Summary
पतली अंग और ट्यूमर के ऊतक पर प्रदर्शन लेजर प्रेरित टूटने स्पेक्ट्रोस्कोपी सफलतापूर्वक जी.डी. आधारित नैनोकणों से जारी प्राकृतिक तत्वों और कृत्रिम रूप से इंजेक्शन Gadolinium (जी डी), का पता चला. रासायनिक तत्वों की छवियाँ 100 माइक्रोन और मात्रात्मक उप मिमी संवेदनशीलता का एक संकल्प पर पहुंच गया. मानक ऑप्टिकल माइक्रोस्कोपी के साथ सेटअप की अनुकूलता एक ही जैविक ऊतक के एकाधिक छवियों को प्रदान करने के लिए अपनी क्षमता पर जोर दिया.
Abstract
लेजर प्रेरित प्लाज्मा के उत्सर्जन स्पेक्ट्रोस्कोपी जैविक नमूने के मौलिक विश्लेषण करने के लिए लागू किया गया था. लेजर प्रेरित टूटने स्पेक्ट्रोस्कोपी (LIBS) कृंतक ऊतकों की पतली वर्गों पर प्रदर्शन: गुर्दे और ट्यूमर, की अनुमति देता है इस तरह (मैं) ना, सीए, घन, मिलीग्राम, पी, और फे, शरीर में प्राकृतिक रूप से मौजूद और अकार्बनिक तत्वों का पता लगाने (ii) सी और जी.डी., gadolinium आधारित नैनोकणों के इंजेक्शन के बाद पता चला. जानवरों के कणों की नसों में इंजेक्शन के बाद 1-24 घंटे euthanized थे. नमूने के एक दो आयामी स्कैन, अवरक्त लेजर बीम एक पार्श्व संकल्प कम से कम 100 μ मीटर के साथ सतह की खोज की अनुमति दी, एक मोटर चालित micrometric 3 डी में मंच का उपयोग कर प्रदर्शन किया. अंग अंदर जी.डी. तत्व के मात्रात्मक रासायनिक छवियों उप मिमी संवेदनशीलता के साथ प्राप्त किया गया. LIBS किसी भी विशिष्ट labeli बिना अकार्बनिक सामग्री के वितरण का अध्ययन करने के लिए एक सरल और मजबूत तरीका प्रदान करता हैएनजी. , मौलिक आणविक, या सेलुलर: इसके अलावा, मानक ऑप्टिकल माइक्रोस्कोपी के साथ सेटअप की अनुकूलता प्रतिक्रिया के विभिन्न प्रकारों के साथ ही जैविक ऊतक के एकाधिक छवियों को प्रदान करने के लिए अपनी क्षमता पर जोर दिया.
Introduction
जैविक अनुप्रयोगों के लिए नैनोकणों के व्यापक विकास के लिए जैविक नमूने में उनकी मात्रा का ठहराव और इमेजिंग के लिए विश्लेषणात्मक तकनीकों के समानांतर सुधार का आग्रह किया. आमतौर पर अंगों में नैनोकणों का पता लगाने और मानचित्रण प्रतिदीप्ति या confocal माइक्रोस्कोपी द्वारा बनाई गई हैं. दुर्भाग्य से इन तरीकों को विशेष रूप से अपनी हाइड्रोफोबिक गुणों के कारण बहुत छोटे नैनोकणों के लिए, नैनोकणों के biodistribution संशोधित कर सकते हैं कि एक निकट अवरक्त डाई द्वारा नैनोकणों की लेबलिंग की आवश्यकता होती है. लेबल नैनोकणों, और विशेष रूप से बहुत छोटे नैनोकणों (आकार <10 एनएम) का पता लगाने, इस प्रकार पूरे शरीर पैमाने पर, लेकिन यह भी ऊतक और सेल के स्तर पर उनके biodistribution के साथ हस्तक्षेप कर सकता है. किसी भी लेबलिंग के बिना नैनोकणों पता लगाने में सक्षम नए उपकरणों के विकास के लिए उनके व्यवहार और कैनेटीक्स के अध्ययन के लिए नई संभावनाएं प्रदान करता है. इसके अलावा, इस तरह के मस्तिष्क में लोहे और तांबे के रूप में तत्वों का पता लगाने की भूमिका एक बीमारियोंअल्जाइमर 1, Menkes 2,3, या विल्सन के रूप में 4 डी neurodegenerative रोगों के ऊतकों में इन तत्वों का अध्ययन करने और स्थानीय बनाना ब्याज सुझाव देते हैं.
