Summary
Laser-indusert sammenbrudd spektroskopi utført på tynt orgel og svulstvev hell oppdaget naturlige elementer og kunstig injisert gadolinium (Gd), utstedt fra Gd-baserte nanopartikler. Bilder av kjemiske elementer nådde en oppløsning på 100 mikrometer og kvantitativ under mM følsomhet. Kompatibiliteten til oppsett med standard optisk mikrosstreker dens potensial til å gi flere bilder av en samme biologiske vev.
Abstract
Utslippsspektroskopi av laser-indusert plasma ble påført på elementær analyse av biologiske prøver. Laser-indusert nedbrytning spektroskopi (LIBS) utført på tynne snitt av gnager vev: nyrer og tumor, tillater påvisning av uorganiske elementer som (i) Na, Ca, Cu, Mg, P, og Fe, naturlig tilstede i kroppen, og (ii) Si og Gd, detekteres etter injeksjon av gadolinium baserte nanopartikler. Dyrene ble avlivet 1 til 24 timer etter intravenøs injeksjon av partikler. En to-dimensjonal skanning av prøven, utført ved hjelp av en motorisert micrometric 3D-scenen, tillates den infrarøde laserstrålen utforsking av overflaten med en lateral oppløsning mindre enn 100 μ m. Kvantitative kjemiske bilder av Gd element inne i orgelet ble oppnådd med sub-MM følsomhet. LIBS gir en enkel og robust fremgangsmåte for å undersøke fordelingen av uorganiske materialer uten noen spesifikk labeling. Videre kompatibiliteten til oppsett med standard optisk mikrosstreker dens potensial til å gi flere bilder av den samme biologiske vev med ulike typer respons: elementære, molekylære, eller mobilnettet.
Introduction
Den brede utviklingen av nanopartikler for biologiske anvendelser oppfordret parallell forbedring av analytiske teknikker for deres kvantifisering og bildebehandling i biologiske prøver. Vanligvis påvisning og kartlegging av nanopartikler i organer er laget av fluorescens eller konfokalmikroskopi. Dessverre er disse metoder krever merking av nanopartikler av en nær infrarød fargestoff som kan modifisere den biologiske fordeling av nanopartikler, særlig for meget små nanopartikler som følge av sin hydrofobe egenskaper. Påvisning av merket nanopartikler, og særlig meget små nanopartikler (størrelse <10 nm), kan således forstyrre deres biodistribusjonen i hele kroppen skala, men også på vevs-og cellenivåene. Utviklingen av nye enheter i stand til å detektere nanopartikler uten noen merking gir nye muligheter for å studere deres oppførsel og kinetikk. Videre rollen av sporstoffer som jern og kobber i hjernen sykdommer end neurodegenerative sykdommer så som Alzheimer 1, Menkes 2,3 eller Wilson 4 antyder interesse for å studere og lokalisere disse elementene i vev.
Ulike teknikker har blitt brukt til å gi elementær kartlegging eller mikroanalyse av ulike materialer. I sin gjennomgang artikkel publisert i 2006, R. Lobinski et al. Gitt en oversikt over tilgjengelige standardteknikker for elementær mikroanalyse i biologiske miljøet, en av de mest utfordrende miljøer for analytiske vitenskaper fem. Den elektronmikrosonde, som består av energi dispersiv røntgenmikroanalyse i et transmisjonselektronmikroskop, kan anvendes på en rekke studier hvis elementkonsentrasjonen er tilstrekkelig (> de samtidig inntar 100-1000 ug / g). For å oppnå lavere deteksjonsgrenser, har de følgende teknikker vært benyttet:
- ionestråle ved hjelp av mikrosonde partikkel indusert røntgen utslipp μ-Pixe (1-10 pg / g) 6
- synchrotron stråling mikroanalyse μ-SXRF (0,1-1 mg / g) 7
- secondary ion mass spectrometry SIMS (0,1 ug / g) 8
- laserablasjon induktivt koblet massespektrometri LA-ICP-MS (ned til 0,01 ug / g) 9,10
De ovennevnte teknikker gir micrometric oppløsningen som vist i tabell 1. ekstrahert fra Lobinski et al.
