Summary
薄器官和肿瘤组织进行激光诱导击穿光谱检测成功自然元素和人工注射钆(Gd),从钆为基础的纳米粒子发出。化学元素的图像达到100微米和定量分毫灵敏度的分辨率。与标准的光学显微镜设置的兼容性强调其潜力提供一个相同的生物组织的多张图片。
Abstract
激光诱导等离子体的发射光谱应用于生物样品的元素分析。上薄切片啮齿动物组织中的激光诱导击穿光谱(LIBS)执行:肾脏肿瘤,使无机元素,例如(i)钠,钙,铜,镁,磷,铁,天然存在于体内并检测(ⅱ)的Si和Gd,注射钆为基础的纳米颗粒后进行检测。使动物安乐死静脉注射颗粒后1至24小时。试样的二维扫描,执行使用电动测微三维阶段,允许的红外激光束探索表面具有横向分辨率小于100μ米。器官内钆元素的定量化学图像,与亚毫米感光度获得。 LIBS提供研究无机材料的分发没有任何具体的labeli一个简单而可靠的方法NG。此外,与标准的光学显微镜的安装程序的兼容性强调它的潜力,以提供相同的生物组织的多个图像与不同类型的反应:元素,分子,或细胞。
Introduction
纳米粒子的生物应用的广阔的发展要求为他们的量化和成像生物样品中的分析技术同步提高。通常在器官纳米颗粒的检测和映射是由荧光或共聚焦显微镜进行。不幸的是这些方法中所需要的纳米颗粒的通过近红外线的染料,可以修改该纳米颗粒的生物分布,尤其是对于由于其疏水特性非常小的纳米颗粒标记。标记的纳米颗粒,特别是非常小的纳米粒子(粒径<10纳米)的检测,因此可能与他们的干扰生物分布在全身的规模,而且在组织和细胞水平。中能检测纳米粒子没有任何标签的新设备的开发提供了自己的行为和动力学研究新的可能性。此外,微量元素,如铁和铜中脑的作用毛病的ð神经变性疾病如阿尔茨海默1,门克斯2,3,或威尔逊4表明兴趣来研究和定位在组织中这些元素。
各种技术已被用来提供不同材料的元素映射或微量分析。在2006年发表的综述文章,R. Lobinski 等,提供在生物环境中,最具挑战性的环境中进行分析科学5中的一个元素微量可用标准技术的概述。电子探针,其由在透射电子显微镜能量分散型X-射线微量分析的,可以应用于大量的研究,如果该元素的浓度是足够的(> 100-1000微克/克)。为了达到更低的检出限,下面的技术已被用来:
- 利用离子束微探针粒子激发X射线发射μ-PIXE(1-10微克/克)6
- 同步chrotron微量辐射μ-SXRF(0.1-1微克/克)7
- 二次离子质谱(SIMS 0.1微克/克)8
- 激光烧蚀电感耦合质谱LA-ICP-MS(下降到0.01微克/克)9,10
上述技术提供了微米级的分辨率,如图从Lobinski 等中提取的表1中 。
串行2D调查三维重建也可提出深层组织11重建。然而,所有的设备和系统的要求都合格的专业人员,中度至高度昂贵的设备和持久的实验(通常多于4小时的100微米×100微米μ-SXRF和10毫米×10毫米为LA-ICP-MS的)12。总之,这些要求使得元素微量非常限制,与传统的光学成像系统不兼容,荧光显微镜或非线性显微镜。我们可以在这里提到的另一点是,定量测量能力还是相当有限的,取决于基质匹配实验室标准的可用性。在行业流程,地质学,生物学和应用等领域的使用元素微量的进一步推广将产生显著的概念和技术突破。
本稿件的目的是提出在生物组织定量元素映射(或元素微量分析)溶液用桌面仪器与常规光学显微镜完全兼容。我们的方法是基于激光诱导击穿光谱(LIBS技术)。在LIBS,激光脉冲被聚焦于感兴趣的样品以建立该材料的击穿和火花。在等离子体中发射的原子辐射随后通过分光计和elemen分析TAL的浓度可以检索与事先13,14进行校准测量。 LIBS技术的优点包括:灵敏度(微克/克,几乎所有的元素),体积小,非常基本的样品制备,缺乏与样品接触,瞬时响应,准确的本地化(微)表面分析。然而,组织化学成像的应用仍然具有挑战性,因为组织的激光消融,必须精确地控制,以高空间分辨率与在微克/克范围15,16灵敏度一起执行映射。
用这样的解决方案,则不需要示踪剂或标记试剂的红利,它允许直接在其天然环境中检测生物组织中的无机元素。在激光诱导击穿光谱仪在我们的实验室开发提供了一个电流分辨率逊色于100微米与钆低于35微克/克的估计灵敏度,相当于0.1毫米16,这使得大样本的映射(> 1 平方厘米)在30分钟内。此外,国产软件方便了数据的采集和利用。这个仪器是用来检测,映射和量化钆的组织分布(Gd)的基于纳米颗粒的17 - 18在肾和肿瘤样本来自小动物,1至24小时静脉注射颗粒后(粒径<5nm)的。无机元素,它在本质上是包含在生物组织中,如铁,钙,钠,和P,也已经检测到并成像。
