Summary
Laser-Emissionsspektroskopie an dünnen Organ-und Tumorgewebe durchgeführt erfolgreich erkannt natürlichen Elemente und künstlich injiziert Gadolinium (Gd), von Gd-Nanopartikel auf der Basis ausgestellt. Bilder von chemischen Elementen erreicht eine Auflösung von 100 um und quantitative Unter mM Empfindlichkeit. Die Kompatibilität der Einrichtung mit optischen Standardmikroskop hebt das Potential, um mehrere Bilder von einer gleichen biologischen Gewebes bereitzustellen.
Abstract
Emissionsspektroskopie des laserinduzierten Plasmas wurde einer Elementaranalyse biologischer Proben. Laser-Induced Breakdown-Spektroskopie (LIBS) auf Dünnschnitten von Gewebe durch Nagetier: Nieren-und Tumor, ermöglicht die Erkennung von anorganischen Elementen wie (i) Na, Ca, Cu, Mg, P und Fe, die natürlich im Körper vorhanden ist und (ii) Si und Gd, erfasst nach der Injektion von Gadolinium-basierte Nanopartikel. Wurden die Tiere eingeschläfert 1 bis 24 h nach intravenöser Injektion von Partikeln. Eine zweidimensionale Abtastung der Probe unter Verwendung eines motorisierten Mikrometer 3D-Stufe erlaubt die Infrarot-Laserstrahl Erkundung der Oberfläche mit einer lateralen Auflösung von weniger als 100 μ m. Quantitative chemische Bilder von Gd-Element innerhalb der Orgel wurden mit sub-mm-Empfindlichkeit. LIBS bietet eine einfache und robuste Methode, um die Verteilung der anorganischen Materialien ohne spezielle LABÉLI studierenng. Darüber hinaus ist die Kompatibilität der Einrichtung mit optischen Standardmikroskop hebt das Potential, um mehrere Bilder des gleichen biologischen Gewebes mit verschiedenen Arten von Antwort zu geben: Elementar, molekularen oder zellulären.
Introduction
Die breite Entwicklung der Nanopartikel für biologische Anwendungen parallel forderte die Verbesserung der analytischen Techniken für ihre Quantifizierung und Bildgebung in biologischen Proben. Üblicherweise die Detektion und die Abbildung der Nanopartikel in Organe durch Fluoreszenzmikroskopie oder konfokaler. Leider erfordern diese Verfahren die Markierung der Nanopartikel von einer Nahinfrarot-Farbstoff, der die biologische Verteilung der Nanopartikel besonders für sehr kleine Nanopartikel aufgrund ihrer hydrophoben Eigenschaften modifizieren können. Der Nachweis von Nanopartikeln markiert und vor allem die sehr kleinen Nanopartikel (Größe <10 nm), könnte daher mit ihren biologischen Verteilung stören am ganzen Körper Skala, sondern auch an den Gewebe-und Zell Ebenen. Die Entwicklung der neuen Geräte in der Lage, Nanopartikel ohne Kennzeichnung zu erkennen bietet neue Möglichkeiten für die Untersuchung von deren Verhalten und Kinetik. Außerdem ist die Rolle von Spurenelementen wie Eisen und Kupfer in eine Gehirnerkrankungend neurodegenerativer Erkrankungen wie Alzheimer 1, Menkes 2,3 oder 4 Wilson vorschlagen, das Interesse zu studieren und zu lokalisieren, die diese Elemente in Geweben.
Verschiedene Techniken sind verwendet worden, um Elementverteilungs oder Mikroanalyse von verschiedenen Materialien. In ihrer 2006 veröffentlichten Übersichtsarbeit, R. lobinski et al. Einen Überblick der verfügbaren Standardtechniken für die Mikroelementaranalyse in biologischen Umgebung, einer der anspruchsvollsten Umgebungen für analytische Wissenschaften 5. Die Elektronenmikrosonde, die von energiedispersiven Röntgenmikroanalyse in einem Transmissions-Elektronenmikroskop besteht, kann zu zahlreichen Studien angewendet werden, wenn der Elementkonzentration ausreichend ist (> 100-1.000 &mgr; g / g). Um niedrigere Nachweisgrenzen zu erreichen, haben die folgenden Techniken verwendet:
- Ionenstrahl-Mikropartikel mit induzierte Röntgenemission μ-PIXE (1-10 &mgr; g / g) 6
- synchrotronstrahlung Mikroanalyse μ-SXRF (0,1-1 g / g) 7
- Sekundärionen-Massenspektrometrie SIMS (0,1 ug / g) 8
- Laserablation induktiv gekoppelte Massenspektrometrie LA-ICP-MS (bis zu 0,01 g / g) 9,10
Die oben erwähnten Techniken bieten mikrometrischer Auflösung wie in der Tabelle 1 von lobinski et al extrahiert gezeigt.
