Summary
Spettroscopia laser ripartizione indotta eseguita su organi sottile e tessuto tumorale rilevato con successo elementi naturali e gadolinio artificialmente iniettato (Gd), emessi da nanoparticelle a base di Gd. Immagini di elementi chimici raggiunto una risoluzione di 100 micron e sensibilità quantitativa sub-mM. La compatibilità del setup con la microscopia ottica standard sottolinea la sua capacità di fornire immagini multiple di uno stesso tessuto biologico.
Abstract
Spettroscopia di emissione di plasma indotto da laser è stato applicato ad analisi elementare di campioni biologici. Spettroscopia ripartizione laser-indotta (LIBS) eseguita su sezioni sottili di tessuti roditori: reni e tumorali, consente il rilevamento di elementi inorganici come (i) Na, Ca, Cu, Mg, P, Fe e, naturalmente presenti nel corpo e (ii) Si e Gd, rilevati dopo l'iniezione di nanoparticelle a base di gadolinio. Gli animali sono stati sacrificati da 1 a 24 ore dopo l'iniezione endovenosa di particelle. Una scansione bidimensionale del campione, effettuata utilizzando un micrometrica 3D-stadio motorizzato, ha permesso il raggio laser infrarosso esplorare la superficie con una risoluzione laterale di 100 μ m. Immagini chimica quantitativa di elemento Gd all'interno dell'organo sono stati ottenuti con sensibilità sub-mM. LIBS offre un metodo semplice e robusto per studiare la distribuzione di materiali inorganici senza labeli specificong. Inoltre, la compatibilità della configurazione con microscopia ottica standard sottolinea il suo potenziale di fornire immagini multiple dello stesso tessuto biologico con differenti tipi di risposte: elementari, molecolari o cellulari.
Introduction
L'ampio sviluppo di nanoparticelle per applicazioni biologiche sollecitato il parallelo miglioramento delle tecniche analitiche per la loro quantificazione e di imaging in campioni biologici. Solitamente la rilevazione e la mappatura delle nanoparticelle in organi sono fatti da fluorescenza o microscopia confocale. Sfortunatamente questi metodi richiedono l'etichettatura delle nanoparticelle da un colorante vicino infrarosso che può modificare la biodistribuzione delle nanoparticelle, in particolare per le piccolissime nanoparticelle per le sue proprietà idrofobiche. La rilevazione delle nanoparticelle etichettati, e soprattutto le piccole nanoparticelle (dimensioni <10 nm), potrebbe quindi interferire con la loro distribuzione biologica l'intera scala di corpo, ma anche a livello di tessuti e cellule. Lo sviluppo di nuovi dispositivi in grado di rilevare le nanoparticelle senza etichettatura offre nuove possibilità per lo studio del loro comportamento e cinetica. Inoltre, il ruolo di oligoelementi, quali ferro e rame nel cervello Malattie di unmalattie neurodegenerative come l'Alzheimer d 1, Menkes 2,3, o 4 Wilson suggeriscono l'interesse di studiare e localizzare questi elementi nei tessuti.
Varie tecniche sono state usate per fornire la mappatura microanalisi elementare o di materiali diversi. Nel loro articolo recensione pubblicata nel 2006, R. Lobinski et al. Ha fornito una panoramica delle tecniche disponibili standard per microanalisi elementare in ambiente biologico, uno degli ambienti più difficili per le scienze analitiche 5. Microsonda elettronica, che consiste di energia dispersiva microanalisi a raggi X in un microscopio elettronico a trasmissione, può essere applicato a numerosi studi se la concentrazione dell'elemento è sufficiente (> 100-1.000 mg / g). Per raggiungere limiti di rivelazione inferiori, sono state utilizzate le seguenti tecniche:
- microsonda fascio ionico usando particelle indotta da X-ray Emission μ-PIXE (1-10 mg / g) 6
- synchrotron microanalisi radiazione μ-SXRF (0,1-1 mg / g) 7
- spettrometria di massa di ioni secondari SIMS (0.1 mg / g) 8
- ablazione laser accoppiato induttivamente spettrometria di massa LA-ICP-MS (fino a 0,01 mg / g) 9,10
Le tecniche sopra citate forniscono risoluzione micrometrica come mostrato nella Tabella 1 estratto da Lobinski et al.