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Protocol
1,生物样品制备
所有在本研究中所描述的实验的CECCAPP(法国里昂)(授权#LYONSUD_2012_004)的动物护理和使用委员会批准,并在实验授权的个人(L. Sancey,DDPP授权#的监督下进行38 05 32)。
- 新增1对H 2 O毫升至100微摩尔钆(Gd)为基础纳米粒子,等待15分钟,然后加入20微升的HEPES 50 mM时,氯化钠1.325 M, 氯化钙 20毫米至100微升H 2 O和80微升基于Gd的纳米颗粒的初级溶液,得到200μl的溶液,在40 mM的现成的喷出(城市:维勒,在实验室中)。
- 注入200微升钆为基础的纳米粒子溶液静脉滴注进入麻醉荷瘤啮齿类动物(城市:里昂南方(Oullins),从实验室15公里),。
- 1-24小时注射后,牺牲的小鼠d将生物样品为异戊烷用液氮冷却。储存样品 - 80℃(城市:里昂南方(Oullins),15从实验室公里)。
- 切片样本(城市:通常格勒诺布尔,从LAB 100公里,我会尽量在里昂南方接入)在100微米厚的幻灯片,并把生物玻片上的特定塑料培养皿(培养皿)。储存在-80℃。
注:塑料菜基本上是一个非常纯粹的聚合物样品。它们被用来避免与包含在组织中的元素的干扰。
2,样品制备校准
- 制备小瓶用递增剂量的基于Gd的纳米颗粒入水(0纳米,100纳米,500纳米,1μM,5μM,10μM,50μM,100μM,500μM,1毫米,和5mM)。
- 把5微升降了3毫米的培养皿规则排列的每个解决方案。
- 干燥在室温下20分钟。
3,激光诱导击穿光谱实验
- 初始化设置LIBS
- 激光设置。在仪器开机后,等待10-20分钟的激光脉冲能量稳定性和冷却ICCD相机低至-20°C。用衰减器调节的脉冲能量。
注意:最佳激光参数映射组织是5毫微秒脉冲持续时间,1064纳米波长和大约4毫焦耳的脉冲能量。激光采用的是一个典型的Nd:YAG纳秒激光。 - LIBS设置。设置激光聚焦位置(相对于所述样品表面),以获得更小的坑直径(大约50微米或更小)。
注意:这对应于一个激光脉冲聚焦100μm的试样表面以下。 - 光谱仪的设置。使用柴尔尼 - 特纳光谱结合了1200线/毫米的光栅和高时间分辨率的ICCD相机。由计算机控制所有这些设备。输入狭缝值设置为40微米。置的光谱范围重新褒贬要分析的元素。使用光谱范围覆盖325到355纳米检测钆具有高灵敏度,以及钠,铜和钙。为300毫微秒的延迟,为2微秒的栅极,和200的增益设定的ICCD参数。
- 激光设置。在仪器开机后,等待10-20分钟的激光脉冲能量稳定性和冷却ICCD相机低至-20°C。用衰减器调节的脉冲能量。
- 测绘测量
- 将生物样品的LIBS机动样品架。
- 根据该激光焦点位置调整样品的高度。
- 取样品切片的高分辨率照片。
- 设置LIBS采集软件的映射模块与由约100微米的分辨率间距通常为100×100个测量点进行映射。
- 开始采集。从这点自动应有尽有;运动序列以及频谱记录和保存。 40分钟所需要的10000点的映射(相当于1 平方厘米为100μm的分辨率)。重组所有记录的频谱划分为同一个文件。
- 当finished,取试样片的第二张照片
- 校准测量
用相同的实验参数,测量校准样品(制备的详细信息,请参见第2节)。执行在每个校准滴的地图或记录25光谱(从在下拉的中心部分测点获得)。
4 LIBS谱分析:构建化学图像
- 记录从组织映射所有的LIBS光谱并加载它们在LIBS软件分析。减去基准为每个频谱,并用假彩色构造的化学与图像强度的相对规模。
注:算法检索特定的谱线强度,如钆,铜,钠,钙或。 - 从校准样品测得的光谱,使校准曲线计算(强度与浓度之间的关系),并建立AQ执行相同的操作uantitative地图或图像钆(或其他感兴趣的元素)。
- 应用适当的治疗,以化学的图像,诸如内插或平滑。在保存的图像格式(位图)的强度或浓度地图。
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Representative Results