3D-Rekonstruktion von seriellen 2D-Untersuchungen könnte auch für den Wiederaufbau der tieferen Gewebe 11 vorgeschlagen werden. Alle Geräte und Systeme erfordern jedoch sowohl qualifizierte Fachkräfte, mäßig bis stark teure Ausrüstung und lang anhaltende Experimente (in der Regel mehr als 4 Stunden für eine 100 um · 100 um für μ-SXRF und 10 mm x 10 mm für die LA-ICP-MS ) 12. Insgesamt machen diese Anforderungen elementare Mikroanalyse sehr einschränkenden und mit herkömmlichen optischen Abbildungssystemen nicht kompatibel,Fluoreszenzmikroskopie oder nichtlineare Mikroskopie. Ein weiterer Punkt, den wir hier zu erwähnen ist, dass der quantitative Messfähigkeit ist noch recht begrenzt und hängt von der Verfügbarkeit der Matrix abgestimmt Laborstandards. Die weitere Verallgemeinerung der Verwendung von elementarem Mikroanalyse in Industrieprozessen, Geologie, Biologie und anderen Bereichen der Anwendungen erhebliche konzeptionelle und technologische Durchbrüche zu erzeugen.
Der Zweck der vorliegenden Manuskript ist es, Lösungen für die quantitative Elementar Mapping (oder Mikroelementaranalyse) in biologischen Geweben mit einer Tisch Instrumentierung voll kompatibel mit herkömmlichen optischen Mikroskopie vorgeschlagen. Unser Ansatz basiert auf dem Laser-Induced Breakdown-Spektroskopie (LIBS-Technologie) basiert. In LIBS wird ein Laserimpuls auf der interessierenden Probe fokussiert, um den Abbau und die Funken des Materials zu erstellen. Die atomare Strahlung im Plasma emittierte wird anschließend von einem Spektrometer analysiert und der elementarental-Konzentrationen können mit Kalibrierungsmessungen durchgeführt, vorher 13,14 abgerufen werden. Die Vorteile umfassen LIBS Empfindlichkeit (g / g für fast alle Elemente), Kompaktheit, sehr einfache Probenvorbereitung, ohne Kontakt mit der Probe, sofortige Reaktion und präzise lokalisiert (Mikro)-Oberflächenanalyse. Die Anwendung von Gewebe chemische Bildgebung bleibt jedoch eine Herausforderung, da die Laser-Ablation von Gewebe muss fein gesteuert, um Karten mit hoher räumlicher Auflösung zusammen mit Empfindlichkeit in der ug / g-Bereich 15,16 durchzuführen.
Mit einer solchen Lösung ist die Hinzunahme von Tracern oder Markierungsmittel nicht benötigt, das Erkennen ermöglicht anorganische Elemente direkt in ihrer natürlichen Umgebung in biologischen Geweben. Die LIBS Instrument in unserem Labor entwickelt bietet eine aktuelle Auflösung geringer als 100 &mgr; m mit einem geschätzten Empfindlichkeit Gd unter 35 ug / g, entsprechend 0,1 mM 16, die ermöglichtdie Abbildung von großen Proben (> 1 cm 2) innerhalb von 30 min. Darüber hinaus erleichtert die hausgemachte Software die Übernahme und Nutzung der Daten. Dieses Instrument wird verwendet, um zu erfassen, anzeigen, und die Quantifizierung der Gewebeverteilung von Gadolinium (Gd)-Nanopartikel, 17. - 18. in Nieren und Tumorproben von Kleintieren, 1 bis 24 h nach der intravenösen Injektion der Partikel (Größe <5 nm) . Anorganischen Elementen, die an sich in einem biologischen Gewebe enthalten sind, wie Fe, Ca, Na und P, wurden ebenfalls festgestellt und abgebildet.