विभिन्न तकनीकों विभिन्न सामग्रियों की मौलिक मानचित्रण या microanalysis प्रदान करने के लिए इस्तेमाल किया गया है. 2006 में प्रकाशित उनकी समीक्षा पत्र में, आर Lobinski एट अल. जैविक पर्यावरण, विज्ञान विश्लेषणात्मक 5 के लिए सबसे चुनौतीपूर्ण वातावरण में से एक में मौलिक microanalysis के लिए उपलब्ध मानक तकनीक का एक सिंहावलोकन प्रदान की. तत्व एकाग्रता पर्याप्त है अगर एक संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप में ऊर्जा फैलानेवाला एक्स - रे microanalysis के होते हैं जो इलेक्ट्रॉन Microprobe, कई अध्ययनों के लिए लागू किया जा सकता है (> 100-1,000 माइक्रोग्राम / छ). कम का पता लगाने सीमा तक पहुंचने के लिए, निम्न तकनीक का इस्तेमाल किया गया है:
- का उपयोग आयन बीम Microprobe कण प्रेरित एक्स - रे उत्सर्जन μ-PIXE (1-10 ग्राम / छ) 6
- चींटीविकिरण microanalysis μ-SXRF chrotron (0.1-1 ग्राम / छ) 7
- माध्यमिक आयन मास स्पेक्ट्रोमेट्री Sims (0.1 माइक्रोग्राम / छ) 8
- लेजर पृथक उपपादन (नीचे 0.01 माइक्रोग्राम / छ) ला आईसीपी एमएस 9,10 मास स्पेक्ट्रोमेट्री युग्मित
Lobinski एट अल से निकाले तालिका 1 में दिखाया गया है उपर्युक्त तकनीक micrometric संकल्प प्रदान करते हैं.
धारावाहिक 2D जांच के 3D पुनर्निर्माण भी गहरे ऊतकों 11 के पुनर्निर्माण के लिए प्रस्तावित किया जा सकता है. हालांकि, सभी उपकरणों और प्रणालियों दोनों बेहद महंगे उपकरण के लिए उदार योग्य पेशेवरों, और लंबे समय तक चलने वाले प्रयोगों (एक μ-SXRF के लिए एक्स 100 माइक्रोन 100 माइक्रोन और ला आईसीपी एमएस के लिए x 10 मिमी 10 मिमी के लिए आम तौर पर अधिक से अधिक 4 घंटा की आवश्यकता ) 12. कुल मिलाकर, इन आवश्यकताओं, मौलिक microanalysis बहुत सीमित और पारंपरिक ऑप्टिकल इमेजिंग सिस्टम के साथ असंगत बनाप्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी या nonlinear माइक्रोस्कोपी. हम यहां उल्लेख कर सकते हैं कि एक और मुद्दा मात्रात्मक माप क्षमता अभी भी काफी सीमित है और मैट्रिक्स से मिलान प्रयोगशाला मानकों की उपलब्धता पर निर्भर करता है. उद्योग प्रक्रियाओं, भूविज्ञान, जीव विज्ञान और अनुप्रयोगों के अन्य डोमेन में मौलिक microanalysis के उपयोग के आगे सामान्यीकरण महत्वपूर्ण वैचारिक और तकनीकी सफलताओं उत्पन्न होगा.
वर्तमान पांडुलिपि का उद्देश्य पारंपरिक ऑप्टिकल माइक्रोस्कोपी के साथ पूरी तरह से संगत एक tabletop उपकरण के साथ जैविक ऊतकों में मात्रात्मक मौलिक मानचित्रण (या मौलिक microanalysis) के लिए समाधान का प्रस्ताव करने के लिए है. हमारा दृष्टिकोण लेजर प्रेरित टूटने स्पेक्ट्रोस्कोपी (LIBS प्रौद्योगिकी) पर आधारित है. Libs में, एक लेजर पल्स सामग्री के टूटने और चिंगारी पैदा करने के लिए ब्याज की नमूना पर केंद्रित है. प्लाज्मा में उत्सर्जित परमाणु विकिरण बाद में एक स्पेक्ट्रोमीटर और elemen से विश्लेषण किया हैताल सांद्रता 13,14 पहले से प्रदर्शन किया अंशांकन माप के साथ लिया जा सकता है. libs के फायदे, compactness, बहुत बुनियादी नमूना तैयार करने, नमूने के साथ संपर्क, तात्कालिक प्रतिक्रिया और ठीक स्थानीयकृत (माइक्रो) सतह विश्लेषण का अभाव (लगभग सभी तत्वों के लिए माइक्रोग्राम / छ) संवेदनशीलता शामिल हैं. ऊतक के लेजर पृथक सूक्ष्मता एक साथ माइक्रोग्राम / छ सीमा 15,16 में संवेदनशीलता के साथ उच्च स्थानिक संकल्प के साथ नक्शे प्रदर्शन करने के लिए नियंत्रित किया जाना चाहिए लेकिन, जब से ऊतक रासायनिक इमेजिंग के आवेदन चुनौती बनी हुई है.
