Summary
薄い臓器や腫瘍組織で実行レーザー誘起ブレークダウン分光法は、成功したGd系ナノ粒子から発行された自然の要素と人工的に注入されたガドリニウム(Gd)を検出しました。化学元素の画像が100μmであり、定量的なサブミリ感度の解像度に達した。標準的な光学顕微鏡法を使用してセットアップの相溶性が同じ生物学的組織の複数の画像を提供するためのその可能性を強調している。
Abstract
レーザ誘起プラズマの発光分光法は、生体試料の元素分析に適用した。レーザ誘起ブレークダウン分光法(LIBS)げっ歯類組織の薄切片上で行わ:、腎臓および腫瘍例えば、(i)のNa、Ca、CuやMgの、P、及びFe等の無機元素の検出を可能にする、体内に自然に存在し(II)SiとGdが、ガドリニウム系ナノ粒子の注入後に検出。動物は、粒子の静脈内注射後1〜24時間後に安楽死させた。試料の二次元走査が、赤外レーザ光 が横解像度が100未満μmは表面を探索させ、電動マイクロメートル3Dステージを用いて行わ。臓器内部のGd元素の定量化学画像は、サブmMの感度が得られた。 LIBSは、特定のlabeliなしに無機材料の分布を研究するためのシンプルかつ堅牢な方法を提供していますNG。 、元素、分子、または細胞:さらに、標準的な光学顕微鏡法を使用してセットアップの適合性は、応答の異なる種類の同じ生物学的組織の複数の画像を提供するためのその可能性を強調している。
Introduction
生物学的用途のためのナノ粒子の広い開発は、生物学的サンプルでの定量化や画像化のための分析技術の並列改善を促した。通常、臓器中のナノ粒子の検出およびマッピングは、蛍光または共焦点顕微鏡法によって作製される。残念ながら、これらの方法は、特にその疎水性のために、非常に小さいナノ粒子、ナノ粒子の生体内分布を変更することができ、近赤外色素によるナノ粒子のラベル付けを必要とする。ラベルされたナノ粒子の検出、および特に非常に小さいナノ粒子(サイズ<10 nm)は、このように全身の規模ではなく、組織および細胞レベルでその生体内分布を妨害する可能性があります。任意のラベルなしでナノ粒子を検出することができ、新しいデバイスの開発は、彼らの行動や反応速度の研究のための新たな可能性を提供しています。さらに、脳内の鉄や銅などの微量元素の役割は、傷病アルツハイマー1、メンケス2,3、またはウィルソン4などのDの神経変性疾患は、組織におけるこれらの要素を研究し、ローカライズするために興味をお勧めします。
様々な技術が、異なる材料の元素マッピング又は微量分析を提供するために使用されてきた。 2006年に公開された彼らのレビュー論文では、R. Lobinski らは、生物学的環境、分析科学5のための最も挑戦的な環境の一つでの微量元素分析のために利用可能な標準的な技術の概要を説明しました。元素濃度が十分であれば、透過型電子顕微鏡におけるエネルギー分散型X線マイクロアナリシスから成り電子マイクロプローブが、多数の研究に適用することができる(> 100〜1,000μgの/ g)であった。検出下限に到達するために、以下の技術が使用されている。
- 用いたイオンビームマイクロ粒子励起X線発光μ-PIXE(1月10日μgの/ g)を6
- SYNchrotron放射微量分析μ-SXRF(0.1〜1μgの/ g)を7
- 二次イオン質量分析法(SIMS 0.1μgの/ g)を8
- (/ gの0.01μgのまで)レーザーアブレーション誘導結合質量分析、LA-ICP-MS 9,10
Lobinski らから抽出された表1に示すように、上記の技術は、マイクロメートル分解能を提供する。
シリアル2D調査の3次元再構成も深部組織11の再構築のために提案することができた。しかし、すべてのデバイスとシステムが両方の高い高価な機器への適度な有資格の専門家、および長期的な実験(μ-SXRF用×100〜100μmでとLA-ICP-MS用のX 10ミリメートル10ミリメートルのため、通常以上の4時間を必要とする)12。要するに、これらの要件は、微量元素分析が非常に制限し、従来の光学イメージングシステムとの互換性が確認蛍光顕微鏡や非線形顕微鏡。ここで言及することができますもう一つのポイントは、定量的な測定能力はまだかなり限られており、マトリックスマッチング実験室の規格の利用可能性に依存することである。さらに、業界プロセスにおける微量元素分析の利用の一般化、地質学、生物学、アプリケーションの他のドメインは、重要な概念や技術革新を生成します。