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Protocol
1. Biologische Probenvorbereitung
Alle in dieser Studie beschriebenen Experimente wurden von der Animal Care und Verwenden Ausschuss des CECCAPP (Lyon, Frankreich) (Genehmigung # LYONSUD_2012_004) zugelassen, und die Versuche wurden unter der Aufsicht von autorisierten Personen (L. Sancey, DDPP Genehmigung durchgeführt # 38 05 32).
- 1 ml H 2 O auf 100 umol Gadolinium (Gd)-basierte Nanopartikel, warten Sie 15 min, und fügen Sie 20 ul HEPES 50 mM, NaCl 1,325 M CaCl 2 20 mm bis 100 ul H 2 O und 80 ul der primären Lösung von Gd-basierte Nanopartikel, um eine Lösung bei 200 ul 40 mM bereit für die Injektion (: Villeurbanne, im Labor-Stadt) zu erhalten.
- Spritzen Sie die 200 ul Gd-basierte Nanopartikel-Lösung intravenös in anästhesiert tumortragenden Nagetiere (Stadt: Lyon Sud (Oullins), 15 km von der Labor).
- 1-24 Stunden nach der Injektion, opfern die Mäuse eind die biologischen Proben in Isopentan mit flüssigem Stickstoff gekühlt setzen. Lagern Sie die Proben bei - 80 ° C (Stadt: Lyon Sud (Oullins), 15 km von der Labor).
- Schneiden Sie die Probe (Ort: in der Regel Grenoble, 100 km aus dem Labor, werde ich versuchen, einen Zugang in Lyon Sud haben) in 100 um dicke Folien und legte die biologische gleitet auf bestimmte Kunststoffschalen (Petrischale). Bei -80 ° C
Hinweis: Kunststoffgeschirr sind im Grunde eine sehr reine Polymerprobe. Sie werden verwendet, um Interferenzen mit den Elementen in dem Gewebe enthaltenen vermeiden.
2. Probenvorbereitung für die Kalibrierung
- Vorbereitung Fläschchen mit steigenden Dosen von Gd-basierte Nanopartikel in Wasser (0 nM, 100 nM, 500 nM, 1 uM, 5 uM, 10 uM, 50 uM, 100 uM, 500 uM, 1 mM und 5 mM).
- Setzen Sie ein 5 ul-Tropfen jeder Lösung von 3 mm auf der Petrischale regelmäßig angeordnet sind.
- Trocken bei Raumtemperatur für 20 min.
3. LIBS Experiment
- Initialisieren der LIBS-Setup
- Laser-Einstellungen. Nach dem Einschalten der Geräte, warten 10-20 min für eine Laserpulsenergie Stabilisierung und Abkühlung der ICCD-Kamera auf -20 ° C Stellen Sie die Pulsenergie mit dem Dämpfungsglied.
Hinweis: Die optimalen Laserparameter zum Abbilden Gewebe 5 ns Pulsdauer, 1.064 nm Wellenlänge und Impulsenergie von etwa 4 mJ. Der Laser verwendet einen typischen Nd: YAG-Laser Nanosekunden. - LIBS-Einstellungen. Set der Laserfokussierungsposition (bezüglich der Probenoberfläche), um die kleineren Kraterdurchmesser zu erhalten (etwa 50 um oder weniger).
Anmerkung: Dies entspricht einer Laserpuls Fokalisierung 100 &mgr; m unter der Oberfläche der Probe. - Spektrometer-Einstellungen. Verwenden Sie die Czerny-Turner-Spektrometer in Kombination mit einem 1200 Linien / mm Gitter und einer hohen zeitlichen Auflösung ICCD Kamera. Steuern Sie alle diese Geräte über einen Computer. Stellen Sie den Eingangsspalt Wert bis 40 um. Stellen Sie die Wieder SpektralbereichGarding das Element analysiert werden. Verwenden Sie den Spektralbereich abdecken 325-355 nm zu G-tt mit hoher Empfindlichkeit zu erfassen, sowie Na, Cu und Ca. Festlegen der ICCD Parameter mit einer Verzögerung von 300 ns, einer Gate von 2 &mgr; s und einer Verstärkung von 200.