Ricostruzione 3D delle indagini 2D di serie potrebbe essere proposto anche per la ricostruzione dei tessuti più profondi 11. Tuttavia, tutti i dispositivi e sistemi richiedono entrambi professionisti qualificati, moderati da attrezzature altamente costose ed esperimenti di lunga durata (in genere più di 4 ore per un 100 micron x 100 micron per μ-SXRF di 10 mm x 10 mm per LA-ICP-MS ) 12. Complessivamente, questi requisiti rendono microanalisi elementare molto limitazione e incompatibile con i sistemi di imaging ottico convenzionale,microscopia a fluorescenza o microscopia non lineare. Un altro punto che si può menzionare qui è che la capacità di misura quantitativa è ancora abbastanza limitata e dipende dalla disponibilità di standard di laboratorio accoppiata alla matrice. L'ulteriore generalizzazione dell'uso di microanalisi elementare nei processi industriali, la geologia, la biologia e altri domini di applicazioni apporterà notevoli progressi concettuali e tecnologiche.
Lo scopo della presente manoscritto è quello di proporre soluzioni per la mappatura elementare quantitativa (o microanalisi elementare) nei tessuti biologici con una strumentazione tavolo pienamente compatibile con microscopia ottica convenzionale. Il nostro approccio è basato sulla spettroscopia ripartizione indotta da laser (tecnologia LIBS). In LIBS, un impulso laser viene focalizzato sul campione di interesse per creare la composizione e la scintilla del materiale. La radiazione emessa atomico nel plasma viene successivamente analizzato da uno spettrometro e il elementariLe concentrazioni TAL possono essere recuperati con le misure di calibrazione effettuate in anticipo 13,14. I vantaggi di LIBS includono sensibilità (mcg / g per quasi tutti gli elementi), compattezza, preparazione molto semplice campione, assenza di contatto con il campione, risposta istantanea e localizzata precisamente (micro) analisi di superficie. Tuttavia, l'applicazione dell'imaging chimico tessuto rimane difficile dall'inizio della ablazione laser del tessuto deve essere finemente controllata effettuare mappe con elevata risoluzione spaziale e la sensibilità nell'intervallo mcg / g 15,16.
Con tale soluzione, non è richiesta l'aggiunzione di rivelatori o agenti di etichettatura, che permette di rilevare elementi inorganici direttamente nel loro ambiente nativo nei tessuti biologici. Lo strumento LIBS sviluppato nel nostro laboratorio offre una risoluzione corrente inferiore a 100 micron, con una sensibilità stimata per Gd inferiore a 35 mg / g, pari a 0,1 mM 16, che consentela mappatura di grandi campioni (> 1 cm 2) in 30 min. Inoltre, il software casalingo facilita l'acquisizione e lo sfruttamento dei dati. Questo strumento è utilizzato per rilevare, carta, e quantificare la distribuzione tissutale di gadolinio nanoparticelle basate (Gd) 17 - 18 nei reni e campioni tumorali da piccoli animali, da 1 a 24 ore dopo l'iniezione endovenosa di particelle (dimensione <5 nm) . Elementi inorganici, che sono intrinsecamente contenute in un tessuto biologico, come Fe, Ca, Na, e P, sono stati rilevati e ripreso.
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Protocol
1. Preparazione del campione biologico
Tutti gli esperimenti descritti in questo studio sono stati approvati dal Comitato cura degli animali ed uso del CECCAPP (Lione, Francia) (autorizzazione # LYONSUD_2012_004), e gli esperimenti sono stati effettuati sotto la supervisione di persone autorizzate (L. Sancey, DDPP autorizzazione # 38 05 32).
- Aggiungere 1 ml di H 2 O a 100 pmol di nanoparticelle a base di gadolinio (Gd), attendere 15 min, e aggiungere 20 ml di HEPES 50 mM, NaCl 1,325 M, CaCl 2 20 mM a 100 ml di H 2 O e 80 microlitri la soluzione primaria di nanoparticelle a base di Gd per ottenere una soluzione di 200 ml a 40 mm pronti per l'iniezione (Città: Villeurbanne, in laboratorio).
- Iniettare la soluzione di nanoparticelle a base di Gd 200 ml per via endovenosa in anestetizzati tumore roditori (Città: Lyon Sud (Oullins), a 15 km da laboratorio).