इस तरह के समाधान के साथ, tracers या लेबलिंग एजेंटों के adjunction जैविक ऊतकों में उनके पैतृक वातावरण में सीधे अकार्बनिक तत्वों का पता लगाने की अनुमति देता है, जो की जरूरत नहीं है. हमारी प्रयोगशाला में विकसित LIBS साधन की अनुमति देता है जो 0.1 मिमी 16 के बराबर 35 माइक्रोग्राम / छ नीचे जी.डी. के लिए एक अनुमान के अनुसार संवेदनशीलता के साथ 100 माइक्रोन के लिए अवर एक मौजूदा संकल्प, प्रदान करता हैबड़े नमूनों का मिलान (> 1 सेमी 2) 30 मिनट के भीतर. इसके अलावा, घर का बना सॉफ्टवेयर डेटा के अधिग्रहण और शोषण की सुविधा. इस उपकरण gadolinium के ऊतक वितरण, नक्शे का पता लगाने, और यों इस्तेमाल किया जाता है (जी डी) आधारित नैनोकणों 17 - छोटे जानवरों से गुर्दे और ट्यूमर के नमूनों में 18, 1 कणों की नसों में इंजेक्शन के बाद घंटा 24 को (आकार <एनएम 5) . ऐसे फ़े, सीए, ना, और पी के रूप में आंतरिक रूप से एक जैविक ऊतक में समाहित कर रहे हैं जो अकार्बनिक तत्वों,,, यह भी पता लगाया है और imaged किया गया है.
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Protocol
1. जैविक नमूने तैयार करना
इस अध्ययन में वर्णित सभी प्रयोगों CECCAPP (ल्योन, फ्रांस) (प्राधिकरण # LYONSUD_2012_004) के पशु की देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित किया गया है, और प्रयोगों अधिकृत व्यक्तियों (एल Sancey, DDPP प्राधिकरण # की देखरेख में किया गया 38 05 32).
- , Gadolinium (जी डी) आधारित नैनोकणों के 100 μmol को एच 2 ओ के 1 मिलीलीटर जोड़ें 15 मिनट प्रतीक्षा करें, और एच 2 ओ के 100 μl और 80 μl को HEPES 50 की 20 μl मिमी, NaCl 1.325 एम, 2 CaCl 20 मिमी जोड़ जी.डी. आधारित नैनोकणों के प्राथमिक समाधान के लिए तैयार इंजेक्षन 40 मिमी (: Villeurbanne, लैब में सिटी) में एक 200 μl समाधान प्राप्त करने के लिए.
- नसों के द्वारा anesthetized ट्यूमर असर कृन्तकों (: ल्यों सूद (Oullins), प्रयोगशाला से 15 किमी दूर शहर) में 200 μl जी.डी. आधारित नैनोकणों समाधान इंजेक्षन.
- 1-24 घंटे इंजेक्शन के बाद, चूहों बलिदान एकतरल नाइट्रोजन से ठंडा isopentane में जैविक नमूने डाल चाहते हैं. (: प्रयोगशाला से ल्यों सूद (Oullins), 15 किमी सिटी) 80 डिग्री सेल्सियस - पर नमूनों की दुकान.
- नमूना टुकड़ा (शहर: आमतौर पर ग्रेनोबल, प्रयोगशाला से 100 किमी, मैं ल्यों सूद में एक की पहुंच बनाने की कोशिश करेंगे) 100 माइक्रोन मोटी स्लाइड में और विशिष्ट प्लास्टिक के बर्तन (पेट्री डिश) पर जैविक स्लाइड डाल दिया. -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर
नोट: प्लास्टिक के बर्तन मूल रूप से एक बहुत शुद्ध बहुलक नमूना हैं. वे ऊतक में निहित तत्वों के साथ हस्तक्षेप से बचने के लिए किया जाता है.
अंशांकन के लिए 2. नमूना तैयार
- पानी में (0 एनएम, 100 एनएम, 500 एनएम, 1 माइक्रोन, 5 माइक्रोन, 10 माइक्रोन, 50 माइक्रोन, 100 माइक्रोन, 500 माइक्रोन, 1 मिमी, और 5 मिमी) जी.डी. आधारित nanoparticle की खुराक में वृद्धि के साथ शीशियों को तैयार है.