- Laser-Einstellungen. Nach dem Einschalten der Geräte, warten 10-20 min für eine Laserpulsenergie Stabilisierung und Abkühlung der ICCD-Kamera auf -20 ° C Stellen Sie die Pulsenergie mit dem Dämpfungsglied.
- Mapping Mess
- Legen Sie die biologische Probe auf der LIBS motorisierte Probenhalter.
- Einstellen der Höhe der Probe gemäß der Laserfokusposition.
- Nehmen Sie ein hochauflösendes Foto von der Probenscheibe.
- Stellen Sie die Mapping-Modul der LIBS-Erfassungssoftware, um eine Karte mit in der Regel 100 x 100 Messpunkten durch eine Auflösung von etwa 100 um Abstand durchzuführen.
- Starten Sie die Aufnahme. Von diesem Punkt alles zu automatisieren; das Bewegungsfolge als auch das Spektrum aufgenommen und gespeichert werden. 40 min nach einer Zuordnung von 10.000 Punkten (äquivalent zu 1 cm 2 für 100 &mgr; m Auflösung) erforderlich. Umgruppieren alle aufgenommenen Spektren in der gleichen Datei.
- Wenn fertig, nehmen Sie ein Foto von der zweiten Probe Scheibe
- Kalibrierung Mess
Mit den gleichen experimentellen Parameter, messen die Eichproben (Herstellung Details siehe Abschnitt 2). Führen Sie eine Karte oder Rekord 25 Spektren (von Messstellen im Mittelteil des Tropfens erhalten) in jedem der Kalibrierung Tropfen.
4 LIBS Spectrum Analysis:. Konstruieren von Chemical Images
- Notieren Sie alle LIBS Spektren aus dem Gewebe-Mapping und laden Sie sie in der LIBS Software-Analyse. Subtrahieren Sie die Grundlinie für jedes Spektrum und bauen die chemischen Bilder mit relativen Intensitätsskala unter einer falschen Farbe.
Hinweis: Ein Algorithmus ruft bestimmte Linienintensitäten, wie Gd, Cu, Na oder Ca. - Führen Sie den gleichen Vorgang auf die Spektren aus der kalibrierten Probe gemessen, um die Kalibrierungskurven-Berechnung (Beziehung zwischen Intensität und Konzentration) zu ermöglichen und zu bauen aqengen Karte oder Bild für Gd (oder ein anderes Element von Interesse).
- Übernehmen Sie die angemessene Behandlung der chemischen Bilder, wie Interpolation oder Glättung. Speichern Sie die Intensität oder Konzentration Karten im Bildformat (Bitmap).
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Representative Results
Wie in Fig. 1, der Strahl eines Nd dargestellt: YAG-Laser in der Grundwellenlänge von 1.064 nm wurde vertikal nach unten auf das Gewebeschnitt durch eine Quarzlinse mit 50 mm Brennweite fokussiert. Die Pulsenergie betrug 4 mJ und die Wiederholungsrate von 10 Hz. Um die Erzeugung von Plasma in Luft zu vermeiden, wurde der Laserstrahl etwa 100 &mgr; m unter der Oberfläche der Probe fokussiert. Keine Klima Plasma wurde in diesem Zustand beobachtet. Während der Versuche wurde die Probe durch einen Schrittmotor, um eine Plasma nur in einer Position auf der Probe (single shot) erzeugen bewegt. Eine mikroskopische Beobachtung der auf dem Substrat erzeugten Krater zeigte eine Kraterdurchmesser von weniger als 50 &mgr; m. Das erzeugte Plasma wurde durch ein Paar von Linsen auf den Eingang einer optischen Faser an dem anderen Ende an einem Czerny-Tuner-Spektrographen mit einem Gitter von 1200 Linien pro mm (Blaze bei 300 nm) ausgestattet ist abgebildet. Eine ICCD-Kamera wurde von der Ausgangsbrennebene des Spektrographen befestigtum das Spektrum zu erfassen. Bei der Messung wird die Höhe der Oberfläche der Probe (hinsichtlich des Laserfokusposition) mittels trigonometrischer Verfahren mit schräg einfallender Strahl von einem niedrigen Leistungs cw-Laserdiode, die auf der Probenoberfläche und einer CCD-Überwachungskamera überwacht. Die ICCD wurde durch den Laser Q-Switch und dem 400 ns und 2 Mikrosekunden wurden jeweils für die Verzögerung und Gate-Parameter eingestellt ausgelöst. Während einer Zuordnung, wurde die Probe durch einen Versatz verschoben von 100 um nach jedem Laserpuls. Ein Spektrum wurde für jeden Laserschuss erfasst. Hausgemachte Software in der LabVIEW-Umgebung entwickelt, kontrolliert die gesamte Ausrüstung und erlaubt die automatisierte Sequenz durchführen, um den Bereich von Interesse der Gewebeprobe mit spezifischen laterale Auflösung zu scannen.