- 1-24 ore dopo l'iniezione, i topi sacrificare und mettere i campioni biologici in isopentano raffreddato con azoto liquido. Conservare i campioni a - 80 ° C (Città: Lyon Sud (Oullins), a 15 km dal laboratorio).
- Tagliate il campione (Città: solitamente Grenoble, a 100 km dal laboratorio; cercherò di avere un accesso a Lione Sud) in 100 slides micron di spessore e mettere le diapositive biologiche su piatti di plastica specifici (piatto di Petri). Conservare a -80 ° C.
Nota: i piatti di plastica sono fondamentalmente un campione di polimero molto puro. Essi sono utilizzati per evitare interferenze con gli elementi contenuti nel tessuto.
2. Preparazione del campione per la calibrazione
- Preparare flaconi con dosi crescenti di nanoparticelle basato Gd in acqua (0 nM, 100 nM, 500 nM, 1 mM, 5 mM, 10 mM, 50 mM, 100 mM, 500 mM, 1 mM e 5 mM).
- Mettere un 5 ml-drop di ogni soluzione regolarmente distanziate di 3 mm sulla piastra di Petri.
- Asciutto a temperatura ambiente per 20 minuti.
3. LIBS Experiment
- Inizializzazione Setup LIBS
- Impostazioni Laser. Dopo l'accensione degli strumenti, attendere 10-20 minuti per la stabilizzazione di energia laser a impulsi e il raffreddamento della macchina fotografica ICCD a -20 ° C. Regolare l'energia dell'impulso con l'attenuatore.
Nota: I parametri ottimali laser per tessuti di mappatura sono 5 nsec durata dell'impulso, 1.064 nm di lunghezza d'onda, e l'energia di impulso di circa 4 mJ. Il laser utilizzato è un tipico Nd: YAG laser nanosecondo. - LIBS Impostazioni. Impostare la posizione di focalizzazione laser (rispetto alla superficie del campione) per ottenere il diametro più piccolo cratere (circa 50 micron o meno).
Nota: Questo corrisponde ad una focalizzazione dell'impulso laser 100 micron sotto la superficie del campione. - Impostazioni spettrometro. Utilizzare lo spettrometro Czerny-Turner combinato con un 1.200 linee / mm reticolo e un elevato temporale fotocamera a risoluzione ICCD. Controllare tutti questi dispositivi da computer. Impostare il valore fessura di ingresso a 40 micron. Impostare l'intervallo spettrale reGARDING l'elemento da analizzare. Utilizzare l'intervallo spettrale copre 325-355 nm per rivelare Gd con alta sensibilità, così come Na, Ca e Cu. Impostare i parametri ICCD con un ritardo di 300 nsec, un cancello di 2 msec, e un guadagno di 200.
- Impostazioni Laser. Dopo l'accensione degli strumenti, attendere 10-20 minuti per la stabilizzazione di energia laser a impulsi e il raffreddamento della macchina fotografica ICCD a -20 ° C. Regolare l'energia dell'impulso con l'attenuatore.
- Mapping di misura
- Collocare il campione biologico sul supporto del campione LIBS motorizzato.
- Regolare l'altezza del campione secondo la posizione del fuoco del laser.
- Prendete un alta risoluzione foto della fetta del campione.
- Impostare il modulo mappatura del software di acquisizione LIBS effettuare una mappa con tipicamente 100 x 100 punti di misura distanziati da una risoluzione di circa 100 pm.
- Avviare l'acquisizione. Da questo punto di automatizzare tutto; il movimento sequenza così come la registrazione dello spettro e risparmio. 40 min sono necessari per una mappatura di 10.000 punti (equivalente a 1 cm 2 per risoluzione di 100 micron). Raggruppare tutti gli spettri registrati in uno stesso file.
- Quando finished, scattare una seconda foto della fetta del campione
- Misurazione Calibrazione
Con gli stessi parametri sperimentali, misurare i campioni di calibrazione (per i dettagli di preparazione, vedere paragrafo 2). Eseguire una mappa o record di 25 spettri (ottenuto da siti di misura nella parte centro della goccia) in ciascuna delle gocce di taratura.