現在の原稿の目的は、従来の光学顕微鏡と完全な互換性を卓上計測機器との生物学的組織における定量元素マッピング(または微量元素分析)のためのソリューションを提案することである。我々のアプローチは、レーザー誘起ブレークダウン分光法(LIBS技術)に基づいています。 LIBSに、レーザーパルスは、材料の破壊や火花を作成するために、対象サンプルに焦点を当てています。血漿中に放出された原子放射線は、その後、分光計とエレメンによって解析されているTAL濃度は13,14予め行わ較正測定で取得できます。 LIBSの利点は、感度(μgの/ gで、ほぼすべての要素)、コンパクト、非常に基本的なサンプル調製、試料との接触がない場合、瞬時の応答と正確にローカライズされた(マイクロ)表面分析が含まれています。組織のレーザアブレーションは、微細に一緒μgの/ gの範囲15,16内の感度で高空間分解能でマッピングを行うように制御しなければならないので、組織化学的画像化の適用は困難なままである。
このようなソリューションでは、トレーサーまたは標識剤の付加は、生物学的組織におけるそれらのネイティブ環境で直接無機元素を検出することを可能にする、必要とされていません。我々の研究室で開発されたLIBS機器が可能に0.1 mMの16に相当35μgの/ g未満のGdの推定感度が100μmよりも劣っ現在の解像度を提供しています大規模なサンプルのマッピング(> 1 cm 2)を 30分以内。また、自家製のソフトウェアは、データの取得や活用を促進します。この器具は、(Gdの)マップを検出し、およびガドリニウムの組織分布を定量化するために使用される系ナノ粒子17 -小動物から腎臓および腫瘍サンプル18 1〜24時間の粒子の静脈内注射(サイズ<5 nm)の後に。例えば、鉄、カルシウム、ナトリウム、及びPのような本質的に、生体組織に含まれる無機元素は、、、も検出し、画像化されている。
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Protocol
1。生物試料の調製
この研究で説明されているすべての実験はCECCAPP(リヨン、フランス)(承認番号のLYONSUD_2012_004)の動物実験委員会によって承認された、そして実験が許可された個人(L. Sancey、DDPP承認番号の監督の下で実施した38 05 32)。
- 、ガドリニウム(Gd)系ナノ粒子の100マイクロモルに、H 2 Oを1ミリリットルを追加し、15分待ってから、H 2 Oを100μLと80μlに、HEPES 5020μlのmMの、塩化ナトリウム1.325 M、 塩化カルシウム20ミリ追加のGd系ナノ粒子の一次溶液をすぐに注入を40mM(:ヴィルール、実験室での市)で200μlの溶液を得た。
- 静脈麻酔し、腫瘍を有するげっ歯類(:リヨンシュッド(ウラン)、研究室から15キロ市)に200μLのGd系ナノ粒子液を注入する。
- 1月24日時間注射後、マウスを犠牲に液体窒素で冷却したイソペンタンへの生物学的サンプルを入れてDをサンプルで保存 - 80℃(市:リヨンシュッド(ウラン)、研究室から15キロ)。
- サンプルスライス(市:通常グルノーブル、研究室から100キロを、私はリヨンシュッドでのアクセスを持つようにしようとします)厚さ100μmのスライドで、特定のプラスチック皿(シャーレ)に生物学的なスライドを置く。 -80℃で保存
注意:プラスチック皿、基本的には非常に純粋なポリマーサンプルです。これらは、組織に含まれる要素との干渉を回避するために使用される。
キャリブレーションのための2。サンプル調製
- (0 nMで、100nmであり、500nmであり、1μM、5μM、10μM、50、100μM、500μMの、1 mmであり、5 mM)を水の中にGdをベースナノ粒子の投与量の増加に伴って、バイアルを準備します。
- 定期的にペトリ皿に3ミリメートルだけ離れた各溶液5μLドロップを置く。
- 20分間室温で乾燥した。
3。LIBS実験
- LIBSの設定を初期化する
- レーザー設定。楽器を切り替えた後、レーザパルスエネルギーの安定化のために10〜20分待ってから-20℃にICCDカメラの上下冷却アッテネータとパルスエネルギーを調整します。
注:マッピング組織に対する最適なレーザパラメータは、5ナノ秒のパルス持続時間、波長1064nm、及び約4ミリジュールのパルスエネルギーである。レーザー使用する典型的なのNdです:YAGレーザーナノ秒レーザー。 - LIBS設定。小さいクレーター径(約50μm以下)を得るために(試料表面に対する)レーザー焦点位置を設定します。
注意:これは100μmの試料表面下のレーザパルスカリゼーションに対応しています。 - 分光器の設定。 1200本/ mm回折格子と高時間分解能ICCDカメラと組み合わせたツェルニーターナー分光計を使用してください。コンピュータですべてのこれらのデバイスを制御します。 40μmの入射スリット値を設定します。スペクトル範囲の再設定解析対象となる要素をゴルディング。スペクトルを高感度でのGdを検出するために、325から355 nmの範囲をカバーするだけでなく、ナトリウム、CuおよびCAを使用。 300ナノ秒の遅延、2秒のゲート、および200のゲインとICCDのパラメータを設定します。
