeley, E. H., Caprioli, R. M. 3D imaging by mass spectrometry: a new frontier. Analytical chemistry. 84, 2105-2110 (2012).
- Pornwilard, M. -M., Weiskirchen, R., Gassler, N., Bosserhoff, A. K., Becker, J. S. Novel bioimaging techniques of metals by laser ablation inductively coupled plasma mass spectrometry for diagnosis of fibrotic and cirrhotic liver disorders. PloS one. 8, (2013).
- Cremers, D. A., Radziemski, L. J. Handbook of laser-induced breakdown spectroscopy. , Wiley. (2006).
- Miziolek, A. W., Palleschi, V. Laser-Induced Breakdown Spectroscopy: Fundamentals and Applications. , (2006).
- Motto-Ros, V., et al. Mapping nanoparticles injected into a biological tissue using laser-induced breakdown spectroscopy. Spectrochimica Acta Part B. , (2013).
- Motto-Ros, V., et al. Mapping of native inorganic elements and injected nanoparticles in a biological organ with laser-induced plasma. Applied Physics Letters. 101, (2012).
- Mignot, A., et al. A top-down synthesis route to ultrasmall multifunctional Gd-based silica nanoparticles for theranostic applications. Chemistry. 19, 6122-6136 (2013).
- Lux, F., et al. Ultrasmall rigid particles as multimodal probes for medical applications. Angew Chem Int Ed Engl. 50, 12299-12303 (2011).