4 LIBS Spectrum Analysis:. Costruire delle immagini chimici
- Registrare tutti gli spettri LIBS dalla mappatura del tessuto e caricarli nel software di analisi LIBS. Sottrarre la linea di base per ogni spettro e costruire le immagini chimici con scala di intensità relativa utilizzando un colore falso.
Nota: Un algoritmo recupera specifici intensità di linea, come Gd, Cu, Na, o Ca. - Eseguire la stessa operazione sul spettri misurati dal campione calibrato per consentire il calcolo curve di calibrazione (relazione tra intensità e concentrazione) e costruire aqmappa uantitative o immagine per Gd (o altro elemento di interesse).
- Applicare i trattamenti adeguati alle immagini chimici, come interpolazione o levigatura. Salvare l'intensità o la concentrazione mappe in formato immagine (bitmap).
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Representative Results
Come mostrato in figura 1, il fascio di un laser Nd: YAG nella lunghezza d'onda fondamentale di 1.064 nm è concentrata verticalmente sulla fetta di tessuto da una lente di quarzo di 50 mm di distanza focale. L'energia di impulso è stato di 4 mJ e la frequenza di ripetizione 10 Hz. Al fine di evitare la generazione di plasma in aria, il fascio laser è focalizzato circa 100 micron sotto la superficie del campione. Nessuna plasma ad aria è stato osservato in questa condizione. Durante gli esperimenti, il campione è stato spostato da un motore passo-passo per generare un plasma in una sola posizione sul campione (colpo singolo). Una osservazione microscopica dei crateri generati sul substrato mostrato un cratere diametro inferiore a 50 micron. Il plasma generato è stato ripreso da una coppia di lenti sulla ingresso di una fibra ottica collegata all'altra estremità ad uno spettrografo Czerny-Tuner dotato di una griglia di 1200 linee per mm (reale segnalato a 300 nm). Una telecamera ICCD è stato montato sul piano focale uscita dello spettrografoper registrare lo spettro. Durante le misurazioni, l'altezza della superficie del campione (per quanto riguarda la posizione del fuoco del laser) è controllata mediante metodo trigonometrico con un fascio incidente obliquamente da un diodo laser a bassa potenza cw sulla superficie del campione e una telecamera video CCD. L'ICCD è stata innescata dal laser Q-switch e 400 nanosecondi e 2 msec sono stati fissati rispettivamente per i parametri di ritardo e cancelli. Durante una mappatura, il campione è stato spostato di un offset di 100 pm, dopo ogni colpo laser. Uno spettro è stato registrato per ogni colpo laser. Casalinga software sviluppato in ambiente LabVIEW controllava l'intera attrezzatura e consentito effettuare sequenza automatica per la scansione della zona di interesse del campione di tessuto con risoluzione laterale specifico.
Esempio di spettri colpo singolo, registrato su diverse regioni di un tessuto renale dopo l'iniezione IV di nanoparticelle a base di Gd è mostrato in Figura 2. Le nanoparticelle sono stati sintetizzati come described in Mignot et al 17. Brevemente, le nanoparticelle sono composte da una matrice polisilossano, tenendo DOTAGA-Gd 3 + chelati sulla loro superficie. Sono sviluppati per (i) di imaging multimodale in quanto possono essere utilizzati in MRI, imaging nucleare e imaging di fluorescenza, separatamente o contemporaneamente, e (ii) funzione terapeutica come radiosensibilizzatore (cioè aumentando localmente la efficienza della radioterapia) 18. La gamma spettrale utilizzata (286 e 320 nm) permette di rilevare diversi elementi come Gd, Ca, Fe, Si, Al e. Lo spettro blu è stato registrato nella regione centrale del rene (midollo), lo spettro rosso corrisponde alla membrana rene (capsula) e spettro verde alla zona periferica (corteccia). E 'anche interessante notare che i Gd, Si, Al, Ca e Fe intensità sono ampiamente variabili in diverse regioni, che suggerisce un grande eterogeneità di queste concentrazioni elementi all'interno del tessuto. Fondamentalmente Gd e Si erano contenenti nella Gd-based nanoparticelle, Fe era specifico per i vasi sanguigni, Ca dal campione biologico stesso.