- レーザー設定。楽器を切り替えた後、レーザパルスエネルギーの安定化のために10〜20分待ってから-20℃にICCDカメラの上下冷却アッテネータとパルスエネルギーを調整します。
- マッピング測定
- LIBS電動試料ホルダーに生物学的サンプルを置きます。
- レーザーの焦点位置に応じて、試料の高さを調整します。
- サンプルスライスの高解像度の写真を撮る。
- 約100μmの解像度を隔て、通常100×100の測定点でマップを実行するために、LIBS取得ソフトウェアのマッピングモジュールを設定します。
- 取得を開始します。この時点からすべてを自動化する。配列ならびにスペクトル記録を移動して保存する。 40分間、10,000点(100μmの解決のために1cm 2の等価)のマッピングのために必要とされる。同じファイルに記録されたすべてのスペクトルを再編成する。
- 場合には、Finished、サンプルスライスの2枚目の写真を撮る
- キャリブレーション測定
同じ実験パラメータを用いて、(、調製の詳細はセクション2を参照)キャリブレーションサンプルを測定する。マップを実行するか、または較正液滴の各々に(ドロップの中央部の測定部位から得られた)25のスペクトルを記録する。
4 LIBSスペクトル解析:化学·イメージの構築
- レコードのすべてのLIBS組織マッピングからのスペクトルとLIBSのソフトウェア解析でそれらをロードします。各スペクトルのベースラインを引き、偽色を使用して、相対強度スケールとの化学的画像を構築する。
注意:このアルゴリズムは、Gdの、銅、ナトリウム、またはCaなどの特定のライン強度を取得します。 - 検量線の計算(強度と濃度との関係)を許可し、水溶液を構築するために校正されたサンプルから測定されたスペクトルに同じ操作を実行uantitativeマップや画像のGd(または関心のある他の要素)。
- このような補間やスムージングなどの化学画像に適切な治療法を適用します。画像フォーマット(ビットマップ)での強度や濃度マップを保存します。
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Representative Results
図1に示すように、Ndをビームが:1064nmの基本波長でのYAGレーザは50ミリメートルの焦点距離の石英レンズにより組織切片上に垂直に集中していた。パルスエネルギーは4ミリジュール及び繰返し率10Hzであった。空気中でプラズマの発生を回避するために、レーザビームが試料の表面下100μmの周りに集中していた。空気プラズマは、この状態で観察されなかった。実験の間、サンプルは、サンプル(単発)上の1つの位置における1つのプラズマを生成するためにステップモータによって移動された。基板上に生成されたクレーターの顕微鏡観察は、50μmよりも低いクレーターの直径を示した。生成されたプラズマは、(300 nmでブレーズ)1mmあたり1200ラインの格子を搭載したツェルニーチューナー分光器へのもう一方の端に接続された光ファイバの入口の上にレンズのカップルが画像化した。 ICCDカメラは、分光器の出力焦点面に搭載されたスペクトルを記録します。測定中に、(レーザ焦点位置に関して)試料表面の高さは、試料表面上の低電力のcwレーザダイオードやCCD監視カメラから斜めに入射ビームを三角法を用いて監視される。 ICCDは、レーザーQスイッチによってトリガされ、400ナノ秒と2秒の遅延とゲート·パラメータにそれぞれ設定した。マッピング中に、サンプルは、各レーザーショット後に100μmのオフセットだけシフトした。 1つのスペクトルは、各レーザーショットのために記録した。 LabVIEW環境で開発された自家製のソフトウェアは装置全体を制御し、特定の方位分解能で組織試料の関心領域を走査するように自動化されたシーケンスを実行させる。
のGdベースのナノ粒子の静脈注射後の腎組織の異なる領域に記録されたシングルショットスペクトルの一例を図2に示す。ナノ粒子として合成した事項仕Mignotのら 17にアイベッド。簡潔には、ナノ粒子はその表面にDOTAGAのGd 3 + -キレートを保持する、ポリシロキサンマトリックスで構成されている。それらがMRI、核イメージング、蛍光イメージングで使用することができるように、別々に、または同時に、(i)のマルチモーダルイメージングのために開発され、および(ii)治療機能放射線増感剤として18( すなわち 、局所的放射線治療の効率を増大)される。使用されるスペクトル範囲(286から320nm)は、Gdを、カルシウム、鉄、SiおよびAl等のさまざまな要素を検出することができる。青色スペクトルが腎臓(髄質)の中央部に計上された、赤のスペクトルは、腎臓膜(カプセル)と周辺領域(皮質)に緑色のスペクトルに対応していた。これは、Gdの、はSi、Al、Ca及びFeの強度は、組織内のこれらの元素濃度の大きな異質性を示唆し、異なる領域で広く可変であることも注目すべきである。基本的にはGdおよびSiはGdをベースに含むたDナノ粒子、Feが生物学的サンプル自体から、Caの血管に特異的であった。