3D rekonstruksjon av serie 2D undersøkelser kan også bli foreslått for gjenoppbyggingen av dypere vev 11. Men alle enheter og systemer krever både kvalifiserte fagfolk, moderat til svært kostbart utstyr og langvarige eksperimenter (vanligvis mer enn 4 timers for en 100 mikrometer x 100 mikrometer for μ-SXRF og 10 mm x 10 mm for LA-ICP-MS ) 12. Til sammen er disse kravene gjør elemental mikroanalyse svært begrensende og uforenlig med konvensjonelle optiske bildesystemer,fluorescens mikroskopi eller ikke-lineær mikroskopi. Et annet punkt som vi kan nevne her er at kvantitativ måleevne er fortsatt ganske begrenset og er avhengig av tilgjengeligheten av matrix-matchet laboratoriestandarder. Den videre generalisering av bruk av elementær mikroanalyse i industriprosesser, geologi, biologi og andre domener av søknader vil generere betydelige konseptuelle og teknologiske gjennombrudd.
Hensikten med den foreliggende manuskriptet er å foreslå løsninger for kvantitativ elementært kartlegging (eller elementær mikroanalyse) i biologiske vev med en bordplate instrumentering fullstendig kompatibel med konvensjonelle optiske mikroskopi. Vår tilnærming er basert på laser-indusert sammenbrudd spektroskopi (LIBS teknologi). I LIBS, en laserpuls fokusert på prøven av interesse å skape nedbryting og tenn av materialet. Atom strålingen som sendes ut i plasma blir deretter analysert ved hjelp av et spektrometer, og de elemental konsentrasjoner kan hentes med målinger kalibrering utført på forhånd 13,14. Fordelene med LIBS omfatter følsomhet (ug / g for nesten alle de elementer), kompakthet, meget enkel prøvepreparering, fraværet av kontakt med prøven, øyeblikkelig reaksjon og presist lokalisert (mikro) overflate analyse. Imidlertid fortsatt anvendelse av vev kjemisk avbildning utfordrende siden laseren ablasjon av vevet må være fint styrt for å utføre kart med høy romlig oppløsning sammen med følsomhet i ug / g område 15,16.
Med en slik løsning, er det adjunction av sporstoff eller merking agenter ikke nødvendig, som kan oppdage uorganiske elementer direkte i sitt opprinnelige miljø i biologiske vev. Den LIBS instrument utviklet i vårt laboratorium har en aktuell oppløsning dårligere enn 100 pm med en beregnet følsomhet for Gd under 35 ug / g, tilsvarende 0,1 mM 16, som gjør det muligkartlegging av store prøver (> 1 cm 2) i løpet av 30 min. I tillegg forenkler hjemmelaget programvare anskaffelse og utnyttelse av dataene. Dette instrument blir brukt til å detektere, kart og kvantifisere vevsdistribusjon av gadolinium (Gd) baserte nanopartikler 17-18 i nyrene og tumorprøver fra små dyr, 1 til 24 timer etter intravenøs injeksjon av partikler (størrelse <5 nm) . Uorganiske elementer, som er egentlig inneholdt i et biologisk vev, slik som Fe, Ca, Na, og P, er også blitt detektert og fotografert.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
En. Biologisk Prøvepreparering
Alle forsøkene som er beskrevet i denne studien ble godkjent av Animal Care og bruk komité ved CECCAPP (Lyon, Frankrike) (autorisasjon # LYONSUD_2012_004), og forsøkene ble utført under oppsyn av autoriserte personer (L. Sancey, DDPP autorisasjon # 38 05 32).
- Legg en ml av H 2 O til 100 mikromol gadolinium (Gd)-baserte nanopartikler, vente 15 min, og legg 20 mL av HEPES 50 mm, NaCl 1.325 M, CaCl 2 20 mm til 100 mL av H 2 O og 80 mL av den primære løsning av Gd-baserte nanopartikler for å få en 200 mL løsning på 40 mm klare til injisere (By: Villeurbanne, på lab).