如图1所示 ,Nd组成的光束:YAG激光器中的1064纳米的基波波长是由50毫米焦距的石英透镜聚焦垂直向下的组织切片上。脉冲能量为4毫焦耳,重复频率10赫兹。为了避免空气中的等离子体的产生,该激光束被聚焦大约100微米的样品的表面下。没有空气等离子体中观察到这种情况。在实验过程中,将样品通过一个步进电机,以便产生一个等离子体中只有一个样品上(单发)的位置移动。显微镜观察在基板上产生的陨石坑呈火山口直径小于50微米更低。所产生的等离子体是由一对透镜的成像到一个光纤连接,另一端连接到柴尔尼 - 调谐光谱仪配备的每毫米1200线(闪耀波长300 nm)的光栅的入口。一个ICCD相机被安装在光谱仪的输出焦平面记录光谱。在测量过程中,样品表面的(相对于激光焦点位置)的高度被使用三角法从样品表面上的低功率连续波激光二极管和CCD监视摄像机的斜入射光束监测。该ICCD由激光Q开关和400毫微秒和2微秒被分别设置为延时和门限参数触发。中的映射,将样品转移通过的各激光照射后为100μm抵消。一个频谱是记录每个激光射击。在LabVIEW环境下开发的自制软件来控制整个设备,并允许进行自动序列与特定的横向分辨率扫描的组织样本感兴趣的区域。
的单发光谱,记录在第IV注射钆为基础的纳米颗粒后肾组织的不同区域的例子示于图2。合成所叙述的方法将纳米颗粒离子束增强沉积在米格诺特等[17]。简要地,所述纳米颗粒是由聚硅氧烷基质中,保持DOTAGA钆3 +螯合物在其表面上。它们被开发用于(ⅰ)多模态成像,因为它们可以在MRI,核成像和荧光成像中使用,单独地或同时地,以及(ii)治疗性功能作为放射增敏剂( 即增加局部放射治疗的效率)18。所用的光谱范围(286〜320 nm)的允许检测不同的元素,如钆,钙,铁,硅,铝和。蓝色光谱被记录在肾(髓质)的中央区域,红色的光谱对应于肾膜(日本)和绿色光谱的周边区域(皮层)。还值得注意的是,该钆,硅,铝,钙,铁和强度是广泛变量在不同的区域,这表明该组织内的这些元素的浓度大的异质性。基本上Gd和Si分别包含在钆基ð纳米颗粒,铁是特异于血管,钙从生物样品本身。
组织切片样本进行分析点,由点,移动样品中的X和Y位置。横向分辨率接近100微米。一个单一的光谱记录每个位置(单次测量)。谱线强度分别提取使用背景减法的光谱。化学图像,然后构建从这些强度。一个例子示于图3的Gd,Si和Fe。用于建立这些化学图像线条示于表2中 。的分析是相关的生物样品的彩色照相实验前,以改善不同元件的定位和地图。在肾脏中,钆和Si的信号共定位,但这种共定位不适合与铁的分布,表明一个特定的分布。
西米拉尔结果与肿瘤样本获得的。上SQ20B肿瘤组织测量的一个例子示于图4中 ,在这种情况下,钆的化学地图,用假彩色刻度示出,已经被叠加在自然光图象。对于该测定,定量分析已检索本地钆浓度(见在协议部分中的过程)。在这个实验中,纳米颗粒被直接给药到肿瘤中,将其除去1小时注射后,切片的分析。就像在图4中 ,扩散从在肿瘤中心到周边的注射点的组织中的颗粒。 1小时后注射,大约一半的肿瘤体积的含有一些颗粒。这种映射可以帮助提供关于治疗方案的信息。用于治疗的最佳疗效,纳米颗粒应在整个肿瘤内扩散; 1小时后,才公顷肿瘤的LF含有一些颗粒,这表明较长的扩散时间将需要为最优扩散,从而有效的治疗。
表1。主空间分辨分析技术用于化学元素成像。(Lobinski 等。5)。 请点击这里查看此表的一个更大的版本。
图1示意图演示了用LIBS实验装置。(座右铭-罗斯等人。15)。
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图2中的肾组织三个不同地区获得的LIBS单次光谱。这些地区的髓质(肾中央部分),红色胶囊和绿色的皮质。谱进行了垂直移动的清晰度。
图3。的Gd,Si和Fe的小鼠肾的切片LIBS元素映射根据在文本中指定的条件下制备。化学图像的尺度强度表示在任意的单元。自然光摄影中还示出在图中的左上角。
表2用于钆,Si和铁在小鼠肾脏的检测光谱线(原子线被标记为I和离子线被标记为二)。
图4的Gd的肿瘤组织切片的内部LIBS定量映射。从0.1毫米(绿色)的假彩色刻度运行至20mM(紫色)。
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Discussion
应用于生物样品,该技术允许化学成像, 即钆和Si从不同器官注射钆为基础的纳米粒子的映射和量化。从主关键设置,激光特性(波长,脉冲能量,聚焦,和稳定性)的控制是要精确和微细组织消融( 即映射分辨率)以及灵敏度的关键。工作在高能量提供了一个更好的灵敏度,但遗憾的是产生退化的空间分辨率。此外,使用光谱仪的类型必须仔细检查。基本上,一个宽带的调查(例如使用一个阶梯光栅光谱仪)将允许大量的选择元素种类但具有低灵敏度,同时利用柴尔尼 - 特纳光谱仪(配备有ICCD或PMT),允许检测更少的元件,但有许多更敏感。被探测的波长范围内的所有选择的设置应调整到purpose调查。