I campioni di tessuto sono stati analizzati fetta punto per punto, spostando il campione nella posizione X e Y. Risoluzione laterale era vicino a 100 micron. Uno spettro singolo è stato registrato per ogni posizione (misura solo colpo). Intensità di linea sono stati estratti dagli spettri utilizzando una sottrazione del fondo. Le immagini chimici sono stati poi costruiti da queste intensità. Un esempio è mostrato in Figura 3 per Gd, Si e Fe. Linee utilizzate per costruire queste immagini chimici sono mostrati nella Tabella 2. L'analisi è stata correlata alla fotografia a colori del campione biologico prima dell'esperimento di migliorare la localizzazione e la mappatura dei vari elementi. Nel rene, i segnali Gd e Si sono co-localizzate, ma questa co-localizzazione non misura con la distribuzione del Fe, indicando una specifica distribuzione.
Simirisultati lar sono stati ottenuti con campioni tumorali. Un esempio di misura sul tessuto tumorale SQ20B è mostrato in Figura 4. In questo caso, la mappa chimica di Gd, mostrato con una scala in falsi colori, è stata sovrapposta all'immagine luce naturale. Per questa misurazione, analisi quantitativa è stata eseguita per recuperare la concentrazione di gadolinio locale (vedere la procedura nella sezione del protocollo). Per questo esperimento, le nanoparticelle sono stati somministrati direttamente nel tumore, che è stato rimosso 1 ora dopo l'iniezione e affettato per l'analisi. Come visibile in figura 4, le particelle diffuse nel tessuto dal punto di iniezione nel centro tumore alla periferia. 1 ora dopo l'iniezione, circa la metà del volume del tumore conteneva alcune particelle. Tale mappatura può contribuire a fornire informazioni sul protocollo terapeutico. Per un'efficacia ottimale del trattamento, le nanoparticelle devono diffondere all'interno dell'intero tumore; dopo 1 ora, solo half del tumore conteneva alcune particelle, suggerendo che un tempo di diffusione più sarebbe necessaria per una diffusione ottimale e trattamento così efficace.
Tabella 1. Principale risolta spazialmente tecniche analitiche per l'imaging chimica elementare. (Lobinski et al. 5). Cliccare qui per vedere una versione più grande di questa tabella.
Figura 1. Rappresentazione schematica della LIBS utilizzato setup sperimentale. (Motto Ros-et al. 15).
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Figura 2. LIBS colpo singolo spettri ottenuti in tre diverse regioni del tessuto renale. Queste regioni sono midollare (parte centrale del rene), la capsula in rosso e corteccia nel verde. Spectra sono state spostate in verticale per chiarezza.
Figura 3. LIBS mappatura elementare di Do, Si e Fe in una fetta di rene di topo preparata secondo le condizioni indicate nel testo. L'intensità scala da immagini chimici è espressa in unità arbitrarie. Una fotografia luce naturale viene visualizzato anche nella parte superiore sinistra della figura.
Tabella 2. Linee spettrali utilizzati per la rilevazione di Do, Si, Fe e in un rene mouse (linee atomiche sono etichettati I e linee ionici sono etichettati II).
Figura 4. LIBS mappatura quantitativa di Gd all'interno di una fetta di tessuto tumorale. La scala in falsi colori va da 0,1 mm (verde) a 20 mM (violetto).
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Discussion
Applicato al campione biologico, questa tecnica consente di imaging chimica, cioè la mappatura e quantificazione, di Do e Si iniettati da nanoparticelle a base di Gd in diversi organi. Dalle principali impostazioni critiche, il controllo delle proprietà del laser (lunghezza d'onda, energia dell'impulso, focalizzazione e stabilità) è fondamentale per una ablazione del tessuto preciso e fine (cioè risoluzione mapping), nonché per la sensibilità. Lavorare ad alta energia offre una migliore sensibilità, ma genera purtroppo risoluzione spaziale degradata. Inoltre, il tipo di spettrometro utilizzato deve essere attentamente controllato. Fondamentalmente, un'indagine banda larga (utilizzando ad esempio uno spettrometro Echelle) consente un'ampia scelta di specie elementari ma con bassa sensibilità, mentre usando uno spettrometro Czerny-Turner (dotato ICCD o un PMT) consentirà la rilevazione meno elementi ma con molta maggiore sensibilità. Tutte le impostazioni scelte della gamma di lunghezze d'onda tastato dovrebbero essere adattati per la pINALITÀ delle indagini.