- Injisere 200 mL Gd-baserte nanopartikler løsning intravenøst inn bedøvet tumorbærende gnagere (City: Lyon Sud (Oullins), 15 km fra laboratoriet).
- 1-24 timer etter injeksjon, ofre musene end sette de biologiske prøvene i isopentan kjølt med flytende nitrogen. Oppbevar prøvene ved - 80 ° C (By: Lyon Sud (Oullins), 15 km fra laboratoriet).
- Skjær prøven (By: vanligvis Grenoble, 100 km fra laboratoriet, jeg vil prøve å ha en tilgang i Lyon Sud) i 100 mikrometer tykke lysbilder og sette de biologiske lysbilder på bestemte plast retter (petriskål). Oppbevares ved -80 ° C.
Merk: Plasttallerkener er i utgangspunktet en veldig ren polymer prøven. De brukes for å unngå interferens med elementer som finnes i vevet.
2. Prøvepreparering for kalibrering
- Forbered ampuller med økende doser av Gd-baserte nanopartikler i vann (0 nM, 100 nM, 500 nM, 1 mM, 5 uM, 10 uM, 50 uM, 100 uM, 500 uM, 1 mM, og 5 mM).
- Sett en 5 pl-dråpe av hver løsning med jevne mellomrom ved 3 mm på petriskålen.
- Tørt ved romtemperatur i 20 min.
Tre. LIBS Experiment
- Initialisere LIBS Setup
- Laser Innstillinger. Etter innkobling instrumentene, vente 10-20 min for laserpuls energi stabilisering og nedkjøling av ICCD kameraet til -20 ° C. Juster pulsenergi med attenuatoren.
Merk: Den optimale laser parametere for kartlegging vev er 5 nsec pulsvarighet, 1064 nm bølgelengde, og puls energi på ca 4 mJ. Laseren bruker er en typisk Nd: YAG laser nanosekund. - Libs Innstillinger. Sett laseren å fokusere stilling (i forhold til prøvens overflate) for å oppnå den mindre diameter krater (ca. 50 mikrometer eller mindre).
Merk: Dette svarer til en laserpuls focalization 100 mikrometer under sampleoverflaten. - Spektrometer Innstillinger. Bruk Czerny-Turner spektrometer kombinert med en 1200 linjer / mm rist og en høy tidsmessig oppløsning ICCD kamera. Kontrollere alle disse enhetene ved datamaskinen. Sett inngangs slit verdien til 40 mikrometer. Sett spektralområdet reGarding det element som skal analyseres. Bruk det spektrale området som dekker 325-355 nm for å påvise Gd med høy følsomhet, samt Na, Cu og Ca. Still ICCD parametrene med en forsinkelse på 300 nanosekunder, en gate av to usekunder, og en gevinst på 200.
- Laser Innstillinger. Etter innkobling instrumentene, vente 10-20 min for laserpuls energi stabilisering og nedkjøling av ICCD kameraet til -20 ° C. Juster pulsenergi med attenuatoren.
- Kartlegging måling
- Plasser den biologiske prøven på LIBS motorisert prøveholderen.
- Juster høyde av prøven i henhold til laserfokus stilling.
- Ta et høyoppløselig bilde av prøven skive.
- Sett kartlegging modul av LIBS anskaffelses programvare for å utføre et kart med typisk 100 x 100 målepunkter i avstand fra en oppløsning på omtrent 100 mikrometer.
- Start oppkjøpet. Fra dette punktet automatisere alt; det glidende sekvens samt spekteret opptak og lagring. 40 minutter er nødvendig for en kartlegging av 10 000 punkter (ekvivalent med 1 cm 2 for 100 mikrometer oppløsning). Omgruppere all den innspilte spektra inn en samme fil.
- Når finished, ta en andre fotografi av prøven skive
- Kalibrering Måling
Med de samme eksperimentelle parametre, måle kalibreringsprøvene (for forberedelse detaljer, se pkt. 2). Utfør et kart eller plate 25 spektra (oppnådd fra målepunktene i den midtre delen av dråpen) i hver av dråpene kalibrerings.