关于生物样品本身,它的厚度和硬度也可能会干扰频谱的质量。一个非常薄的样品会完全喷洒和样品支持则还袭击了激光射击,而过厚的样品可能遭受其在同质化的宪法将在在回荡在同质化的喷量物(大血管等的存在)。从元素的研究中,载体的选择可能会被预期;例如,如果所研究的元素为Si,样品应提交的纯塑料但玻璃应避免,因为它含有大量的Si。类似地,样品可能准备并固定在特定的条件下,以防止固定剂的任何成分而污染研究元素的水平。
这种技术可能为临床前样品的分析非常有用。 LIBS腠LD允许异常的金属元素,如Fe和Cu,特别是在检测到大脑样本。 Fe和特别的限制应该是铁血红蛋白的含量较高;样品精心准备和校准试验的评估是强制性的。在应用到生物学或医学生物技术领域,LIBS可能允许一个包含一个特定的元素如Au,钆,Cu 等的任何化合物或粒子的检测
在台式仪器与标准的光学显微镜,这说明在生物学和医学的巨大潜力作为互补观察微量金属元素的工具完全兼容。这种类型的元素成像,结合高横向分辨率(<50微米)具有低检测限(以毫克/千克的范围内),通常包括高级别所需的设备,如同步辐射微量分析(SXRF)或激光烧蚀电感耦合质谱仪metry(LA-ICP-MS),使它非常严格,并与市售显微成像系统不兼容。在激光诱导击穿光谱仪是不是很昂贵,这取决于所需的(介于100和200 K€价)的分辨率和灵敏度。目前,1 平方厘米的样品可以在30-40分钟进行分析;这一采集时间增加了诸如荧光检测和采样的彩色成像其它显微技术后可能不会改变。目前100微米的空间分辨率已经显示了效力生物体组织的映射。然而,这种分辨率可以大大通过使用光学显微镜,而不是一个简单的透镜聚焦消融激光脉冲的提高。微米分辨率理论上可以达到,即使灵敏度会下降,因为较少的材料将被烧蚀。增加分辨率为10微米将允许在细胞水平来观察纳米粒子的准确定位。
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Disclosures
作者什么都没有透露。
Acknowledgments
作者衷心的Labex-内蒙科大承认的财政支持。
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Laser nanosecond Nd:YAG | Quantel | Brillant | 5 nsec pulse width, wavelength 1,064 nm |
Spectrometer | Andor Technology | Shamrock 303 | with 1,200 lines/mm blazed at 300 nm grating |
Detector ICCD | Andor Technology | Istar | 2 nsec temporal resolution |
LIBS Unit | ILM | Homemade Instrumentation | |
Gd-based nanoparticles | Nano-H | particles | |
HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | for particle's dilution |
CaCl2 | Sigma-Aldrich | 21108 | for particle's dilution |
NaCl | Sigma-Aldrich | S5886 | for particle's dilution |
Mice | Charles River | depending of animal breeding | |
Isoflurane | Coveto / Virbac | for anaesthesia - Isofluranum | |
Isopentane | Sigma-Aldrich | 59060 | to froze the sample slowly |
Liquid nitrogen | Air Liquide | to cool down the isopentane | |
Cryostat | Leica | CM-3050S | to slide the samples |
Petri dishes | Dutscher | 353004 | to stick the sample |
References
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