- नियमित रूप से पेट्री डिश पर 3 मिमी के अंतराल पर प्रत्येक समाधान के 5 μl ड्रॉप रखो.
- 20 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर शुष्क.
3. LIBS प्रयोग
- LIBS सेटअप आरंभ कर रहा है
- लेजर सेटिंग्स. उपकरणों पर स्विच करने के बाद, लेजर पल्स ऊर्जा स्थिरीकरण के लिए 10-20 मिनट प्रतीक्षा करें और -20 डिग्री सेल्सियस तक ICCD कैमरा के नीचे ठंडा Attenuator साथ पल्स ऊर्जा को समायोजित करें.
नोट: मानचित्रण ऊतकों के लिए इष्टतम लेजर मापदंडों 5 nsec स्पंद अवधि, 1,064 एनएम तरंगदैर्ध्य, और लगभग 4 एम.जे. का पल्स ऊर्जा रहे हैं. YAG nanosecond लेजर: उपयोग करता है लेजर एक ठेठ एन डी है. - LIBS सेटिंग्स. छोटे गड्ढा व्यास प्राप्त करने के लिए (नमूना सतह के संबंध में) लेजर ध्यान केंद्रित स्थिति सेट (लगभग 50 माइक्रोन या कम).
नोट: यह एक लेजर पल्स नाभीयन नमूना सतह के नीचे 100 माइक्रोन से मेल खाती है. - स्पेक्ट्रोमीटर सेटिंग्स. झंझरी 1,200 लाइनों / मिमी और एक उच्च अस्थायी समाधान ICCD कैमरा के साथ संयुक्त Czerny टर्नर स्पेक्ट्रोमीटर का प्रयोग करें. कंप्यूटर द्वारा इन सभी उपकरणों को नियंत्रित. 40 माइक्रोन के लिए इनपुट भट्ठा मूल्य निर्धारित करें. वर्णक्रमीय रेंज पुनः सेट करेंविश्लेषण किया जा तत्व garding. वर्णक्रमीय उच्च संवेदनशीलता के साथ जी.डी. पता लगाने के लिए 325-355 एनएम कवर रेंज है, साथ ही ना, कॉपर और सीए का प्रयोग करें. 300 nsec की देरी, 2 μsec का एक फाटक, और 200 की बढ़त के साथ ICCD मानकों सेट.
- लेजर सेटिंग्स. उपकरणों पर स्विच करने के बाद, लेजर पल्स ऊर्जा स्थिरीकरण के लिए 10-20 मिनट प्रतीक्षा करें और -20 डिग्री सेल्सियस तक ICCD कैमरा के नीचे ठंडा Attenuator साथ पल्स ऊर्जा को समायोजित करें.
- मैपिंग मापन
- LIBS मोटर चालित नमूना धारक पर जैविक नमूने रखें.
- लेजर फोकस स्थिति के अनुसार नमूना की ऊंचाई समायोजित करें.
- नमूना टुकड़ा की एक उच्च संकल्प तस्वीर ले लो.
- लगभग 100 मीटर का एक संकल्प के अंतराल पर आमतौर पर 100 x 100 माप अंक के साथ एक नक्शा प्रदर्शन करने LIBS अधिग्रहण सॉफ्टवेयर का मानचित्रण मॉड्यूल सेट करें.
- अधिग्रहण शुरू. इस बिंदु से सब कुछ स्वचालित; दृश्य के रूप में अच्छी तरह से स्पेक्ट्रम रिकॉर्डिंग चलती है और बचत. 40 मिनट (100 माइक्रोन संकल्प के लिए 1 सेमी 2 के बराबर) 10,000 अंक के एक मानचित्रण के लिए आवश्यक हैं. एक ही फ़ाइल में सभी रिकॉर्ड स्पेक्ट्रा फिर से इकट्ठा.
- जब चinished, नमूना टुकड़ा का एक दूसरा फोटोग्राफ ले
- कैलिब्रेशन मापन
एक ही प्रयोगात्मक मानकों के साथ, (, तैयारी जानकारी के लिए खंड 2 देखें) अंशांकन नमूने उपाय. अंशांकन बूंदों में से प्रत्येक में एक नक्शा या (ड्रॉप के मध्य भाग में माप स्थलों से प्राप्त) रिकॉर्ड 25 स्पेक्ट्रा प्रदर्शन करना.
4 LIBS स्पेक्ट्रम विश्लेषण:. रासायनिक छवियाँ का निर्माण
- रिकॉर्ड सभी LIBS ऊतक मैपिंग से स्पेक्ट्रा और LIBS सॉफ्टवेयर विश्लेषण में उन्हें लोड. प्रत्येक स्पेक्ट्रम के लिए आधारभूत घटाना और एक झूठी रंग का उपयोग रिश्तेदार तीव्रता पैमाने के साथ रासायनिक छवियों का निर्माण.