4 LIBS Spectrum Analysis:. Konstruere av kjemiske Images
- Record alle LIBS spektra fra vevet kartlegging og laste dem i LIBS programvare analyse. Trekk fra baseline for hvert spektrum og konstruere de kjemiske bilder med relativ intensitet skala ved hjelp av en falsk farge.
Merk: En algoritme henter bestemte linjeintensitetene, som for eksempel Gd, Cu, Na-eller Ca. - Utføre den samme operasjon med spektra målt fra den kalibrerte prøven for å tillate at kalibreringskurvene beregning (forholdet mellom intensitet og konsentrasjon) og bygge aquantitative kartet eller bildet for Gd (eller et annet element av interesse).
- Påfør tilstrekkelig behandlinger til de kjemiske bilder, for eksempel interpole eller glatting. Redd intensitet eller konsentrasjons kart i bildeformat (bitmap).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Som vist i figur 1, er strålen av en Nd: YAG laser i den fundamentale bølgelengde på 1064 nm var fokusert vertikalt ned på vevet stykke av en kvartslinse på 50 mm brennvidde. Den pulsenergi var 4 mJ og repetisjonsfrekvensen 10 Hz. For å unngå generering av plasma i luft, ble laserstrålen fokusert rundt 100 mikrometer under overflaten av prøven. Ingen luft plasma ble observert i denne tilstanden. Under eksperimentene ble prøven beveges av en trinnmotor for å generere en plasma i én posisjon på prøven (single shot). En mikroskopisk observasjon av de kratere som genereres på substratet viste et krater diameter mindre enn 50 mikrometer. Den genererte plasma ble fotografert ved et par linse på inngangen av en optisk fiber forbundet ved den andre enden til en Czerny-tuner spektrograf utstyrt med et gitter av 1200 linjer pr mm (blazed ved 300 nm). En ICCD kamera ble montert på utgangen fokusplanet av spektrografå registrere spekteret. I løpet av målingene, blir høyden på prøveoverflaten (med hensyn til laserfokus stilling) overvåkes ved hjelp av trigonometriske metode med en skrått hendelse strålen fra en laveffekts cw laserdioden på prøvens overflate, og et CCD-kamera monitor. Den ICCD ble utløst av laser Q-bryteren og 400 nanosekunder og to usekunder ble satt henholdsvis for forsinkelsen og portparametere. Under en kartlegging ble prøven forskjøvet med en forskyvning på 100 pm etter hver laserskudd. En spektrum ble registrert for hver laser skudd. Hjemmelaget programvare utviklet i LabVIEW miljøet kontrollerte hele utstyr og lov til å utføre automatiserte sekvens for å skanne området av interesse for vevsprøve med spesifikke lateral oppløsning.
Eksempel på enkeltskudd spektra, tatt opp på forskjellige regioner av et nyrevevet etter IV injeksjon av Gd-baserte nanopartikler er vist i figur 2.. Nanopartiklene ble syntetisert som beskrevet i det nedenIbed i Mignot et al 17. I korthet blir nanopartikler sammensatt av et polysiloksan matrise, holder DOTAGA-Gd 3 + chelater på deres overflate. De er utviklet for (i) multi-modal avbildning som de kan anvendes i MR, nukleær avbildning og fluorescens-avbildning, hver for seg eller samtidig, og (ii) terapeutisk funksjon som radiosensitizer (dvs. øker lokalt effektiviteten av radioterapi) 18. Den spektrale området som benyttes (286-320 nm) tillater å detektere forskjellige elementer som Gd, Ca, Fe, Si og Al. Den blå spekteret ble registrert i den sentrale regionen av nyrene (medulla), den røde spektrum samsvarer med nyremembran (kapsel) og den grønne spekteret til det perifere område (cortex). Det er også verdt å merke seg at GD, Si, Al, Ca, og Fe intensiteter er allment variabel på ulike regioner, noe som tyder på en stor heterogenitet av disse elementene konsentrasjonene i vevet. I utgangspunktet Gd og Si ble inneholder i Gd-basend nanopartikler, Fe var spesifikk for blodkar, Ca fra den biologiske prøven i seg selv.