Beispiel einzigen Schuss Spektren an verschiedenen Bereichen eines Nierengewebe nach intravenöser Injektion von Gd-basierte Nanopartikel aufgenommen ist in Fig. 2 gezeigt. Die Nanopartikel wurden synthetisiert Artbezibed in Mignot et al 17. Kurz gesagt, werden die Nanopartikel aus einem Polysiloxan-Matrix zusammengesetzt ist, hält DOTAGA-Gd 3 +-Chelate auf ihrer Oberfläche. Sie sind für (i) multimodaler Bildgebung entwickelt, wie sie in der MRT, Nuklearmedizin und Fluoreszenzabbildung verwendet werden, getrennt oder gleichzeitig, und (ii) therapeutische Funktion als Radiosensibilisator (dh lokale Erhöhung der Effizienz der Strahlentherapie) 18. Der Spektralbereich (286 bis 320 nm) erlaubt Erfassen verschiedener Elemente wie Gd, Ca, Fe, Si und Al. Das blaue Spektrum wurde in dem zentralen Bereich der Niere (Medulla) aufgezeichnet, das rote Spektrum entsprach der Niere Membran (Kapsel) und grünen Spektrum zu dem Randbereich (Cortex). Es ist auch bemerkenswert, dass die Gd, Si, Al, Ca und Fe Intensitäten in verschiedenen Bereichen weit variabel, was eine große Heterogenität der Konzentrationen dieser Elemente innerhalb des Gewebes. Grundsätzlich Gd und Si wurden in der Gd-Basis mitd Nanopartikel, Fe war spezifisch für den Blutgefäßen, Ca aus der biologischen Probe selbst.
Die Gewebeschnittproben wurden Punkt für Punkt analysiert, Bewegen der Probe in der Position X und Y. Laterale Auflösung war in der Nähe bis 100 um. Ein einziges Spektrum wurde für jede Position (single shot-Messung) aufgezeichnet. Line-Intensitäten wurden aus den Spektren über einen Hintergrund-Subtraktion extrahiert. Die chemischen Bilder wurden dann von diesen Intensitäten gebaut. Ein Beispiel ist in Fig. 3 für Gd, Fe und Si dargestellt. Leitungen verwendet, um diese chemischen Bilder bauen sind in Tabelle 2 gezeigt. Die Analyse wurde vor dem Experiment zu der farbigen Photographie der biologischen Probe korreliert, um die Lokalisierung und Zuordnung der verschiedenen Elemente zu verbessern. In der Niere wurden die Signale Si und Gd co-lokalisiert, aber das Co-Lokalisation nicht mit der Verteilung des Fe passen, was auf eine spezifische Verteilung.