組織切片試料をXおよびY位置に試料を移動させる、スポットによってスポットを分析した。横方向の解像度は、100μmに近かった。一つのスペクトルは、それぞれの位置(シングルショット測定)のために記録した。線強度は、バックグラウンド減算を用いてスペクトルから抽出した。化学画像は、これらの強度から構築した。例は、Gdを、SiとFeのために、図3に示されている。これらの化学画像を構築するために使用される行を表2に示す。分析は、異なる元素の局在化およびマッピングを改善するために実験の前に、生物学的試料の着色撮影に相関した。腎臓では、GdおよびSiの信号が共局在したが、この共局在は、特定の分布を示す、鉄の分布に適合していませんでした。
シミLAR結果は、腫瘍サンプルが得られた。 SQ20B腫瘍組織の測定の一例が図4に示されている。この場合、偽カラースケールで示したGdの化学的マップは、自然光画像に重畳されている。この測定では、定量的な分析は、ローカルのガドリニウム濃度(プロトコルセクションの手順を参照してください)を取得するために行われている。この実験のために、ナノ粒子は、注射後1時間で除去し、分析のためにスライスした腫瘍に直接投与した。 図4に見られるように、周囲に対する腫瘍中心部の注入点からの組織内に拡散粒子。 1時間注射後、腫瘍体積のおよそ半分は、いくつかの粒子を含有した。このようなマッピングは、治療プロトコルに関する情報を提供するように助けることができる。最適な治療有効性のために、ナノ粒子は、腫瘍全体の中に拡散するべきである; 1時間後、専用ha腫瘍のLFは、より長い拡散時間を最適拡散、したがって効果的な治療に必要とされるであろうことを示唆し、一部の粒子を含有した。
表1。主に空間的な化学元素イメージングのための分析技術を解決しました。(Lobinski ら 5)。 この表の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
図1。使用LIBS実験装置の概略図。(もっと-ROS ら 15)。
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図2。腎組織の3種々の領域で得られたLIBSシングルショットスペクトル。これらの領域は、髄質(腎臓の中央部)、赤のカプセルと緑の中の皮質である。スペクトルは、明確にするために垂直にシフトされてきた。
図3マウス腎臓の切片でのGd、SiおよびFeをLIBS元素マッピングテキストで指定された条件に従って製造。化学像のスケール強度を任意の単位で表現される。自然光撮影も、図の左上に表示されます。
表2。マウスの腎臓中のGd、SI、およびFeの検出に使用スペクトル線(原子の線は、I標識し、イオン線がIIラベル付けされています)。
図4。腫瘍組織の切片の内側のGdのLIBSの定量的なマッピング。偽カラースケールは0.1 MM(緑)から20mm(紫)に実行されます。
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Discussion
生物学的サンプルに適用され、この技術は、異なる器官内に注射のGd系ナノ粒子からのGdとSiのマッピングと定量化、 すなわち 、化学イメージングを可能にする。主な重要な設定から、レーザ特性(波長、パルスエネルギー、フォーカス、および安定性)の制御が正確かつ細かい組織切除( すなわちマッピング分解能)のためだけでなく、感度のために重要である。高エネルギーでの作業は良好な感度を提供しますが、残念ながら劣化した空間分解能を生成します。また、使用される分光器の種類を慎重にチェックする必要があります。基本的には、(例えばエシェル分光計を用いて)ブロードバンド調査は元素種の大規模な選択をできるようになりますが、低感度で、(ICCDまたはPMTを装備)ツェルニーターナー分光計を使用しながら、少ない要素を検出することができますが、はるかにより感度。プローブされた波長範囲の選択したすべての設定は、Pに調整する必要があります調査のurpose。
生物学的サンプル自体については、その厚さや硬度も、スペクトルの質を妨害する可能性があります。非常に薄い試料が完全に噴霧することになると厚すぎるサンプルが吹き付け量の中で均質に響きされるよう、その中に均質憲法のに苦しむかもしれないのに対し、試料支持は、レーザーショットでも攻撃されるだろう物質(大型船などの存在)。元素研究から、支持体の選択は、予想されるかもしれません。例えば、調査さ要素がSiである場合には、サンプルが純粋なプラスチックに提出されなければならないが、それは、Siを多量に含んでいるようにガラスは避けるべきである。同様に、サンプルは、研究要素のレベルを汚染する固定剤の任意のコンポーネントを防ぐために、特定の条件で調製し、修正される可能性があります。