Per quanto riguarda il campione biologico stesso, il suo spessore e durezza potrebbe anche interferire con la qualità dello spettro. Un campione molto sottile sarebbe totalmente spruzzato e il supporto del campione sarebbe attaccato anche dal tiro laser, mentre un campione troppo spessa potrebbe subire dal suo in-omogeneità della sua costituzione che sarà riverberava sulla disomogeneità della quantità di spruzzato materia (presenza di grandi navi, ecc). Dallo studio elementare, la scelta del supporto potrebbe essere anticipato; per esempio, se l'elemento esaminato è SI, il campione deve essere depositato su plastica pura ma vetro deve essere evita quanto contiene grandi quantità di Si. Analogamente, il campione potrebbe essere preparato e fissato in condizioni specifiche per prevenire qualsiasi componente del fissativo contaminare il livello dell'elemento studiato.
Questa tecnica può essere molto utile per l'analisi di campioni pre-clinici. LIBS could permettere la rivelazione di elementi metallici anomali come Fe e Cu, in particolare in campioni cerebrali. Una particolare limitazione con Fe dovrebbe essere l'alto contenuto di Fe dell'emoglobina; il campione preparato con cura e la valutazione di un test di calibrazione è obbligatoria. Nel campo delle biotecnologie applicate alla biologia o medicina, LIBS potrebbe consentire il rilevamento di qualsiasi composto o una particella che contiene un elemento specifico come Au, Gd, Cu, ecc
La strumentazione da banco è completamente compatibile con la microscopia ottica standard, che mostra il suo grande potenziale utilizzo in biologia e medicina come strumento di osservazione complementare di elementi metallici in tracce. Questo tipo di rappresentazione elementare, combinando alta risoluzione laterale (<50 micron) con limiti di rilevabilità bassi (nell'intervallo mg / kg), comporta generalmente elevato livello di attrezzature necessarie, come microanalisi radiazione di sincrotrone (SXRF) o ablazione laser accoppiato induttivamente spettrofotometro di massametria (LA-ICP-MS), il che rende molto restrittiva ed incompatibile con i sistemi di imaging microscopici disponibili in commercio. La strumentazione LIBS non è molto costoso, a seconda della risoluzione e sensibilità richiesta (prezzo tra 100 e 200 k €). Attualmente un campione di 1 cm 2 potrebbe essere analizzato entro 30-40 minuti; questo tempo di acquisizione non potrebbe cambiare dopo l'aggiunta di altre tecniche microscopiche come rivelazione di fluorescenza e l'imaging colorata del campione. La risoluzione spaziale 100 pm corrente mostra già l'efficacia per la mappatura dei tessuti biologici. Tuttavia, questa risoluzione potrebbe essere notevolmente migliorata utilizzando un microscopio ottico al posto di una lente semplice per focalizzare l'impulso laser ablazione. Risoluzione micrometro può teoricamente raggiungibile, anche se la sensibilità scenderà, come meno materiale sarà ablato. Aumentando la risoluzione di 10 micron consentirebbe una localizzazione precisa di nanoparticelle da osservare a livello di cella.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Gli autori ringraziano il sostegno finanziario da parte della Labex-Imust.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Laser nanosecond Nd:YAG | Quantel | Brillant | 5 nsec pulse width, wavelength 1,064 nm |
| Spectrometer | Andor Technology | Shamrock 303 | with 1,200 lines/mm blazed at 300 nm grating |
| Detector ICCD | Andor Technology | Istar | 2 nsec temporal resolution |
| LIBS Unit | ILM | Homemade Instrumentation | |
| Gd-based nanoparticles | Nano-H | particles | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | for particle's dilution |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | 21108 | for particle's dilution |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S5886 | for particle's dilution |
| Mice | Charles River | depending of animal breeding | |
| Isoflurane | Coveto / Virbac | for anaesthesia - Isofluranum | |
| Isopentane | Sigma-Aldrich | 59060 | to froze the sample slowly |
| Liquid nitrogen | Air Liquide | to cool down the isopentane | |
| Cryostat | Leica | CM-3050S | to slide the samples |
| Petri dishes | Dutscher | 353004 | to stick the sample |
References
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