Similar Ergebnisse wurden mit Tumorproben erhalten. Ein Beispiel für eine Messung an SQ20B Tumorgewebe ist in Abbildung 4 dargestellt. In diesem Fall wird die chemische Karte von Gd, mit einem falschen Farbskala dargestellt, hat das natürliche Licht-Bild überlagert worden. Für diese Messung wurde eine quantitative Analyse durchgeführt, um die lokale Gadolinium-Konzentration (siehe das Verfahren in der Protokoll-Abschnitt) abzurufen. Für dieses Experiment wurden die Nanopartikel direkt in den Tumor, der entfernt wurde 1 h nach der Injektion und für die Analyse geschnitten verabreicht. Wie in Fig. 4 zu sehen, die in dem Gewebe von der Einspritzpunkt in der Tumor-Zentrum zur Peripherie Teilchen diffundiert. 1 h nach der Injektion enthielt etwa die Hälfte des Tumorvolumens einige Teilchen. Eine solche Abbildung kann dabei helfen, Informationen über die therapeutische Protokoll bieten. Für eine optimale Wirksamkeit der Behandlung sollten die Nanoteilchen in der gesamten Tumor diffundieren; nach 1 Stunde, nur half des Tumors enthielt einige Teilchen, was auf eine längere Diffusionszeit würde für eine optimale Diffusion und damit effektive Behandlung erforderlich sein.
Tabelle 1. Hauptortsaufgelöste analytische Techniken für die chemische Elementar Bildgebung. (Lobinski et al. 5). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Tabelle anzuzeigen.
Abbildung 1. Schematische Darstellung des experimentellen Aufbaus verwendet LIBS. (Motto-Ros et al. 15).
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2. LIBS Single-Shot-Spektren in drei verschiedenen Regionen des Nierengewebes erhalten. Diese Regionen sind der Medulla (Mittelteil der Niere), die Kapsel in rot und grün in der Hirnrinde. Spektren sind vertikal zur Klarheit verschoben.
3. LIBS-Element-Aufnahme von Gd, Si und Fe in einer Scheibe der Maus Niere nach den im Text angegebenen Bedingungen hergestellt. Skala Intensität der chemischen Bilder in einer willkürlichen Einheit ausgedrückt. Eine natürliche Light-Fotografie ist auch in der oberen linken Ecke der Abbildung dargestellt.
Tabelle 2. Spektrallinien zum Nachweis von Gd, Si und Fe in einem Maus-Nieren verwendet (Atomlinien sind mit I und II ionischen Linien gekennzeichnet).
Abbildung 4. LIBS quantitative Abbildung von Gd Innenseite einer Scheibe von Tumorgewebe. Die falsche Farbskala verläuft von 0,1 mM (grün) bis 20 mm (violett).
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Discussion
Um biologische Probe aufgebracht wird, ermöglicht diese Technik die chemische Bildgebung, dh die Zuordnung und Quantifizierung von Gd und Si aus injiziert Gd-basierte Nanopartikel in verschiedenen Organen. Von den wichtigsten kritischen Einstellungen, ist die Steuerung der Lasereigenschaften (Wellenlänge, Pulsenergie, wobei der Schwerpunkt und Stabilität) entscheidend für eine präzise und feine Gewebeabtragung (dh Zuordnung Auflösung) als auch für Sensibilität. Arbeiten bei hoher Energie liefert eine bessere Empfindlichkeit, aber leider erzeugt abgebaut räumlicher Auflösung. Außerdem müssen die Art des verwendeten Spektrometers sorgfältig geprüft werden. Grundsätzlich wird ein Breitband-Untersuchung (zum Beispiel mittels eines Echelle-Spektrometer) eine große Auswahl von Elementspezies zu ermöglichen, aber mit geringer Empfindlichkeit, während Sie ein Czerny-Turner-Spektrometer (mit einer ICCD oder einer PMT ausgestattet) ermöglicht Erfassung weniger Elemente, aber mit viel mehr Sensibilität. Alle gewählten Einstellungen der angetasteten Wellenlängenbereich sollte der p eingestellt werdenWECK der Untersuchung.
Bezüglich der biologischen Probe selbst kann seine Dicke und Härte auch bei der Qualität des Spektrums stören. Eine sehr dünne Probe wäre völlig aufgesprüht werden und die Probe Unterstützung würde auch von der Laserschuss angegriffen werden, während eine zu dicke Probe möglicherweise von der in-Homogenität ihrer Verfassung leiden, die auf Widerhall wird die In-Homogenität der Menge der versprühten Materie (Vorhandensein von großen Schiffen etc.). Aus der Elementar Studie, könnte die Wahl des Trägers erwartet werden; zum Beispiel, wenn das untersuchte Element Si ist, sollte die Probe auf reinen Kunststoff gestellt werden, aber Glas sollte vermeiden, da es große Mengen an Si enthalten sein. Auch könnte der Probe hergestellt und befestigt werden unter bestimmten Bedingungen, um jede Komponente der Fixiermittel zu verhindern, um das Niveau der untersuchten Element verunreinigen.