नोट: एक एल्गोरिथ्म ऐसे जी.डी., कॉपर, ना, या सीए के रूप में विशिष्ट लाइन तीव्रता, retrieves. - अंशांकन घटता गणना (तीव्रता और एकाग्रता के बीच संबंध) की अनुमति है और वायु का निर्माण करने के लिए calibrated नमूना से मापा स्पेक्ट्रा पर ही ऑपरेशनuantitative नक्शे या छवि जी.डी. के लिए (या हित के अन्य तत्व).
- ऐसे प्रक्षेप या समरेखण के रूप में रासायनिक छवियों, करने के लिए पर्याप्त उपचार लागू करें. छवि प्रारूप (बिटमैप) में तीव्रता या एकाग्रता नक्शे को बचाओ.
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Representative Results
चित्रा 1, एक एन डी की किरण के रूप में दिखाया: 1,064 एनएम का मौलिक तरंग दैर्ध्य में YAG लेजर 50 मिमी फोकल दूरी की एक क्वार्ट्ज लेंस से ऊतक टुकड़ा पर खड़ी नीचे केंद्रित था. पल्स ऊर्जा 4 एम.जे. और पुनरावृत्ति दर 10 हर्ट्ज था. हवा में प्लाज्मा की पीढ़ी से बचने के क्रम में, लेजर बीम नमूना की सतह के नीचे 100 मीटर के आसपास केंद्रित किया गया था. कोई हवा प्लाज्मा इस हालत में मनाया गया. प्रयोगों के दौरान, नमूना नमूना (एकल शॉट) पर केवल एक ही स्थिति में एक प्लाज्मा उत्पन्न करने के क्रम में एक कदम मोटर द्वारा ले जाया गया था. सब्सट्रेट पर उत्पन्न खड्ड के एक सूक्ष्म अवलोकन 50 माइक्रोन से कम एक गड्ढा व्यास दिखाया. उत्पन्न प्लाज्मा (300 एनएम पर प्रज्वलित) मिमी प्रति 1,200 लाइनों की एक झंझरी के साथ सुसज्जित एक Czerny-ट्यूनर स्पेक्ट्रोग्राफ के लिए दूसरे छोर पर जुड़ा एक ऑप्टिकल फाइबर के प्रवेश द्वार पर लेंस के एक जोड़े ने उतारी थी. एक ICCD कैमरा स्पेक्ट्रोग्राफ का उत्पादन फोकल हवाई जहाज़ पर रखा गया थास्पेक्ट्रम रिकॉर्ड करने के लिए. माप के दौरान, (लेजर फोकस स्थिति के संबंध में) नमूना की सतह की ऊंचाई नमूना की सतह पर एक कम बिजली CW लेजर डायोड और एक सीसीडी की निगरानी कैमरे से एक obliquely घटना किरण के साथ त्रिकोणमितीय विधि का उपयोग पर नजर रखी है. ICCD nsec और 2 μsec देरी और फाटक मापदंडों के लिए क्रमशः स्थापित किए गए लेजर क्यू स्विच और 400 से शुरू हो गया था. एक मानचित्रण के दौरान, नमूना द्वारा स्थानांतरित कर दिया गया था एक एक लेजर शॉट के बाद 100 मीटर की ऑफसेट. एक स्पेक्ट्रम प्रत्येक लेजर शॉट के लिए दर्ज की गई थी. LabVIEW वातावरण में विकसित घर का सॉफ्टवेयर पूरे उपकरण को नियंत्रित और विशिष्ट पार्श्व संकल्प के साथ ऊतक के नमूने के हित के क्षेत्र को स्कैन करने के लिए स्वचालित अनुक्रम प्रदर्शन करने की अनुमति दी.