De vev-skive Prøvene ble analysert sted ved stedet, å bevege prøven i X-og Y-stilling. Lateral oppløsning var nær 100 mikrometer. Ett enkelt spektrum ble registrert for hver stilling (single shot måling). Linje intensiteter ble ekstrahert fra spektrene ved å bruke en bakgrunn subtraksjon. De kjemiske bilder ble deretter konstruert fra disse intensiteter. Et eksempel er vist i Figur 3 for Gd, Si og Fe. Linjer som brukes til å bygge disse kjemiske bilder er vist i tabell 2.. Analysen er korrelert til den fargede fotografi av den biologiske prøven før forsøket for å forbedre lokalisering og kartlegging av de ulike elementene. I nyrene, GD og Si-signaler ble co-lokalisert, men denne co-lokalisering ikke passer med fordelingen av Fe, som indikerer en bestemt fordeling.
SimiTilsvarende resultater ble oppnådd med tumorprøver. Et eksempel på måling av SQ20B tumorvev er vist i figur 4.. I dette tilfellet er den kjemiske kart over Gd, vist med en falsk fargeskala, er blitt overlagret på det naturlige lys bilde. For denne måling, er kvantitativ analyse utført for å hente den lokale konsentrasjon gadolinium (se fremgangsmåten i protokoll avsnitt). For dette forsøket ble de nanopartikler administrert direkte inn i tumoren, noe som ble fjernet 1 time etter injeksjon og skiver for analysen. Som vist i figur 4, partiklene diffust i vevet fra injeksjonspunktet i tumoren sentrum til periferien. 1 time etter injeksjonen, omtrent halvparten av tumorvolum inneholdt noen partikler. En slik kartlegging kan bidra til å gi informasjon om den terapeutiske protokollen. For en optimal effekt av behandlingen, bør nanopartikler diffunderer i hele tumor; etter 1 time, bare half av svulsten inneholdt noen partikler, noe som tyder på at en lengre diffusjon tid som ville være nødvendig for en optimal spredning og dermed effektiv behandling.
Tabell 1. Hoved romlig løst analytiske teknikker for kjemisk elementær bildebehandling. (Lobinski et al. 5). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne tabellen.
Figur 1. Skjematisk fremstilling av brukt LIBS eksperimentelle oppsettet. (Motto-Ros et al. 15).
: Keep-together.within-page = "always"> 
Figur 2. LIBS single-shot spektra erholdt i tre forskjellige deler av nyrevevet. Disse regionene er medulla (midtre del av nyre), kapselen i rødt og cortex i grønt. Spectra har blitt forskjøvet vertikalt for klarhet.
Figur 3. LIBS elemental kartlegging av Gd, Si, og Fe i en bit av mus nyre utarbeidet i henhold til de vilkår som er angitt i teksten. Skalaen intensiteten av kjemiske bilder er uttrykt i en vilkårlig enhet. En naturlig lys fotografering er også vist i øvre venstre i figuren.
Tabell 2. Spektrallinjer som benyttes for påvisning av Gd, Si og Fe i en musenyre (atom-linjer er betegnet med I og ioniske linjer er merket II).
Figur 4 LIBS kvantitativ kartlegging av Gd innsiden av en bit av svulstvevet.. Den falske fargeskalaen går fra 0,1 mm (grønn) til 20 mm (fiolett).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Anvendt til biologisk prøve, kan denne teknikken kjemisk bildebehandling, dvs. kartlegging og kvantifisering, Gd og Si fra injisert Gd-baserte nanopartikler i forskjellige organer. Fra de viktigste kritiske innstillinger, er kontroll av laser egenskaper (bølgelengde, pulsenergi, fokus, og stabilitets) kritisk for en nøyaktig og fin vev ablasjon (dvs. mapping oppløsning), så vel som for sensitivitet. Jobber på høy energi gir en bedre følsomhet, men dessverre genererer degradert romlig oppløsning. Dessuten må den type spektrometer brukes kontrolleres nøye. I utgangspunktet vil en bredbånds undersøkelse (ved hjelp av eksempelvis en echelle spektrometer) muliggjør et stort utvalg av elementær art, men med lav følsomhet, vil det ved bruk av et Turner Czerny-spektrometer (utstyrt med en ICCD eller en PMT) tillate detektering færre elementer, men med mye mer følsomhet. Alle de valgte innstillinger av probet bølgelengdeområdet må justeres til p.urpose av etterforskningen.