Diese Technik kann sehr nützlich für die Analyse der pre-klinische Proben sein. LIBS could ermöglichen die Erkennung von abnormalen metallischen Elementen wie Fe und Cu, insbesondere in Gehirnproben. Eine besondere Einschränkung Fe sollte der hohe Gehalt an Fe in Hämoglobin; die Probe sorgfältig vorbereitet und die Bewertung eines Kalibrierungstest ist obligatorisch. Im Bereich der Biotechnologie auf die Biologie oder Medizin angewendet wird, könnte LIBS der Aufdeckung von Verbindung oder Teilchen, das ein bestimmtes Element wie Au, Gd, Cu, usw. enthält erlauben
Die Tisch-Instrumentierung ist vollständig kompatibel mit dem Standard-Lichtmikroskopie, die ihre großen potenziellen Einsatz in Biologie und Medizin als ein Werkzeug für ergänzende Beobachtung von Spurenmetallelementen zeigt. Diese Art von elementarem Bildgebung, die Kombination von hoher lateraler Auflösung (<50 um) mit niedrigen Nachweisgrenzen (im Bereich von mg / kg), beinhaltet im Allgemeinen hohe erforderliche Ausrüstung, wie Synchrotronstrahlung Mikroanalyse (SXRF) oder Laserablation induktiv gekoppelte MassenspektrometerMetrie (LA-ICP-MS), so dass es sehr restriktiv und mit handelsüblichen mikroskopische Imaging-Systeme nicht kompatibel. Die LIBS Instrumentierung ist nicht sehr teuer, je nach Auflösung und Empfindlichkeit erforderlich (Preis zwischen 100 und 200 T €). Derzeit wird ein 1 cm 2 Probe konnte innerhalb von 30-40 min analysiert werden; Diese Aufnahmezeit kann nicht nach der Zugabe der anderen mikroskopischen Techniken wie Fluoreszenz-Detektion und farbige Abbildung der Probe zu ändern. Der aktuelle 100 um räumliche Auflösung zeigt bereits die Wirksamkeit für die Zuordnung von biologischen Geweben. Allerdings könnte diese Auflösung stark durch Verwendung eines optischen Mikroskops statt einer einfachen Linse, um die Ablation Laserpuls zu konzentrieren verbessert werden. Mikrometer-Auflösung kann theoretisch erreicht werden, auch wenn die Empfindlichkeit sinkt, da weniger Material abgetragen werden. Erhöhung der Auflösung auf 10 um erlauben würde eine genaue Lokalisation der Nanopartikel auf der Zellebene beobachtet werden.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu offenbaren.
Acknowledgments
Die Autoren danken finanzielle Unterstützung durch die Labex-Imust.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Laser nanosecond Nd:YAG | Quantel | Brillant | 5 nsec pulse width, wavelength 1,064 nm |
| Spectrometer | Andor Technology | Shamrock 303 | with 1,200 lines/mm blazed at 300 nm grating |
| Detector ICCD | Andor Technology | Istar | 2 nsec temporal resolution |
| LIBS Unit | ILM | Homemade Instrumentation | |
| Gd-based nanoparticles | Nano-H | particles | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | for particle's dilution |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | 21108 | for particle's dilution |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S5886 | for particle's dilution |
| Mice | Charles River | depending of animal breeding | |
| Isoflurane | Coveto / Virbac | for anaesthesia - Isofluranum | |
| Isopentane | Sigma-Aldrich | 59060 | to froze the sample slowly |
| Liquid nitrogen | Air Liquide | to cool down the isopentane | |
| Cryostat | Leica | CM-3050S | to slide the samples |
| Petri dishes | Dutscher | 353004 | to stick the sample |
References
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