जी.डी. आधारित नैनोकणों के चतुर्थ इंजेक्शन के बाद एक गुर्दे ऊतक के विभिन्न क्षेत्रों पर दर्ज एकल शॉट स्पेक्ट्रा का उदाहरण चित्रा 2 में दिखाया गया है. नैनोकणों descr के रूप में संश्लेषित किया गयाMIGNOT एट अल 17 में ibed. संक्षेप में, नैनोकणों उनकी सतह पर DOTAGA-जी.डी. 3 + chelates पकड़े, एक polysiloxane मैट्रिक्स से बना रहे हैं. उन्होंने कहा कि वे एमआरआई, परमाणु इमेजिंग और प्रतिदीप्ति इमेजिंग में इस्तेमाल किया जा सकता है के रूप में अलग या एक साथ, (मैं) मल्टी मॉडल इमेजिंग के लिए विकसित की है, और (ii) चिकित्सकीय समारोह radiosensitizer के रूप में 18 (यानी स्थानीय स्तर पर रेडियोथेरेपी की दक्षता में वृद्धि) कर रहे हैं. इस्तेमाल किया वर्णक्रमीय रेंज (286-320 एनएम) ऐसे जी.डी., सीए, Fe, सी, और अल के रूप में विभिन्न तत्वों का पता लगाने की अनुमति देता है. नीले स्पेक्ट्रम गुर्दे (मज्जा) के मध्य क्षेत्र में दर्ज की गई थी, लाल स्पेक्ट्रम गुर्दे की झिल्ली (कैप्सूल) और परिधीय क्षेत्र (प्रांतस्था) को हरी स्पेक्ट्रम के लिए corresponded. यह जी.डी., सी, अल, सीए, और फ़े तीव्रता ऊतक के भीतर इन तत्वों सांद्रता की एक बड़ी विविधता का सुझाव दे, विभिन्न क्षेत्रों में व्यापक रूप से चर रहे हैं कि यह भी उल्लेखनीय है. असल में जी.डी. और सी जी.डी. आधार में समाहित किया गयाडी नैनोकणों, फे जैविक नमूने से ही, CA रक्त वाहिकाओं के लिए विशिष्ट था.
ऊतक टुकड़ा नमूने एक्स और वाई स्थिति में नमूना चलती है, मौके से घटनास्थल का विश्लेषण किया गया. पार्श्व संकल्प 100 माइक्रोन के करीब था. एक एकल स्पेक्ट्रम प्रत्येक स्थिति (एकल शॉट माप) के लिए रिकॉर्ड किया गया था. लाइन तीव्रता एक पृष्ठभूमि घटाव का उपयोग स्पेक्ट्रा से निकाले गए थे. रासायनिक छवियों तो इन तीव्रता से निर्माण किया गया. एक उदाहरण जी.डी., सी और फ़े के लिए 3 चित्र में दिखाया गया है. इन रासायनिक छवियों का निर्माण किया जाता लाइन्स तालिका 2 में दिखाया गया. विश्लेषण विभिन्न तत्वों का स्थानीयकरण और मानचित्रण सुधार करने के लिए प्रयोग से पहले जैविक नमूने का रंग फोटोग्राफी के लिए सहसंबद्ध था. गुर्दे में, जी.डी. और सी संकेतों सह स्थानीयकृत थे, लेकिन इस सह स्थानीयकरण एक विशिष्ट वितरण का संकेत है, फ़े के वितरण के साथ फिट नहीं था.
सिमीLAR परिणाम ट्यूमर के नमूनों से प्राप्त किया गया. SQ20B ट्यूमर के ऊतक पर माप का एक उदाहरण चित्रा 4 में दिखाया गया है. इस मामले में, एक झूठी रंग पैमाने के साथ दिखाया जी.डी. रासायनिक का नक्शा, प्राकृतिक प्रकाश तस्वीर को superposed किया गया है. इस माप के लिए, मात्रात्मक विश्लेषण स्थानीय gadolinium एकाग्रता (प्रोटोकॉल अनुभाग में प्रक्रिया देखें) को पुनः प्राप्त करने के लिए प्रदर्शन किया गया है. इस प्रयोग के लिए, नैनोकणों इंजेक्शन के बाद 1 घंटा हटा दिया है और विश्लेषण के लिए कटा हुआ था जो ट्यूमर, में सीधे दिलाई गई. चित्रा 4 में देखा, परिधि को ट्यूमर केंद्र में इंजेक्शन बिंदु से ऊतक में विसरित कणों. 1 घंटा इंजेक्शन के बाद, ट्यूमर मात्रा का लगभग आधा कुछ कणों निहित. इस तरह की एक मानचित्रण चिकित्सकीय प्रोटोकॉल के बारे में जानकारी प्रदान करने के लिए मदद कर सकते हैं. उपचार के इष्टतम प्रभावकारिता के लिए, नैनोकणों पूरी ट्यूमर के भीतर फैलाना चाहिए; 1 घंटा, केवल हा के बादट्यूमर के वाम मोर्चे के एक लंबे समय तक प्रसार समय एक इष्टतम प्रसार और इस प्रकार प्रभावी उपचार के लिए आवश्यक होगा, सुझाव है कि कुछ कणों निहित.
तालिका 1. मुख्य स्थानिक रासायनिक मौलिक इमेजिंग के लिए विश्लेषणात्मक तकनीकों का संकल्प लिया. (Lobinski एट अल. 5). इस तालिका का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.