Når det gjelder den biologiske prøven i seg selv, kan dens tykkelse og hardhet også forstyrre kvaliteten av spekteret. En meget tynn prøve ville være helt sprayet og prøven støtte ville bli angrepet også av laserskudd, mens en for tykk prøve kan lide av sin in-homogenitet av sin konstitusjon som vil bli gjenklang på in-homogenitet av mengden av sprøytet stoff (tilstedeværelsen av store beholdere osv.). Fra elementær studien, kan valget av bæreren kan forventes; For eksempel, hvis det undersøkte element er Si, prøven skal arkiveres på ren plast, men glasset bør unngås da den inneholder store mengder av Si. Tilsvarende, kan prøven bli fremstilt og fiksert i spesifikke forhold for å hindre en hvilken som helst komponent av fikseringsmiddel for å forurense nivået av den undersøkte element.
Denne teknikken kan være meget nyttig for analyse av pre-kliniske prøver. LIBS could tillate påvisning av unormale metalliske elementer slik som Fe og Cu, spesielt i hjerneprøvene. En bestemt begrensning med Fe bør være det høye innholdet av Fe i hemoglobin; prøven forberedt nøye og vurderingen av en kalibrering analysen er obligatorisk. I feltet for bioteknologi anvendt til biologi eller medisin, kan LIBS tillate påvisning av en hvilken som helst forbindelse eller partikkel som inneholder et spesifikt element slik som Au, Gd, Cu, etc.
Benken-top instrumentering er fullt kompatibel med standard optisk mikroskopi, som viser sin store potensial bruk i biologi og medisin som et verktøy for utfyllende observasjon av spor metalliske elementer. Denne type elementær avbildning, som kombinerer høy lateral oppløsning (<50 mikrometer) med lav deteksjonsgrenser (i størrelsesorden mg / kg), innebærer generelt høyt nivå av ønsket utstyr, slik som synkrotron-stråling mikroanalyse (SXRF) eller laserablasjon induktivt koblet masse spectrometry (LA-ICP-MS), noe som gjør det svært restriktiv og uforenlig med kommersielt tilgjengelige mikroskopiske bildesystemer. Den LIBS instrumentering er ikke veldig dyrt, avhengig av oppløsning og følsomhet som kreves (pris mellom 100 og 200 k €). I dag en 1 cm 2 prøven kan bli analysert i løpet av 30-40 min; kjøpet tid kan ikke endres etter at tilsetningen av andre mikroskopiske teknikker som fluorescensdeteksjon og farget avbildning av prøven. Den nåværende 100 mikrometer romlig oppløsning viser allerede effekten for kartlegging av biologisk vev. Imidlertid kan denne oppløsning bli sterkt forbedret ved hjelp av et optisk mikroskop i stedet for en enkel linse for å fokusere den ablasjon laserpulsen. Micrometer oppløsning kan teoretisk bli oppnådd, selv om følsomheten vil synke, ettersom mindre materiale skal ablateres. Øker oppløsningen til 10 mikrometer ville tillate en nøyaktig lokalisering av nanopartikler å bli observert på cellenivå.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Forfatterne ønsker å takke for økonomisk støtte av LABEX-Imust.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Laser nanosecond Nd:YAG | Quantel | Brillant | 5 nsec pulse width, wavelength 1,064 nm |
| Spectrometer | Andor Technology | Shamrock 303 | with 1,200 lines/mm blazed at 300 nm grating |
| Detector ICCD | Andor Technology | Istar | 2 nsec temporal resolution |
| LIBS Unit | ILM | Homemade Instrumentation | |
| Gd-based nanoparticles | Nano-H | particles | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | for particle's dilution |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | 21108 | for particle's dilution |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S5886 | for particle's dilution |
| Mice | Charles River | depending of animal breeding | |
| Isoflurane | Coveto / Virbac | for anaesthesia - Isofluranum | |
| Isopentane | Sigma-Aldrich | 59060 | to froze the sample slowly |
| Liquid nitrogen | Air Liquide | to cool down the isopentane | |
| Cryostat | Leica | CM-3050S | to slide the samples |
| Petri dishes | Dutscher | 353004 | to stick the sample |
References
- Smith, M. A., Harris, P. L., Sayre, L. M., Perry, G. Iron accumulation in Alzheimer disease is a source of redox-generated free radicals. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94, 9866-9868 (1997).