この手法は、前臨床サンプルの解析に非常に有用である可能性があります。 LIBSカップldの脳サンプル中に、特に、例えば、Fe、Cuなどの金属元素の異常の検出を可能にする。鉄との、特に制限はヘモグロビン中のFeの含有量が高いである必要があります。サンプルでは、慎重に準備し、キャリブレーション分析の評価は必須である。生物学や医学に適用されるバイオテクノロジーの分野では、LIBSはなどはAu(GD)、銅(Cu)、などの特定の要素が含まれている任意の化合物または粒子の検出を可能にすることができ
ベンチトップ計測器は、微量金属元素の相補的観察のためのツールとしての生物学および医学その大きな潜在的な使用を示している標準的な光学顕微鏡と完全な互換性があります。 (mg / kgの範囲で)低い検出限界を有する高横分解能(<50ミクロン)を組み合わせる元素イメージングのこのタイプは、一般に、放射光微量分析(SXRF)又は誘導結合レーザアブレーションのように、必要な機器の高レベルを伴う質量分光metry(LA-ICP-MS)、それは非常に限定的であり、市販の顕微鏡イメージング·システムとの互換性がなくなり。 LIBS計測器は(100と200 K€間の価格)が必要分解能と感度に依存、非常に高価ではありません。現在、1cm 2のサンプルでは、30〜40分以内に分析することができた。この取得時間は、蛍光検出し、試料の色の画像化など、他の顕微鏡技術を加えた後に変更されない可能性があります。現在100μmの空間分解能は、既に生体組織のマッピングのための有効性を示す。しかしながら、この分解能は大きくアブレーションレーザパルスを集束させる光学顕微鏡の代わりに、単純なレンズを使用することによって改善することができる。少ない材料がアブレーションされるように、マイクロメートル分解能は、理論的には、感度がドロップされていても、到達することができる。 10μmの分解能を増加させると、ナノ粒子の正確な局在化は、細胞レベルで観察されることを可能にする。
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Disclosures
著者らは、開示することは何もありません。
Acknowledgments
作者は感謝してLabex-Imustによって財政支援を認める。
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Laser nanosecond Nd:YAG | Quantel | Brillant | 5 nsec pulse width, wavelength 1,064 nm |
Spectrometer | Andor Technology | Shamrock 303 | with 1,200 lines/mm blazed at 300 nm grating |
Detector ICCD | Andor Technology | Istar | 2 nsec temporal resolution |
LIBS Unit | ILM | Homemade Instrumentation | |
Gd-based nanoparticles | Nano-H | particles | |
HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | for particle's dilution |
CaCl2 | Sigma-Aldrich | 21108 | for particle's dilution |
NaCl | Sigma-Aldrich | S5886 | for particle's dilution |
Mice | Charles River | depending of animal breeding | |
Isoflurane | Coveto / Virbac | for anaesthesia - Isofluranum | |
Isopentane | Sigma-Aldrich | 59060 | to froze the sample slowly |
Liquid nitrogen | Air Liquide | to cool down the isopentane | |
Cryostat | Leica | CM-3050S | to slide the samples |
Petri dishes | Dutscher | 353004 | to stick the sample |
References
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