इस्तेमाल किया LIBS प्रयोगात्मक स्थापना के चित्रा 1. योजनाबद्ध प्रस्तुति. (आदर्श वाक्य रोस एट अल. 15).
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चित्रा 2. गुर्दे ऊतक के तीन विभिन्न क्षेत्रों में प्राप्त LIBS एकल शॉट स्पेक्ट्रा. इन क्षेत्रों मज्जा (गुर्दे के मध्य भाग), लाल रंग में कैप्सूल और हरे रंग में प्रांतस्था हैं. स्पेक्ट्रा स्पष्टता के लिए खड़ी स्थानांतरित कर दिया गया है.
चित्रा 3. माउस गुर्दे का एक टुकड़ा में जी.डी., सी, और फ़े के LIBS मौलिक मानचित्रण पाठ में निर्दिष्ट शर्तों के अनुसार तैयार किया. रासायनिक छवियों के पैमाने पर तीव्रता एक मनमाना इकाई में व्यक्त किया है. एक प्राकृतिक प्रकाश फोटोग्राफी भी चित्रा के ऊपरी बाएँ में दिखाया गया है.
तालिका 2. एक माउस गुर्दे में जी.डी., सी, और फ़े का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया वर्णक्रमीय लाइनों (परमाणु लाइनों मैं चिह्नित कर रहे हैं और आयनिक लाइनों द्वितीय चिह्नित कर रहे हैं).
चित्रा 4. ट्यूमर के ऊतक का एक टुकड़ा के अंदर जी.डी. के LIBS मात्रात्मक मानचित्रण. झूठी रंग पैमाने 20 मिमी (बैंगनी) के लिए 0.1 मिमी (हरा) से चलाता है.
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Discussion
जैविक नमूने के लिए लागू है, इस तकनीक विभिन्न अंगों में इंजेक्शन जी.डी. आधारित नैनोकणों से जी.डी. और सी की मैपिंग और मात्रा का ठहराव, यानी, रासायनिक इमेजिंग की अनुमति देता है. मुख्य महत्वपूर्ण सेटिंग्स से, लेजर गुण (तरंग दैर्ध्य, पल्स ऊर्जा, ध्यान केंद्रित, और स्थिरता) के नियंत्रण के लिए एक सटीक और ठीक ऊतक पृथक (यानी मानचित्रण संकल्प) के लिए और साथ ही संवेदनशीलता के लिए महत्वपूर्ण है. उच्च ऊर्जा पर कार्य करना एक बेहतर संवेदनशीलता प्रदान करता है लेकिन दुर्भाग्य से अपमानित स्थानिक संकल्प उत्पन्न करता है. इसके अलावा, इस्तेमाल किया स्पेक्ट्रोमीटर के प्रकार के ध्यान से जाँच की जानी चाहिए. असल में, (उदाहरण के लिए एक Echelle स्पेक्ट्रोमीटर का प्रयोग करके) एक ब्रॉडबैंड जांच मौलिक प्रजातियों का एक बड़ा विकल्प की अनुमति होगी, लेकिन कम संवेदनशीलता के साथ, (एक ICCD या एक पीएमटी के साथ सुसज्जित) एक Czerny टर्नर स्पेक्ट्रोमीटर का उपयोग करते समय कम तत्वों का पता लगाने की अनुमति होगी, लेकिन ज्यादा के साथ अधिक संवेदनशीलता. जांच तरंगदैर्ध्य रेंज के सभी चुने हुए सेटिंग पी समायोजित किया जाना चाहिएजांच के urpose.
जैविक नमूने खुद के संबंध में, इसकी मोटाई और कठोरता भी स्पेक्ट्रम की गुणवत्ता के साथ हस्तक्षेप कर सकता है. एक बहुत पतली नमूना पूरी तरह से छिड़काव किया जाएगा और एक भी मोटी नमूना अपने संविधान का अपने में एकरूपता से पीड़ित हो सकता है, जबकि नमूना समर्थन पर reverberated किया जाएगा, लेजर शॉट से भी हमला किया जाएगा में एकरूपता छिड़काव की राशि की बात (बड़े जहाजों आदि की उपस्थिति). मौलिक अध्ययन से, समर्थन के चुनाव पूर्वानुमानित किया जा सकता है; उदाहरण के लिए, जांच तत्व सी है, तो नमूना शुद्ध प्लास्टिक पर दायर किया जाना चाहिए, लेकिन यह सी की बड़ी मात्रा में होता है के रूप में शीशे से बचने की जानी चाहिए. इसी तरह, नमूना अध्ययन तत्व के स्तर को दूषित करने लगानेवाला के किसी भी घटक को रोकने के लिए विशेष परिस्थितियों में तैयार किया और तय किया जा सकता है.