- Wang, Y., Zhu, S., Weisman, G. A., Gitlin, J. D., Petris, M. J. Conditional knockout of the Menkes disease copper transporter demonstrates its critical role in embryogenesis. PloS one. 7, (2012).
- Reske-Nielson, E., Lou, H. O., Andersen, P., Vagn-Hansen, P. Brain-copper concentration in Menkes' disease. Lancet. 1, 613 (1973).
- Hayashi, H., et al. Various copper and iron overload patterns in the livers of patients with Wilson disease and idiopathic copper toxicosis. Medical molecular morphology. 46, (2013).
- Lobinski, R., Moulin, C., Ortega, R. Imaging and speciation of trace elements in biological environment. Biochimie. 88, 1591-1604 (2006).
- Devès, G., Bouhacina, T., Ortega, R. STIM mass measurements for quantitative trace element analysis within biological samples and validation using AFM thickness measurements. Spectrochimica Acta B. 59, 1733-1738 (2004).
- Twining, B. S., et al. Quantifying trace elements in individual aquatic protist cells with a synchrotron X-ray fluorescence microprobe. Analytical chemistry. 75, 3806-3816 (2003).
- Guerquin-Kern, J. L., Wu, T. D., Quintana, C., Croisy, A. Progress in analytical imaging of the cell by dynamic secondary ion mass spectrometry (SIMS microscopy). Biochimica et biophysica acta. 1724, 228-238 (2005).
- Binet, M. R., Ma, R., McLeod, C. W., Poole, R. K. Detection and characterization of zinc- and cadmium-binding proteins in Escherichia coli by gel electrophoresis and laser ablation-inductively coupled plasma-mass spectrometry. Analytical biochemistry. 318, 30-38 (2003).
- Becker, J., Gorbunoff, A., Zoriy, M., Izmer, A., Kayser, M. Evidence of near-field laser ablation inductively coupled plasma mass spectrometry (NF-LA-ICP-MS) at nanometre scale for elemental and isotopic analysis on gels and biological samples. J. Anal. Atom. Spectrom. 21, 19-25 (2006).
- Seeley, E. H., Caprioli, R. M. 3D imaging by mass spectrometry: a new frontier. Analytical chemistry. 84, 2105-2110 (2012).
- Pornwilard, M. -M., Weiskirchen, R., Gassler, N., Bosserhoff, A. K., Becker, J. S. Novel bioimaging techniques of metals by laser ablation inductively coupled plasma mass spectrometry for diagnosis of fibrotic and cirrhotic liver disorders. PloS one. 8, (2013).
- Cremers, D. A., Radziemski, L. J. Handbook of laser-induced breakdown spectroscopy. , Wiley. (2006).
- Miziolek, A. W., Palleschi, V. Laser-Induced Breakdown Spectroscopy: Fundamentals and Applications. , (2006).
- Motto-Ros, V., et al. Mapping nanoparticles injected into a biological tissue using laser-induced breakdown spectroscopy. Spectrochimica Acta Part B. , (2013).
- Motto-Ros, V., et al. Mapping of native inorganic elements and injected nanoparticles in a biological organ with laser-induced plasma. Applied Physics Letters. 101, (2012).
- Mignot, A., et al. A top-down synthesis route to ultrasmall multifunctional Gd-based silica nanoparticles for theranostic applications. Chemistry. 19, 6122-6136 (2013).
- Lux, F., et al. Ultrasmall rigid particles as multimodal probes for medical applications. Angew Chem Int Ed Engl. 50, 12299-12303 (2011).