इस तकनीक को पूर्व नैदानिक नमूनों के विश्लेषण के लिए बहुत उपयोगी हो सकता है. LIBS couएलडी मस्तिष्क के नमूने में विशेष रूप से इस तरह के फे और घन के रूप में असामान्य धातु तत्व का पता लगाने की अनुमति. फ़े के साथ एक विशेष सीमा हीमोग्लोबिन में फे की उच्च सामग्री होना चाहिए; नमूना सावधानी से तैयार किया है और एक अंशांकन परख का मूल्यांकन अनिवार्य है. जीव विज्ञान या चिकित्सा के लिए लागू जैव प्रौद्योगिकी के क्षेत्र में, LIBS आदि Au, जी.डी., घन, के रूप में एक विशिष्ट तत्व शामिल किसी भी परिसर या कण का पता लगाने की अनुमति दे सकता
पीठ टॉप इंस्ट्रूमेंटेशन का पता लगाने के धातु तत्व के पूरक अवलोकन के लिए एक उपकरण के रूप में जीव विज्ञान और चिकित्सा में इसकी बड़ी क्षमता का उपयोग दिखाता है जो मानक ऑप्टिकल माइक्रोस्कोपी के साथ पूरी तरह से संगत है. (मिलीग्राम / किलो की रेंज में) कम सीमा का पता लगाने के साथ उच्च पार्श्व संकल्प (<50 माइक्रोन) के संयोजन मौलिक इमेजिंग के इस प्रकार, आम तौर पर इस तरह के विकिरण विकिरण microanalysis (SXRF) या उपपादन द्वारा मिलकर लेजर पृथक रूप में आवश्यक उपकरणों के उच्च स्तर, शामिल है जन Spectrometry (ला आईसीपी एमएस), यह बहुत प्रतिबंधक और व्यावसायिक रूप से उपलब्ध सूक्ष्म इमेजिंग सिस्टम के साथ असंगत बना रही है. LIBS इंस्ट्रूमेंटेशन (100 और 200 कश्मीर € के बीच कीमत) की आवश्यकता संकल्प और संवेदनशीलता के आधार पर, बहुत महंगा नहीं है. वर्तमान में एक 1 सेमी 2 नमूना 30-40 मिनट के भीतर विश्लेषण किया जा सकता है; इस अधिग्रहण के समय इस तरह के प्रतिदीप्ति का पता लगाने और नमूने के रंग इमेजिंग के रूप में अन्य सूक्ष्म तकनीक के अलावा के बाद बदल नहीं सकता. वर्तमान में 100 माइक्रोन स्थानिक संकल्प पहले से ही जैविक ऊतकों की मैपिंग के लिए प्रभावकारिता को दर्शाता है. हालांकि, इस संकल्प को काफी पृथक लेजर पल्स ध्यान केंद्रित करने के लिए एक ऑप्टिकल माइक्रोस्कोप के बजाय एक साधारण लेंस का उपयोग करके सुधार किया जा सकता है. कम सामग्री ablated किया जाएगा संवेदनशीलता, छोड़ देंगे, भले ही माइक्रोमीटर संकल्प सैद्धांतिक रूप से पहुंचा जा सकता है. 10 माइक्रोन तक बढ़ रही संकल्प नैनोकणों के एक सटीक स्थानीयकरण सेल स्तर पर मनाया जा करने की अनुमति होगी.
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Disclosures
लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.
Acknowledgments
लेखकों कृतज्ञता LABEX-Imust द्वारा वित्तीय सहायता को स्वीकार करते हैं.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Laser nanosecond Nd:YAG | Quantel | Brillant | 5 nsec pulse width, wavelength 1,064 nm |
| Spectrometer | Andor Technology | Shamrock 303 | with 1,200 lines/mm blazed at 300 nm grating |
| Detector ICCD | Andor Technology | Istar | 2 nsec temporal resolution |
| LIBS Unit | ILM | Homemade Instrumentation | |
| Gd-based nanoparticles | Nano-H | particles | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | for particle's dilution |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | 21108 | for particle's dilution |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S5886 | for particle's dilution |
| Mice | Charles River | depending of animal breeding | |
| Isoflurane | Coveto / Virbac | for anaesthesia - Isofluranum | |
| Isopentane | Sigma-Aldrich | 59060 | to froze the sample slowly |
| Liquid nitrogen | Air Liquide | to cool down the isopentane | |
| Cryostat | Leica | CM-3050S | to slide the samples |
| Petri dishes | Dutscher | 353004 | to stick the sample |
References
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