Summary
Desglose espectroscopia inducida por láser se realiza en órgano fino y tejido del tumor con éxito detectado elementos naturales y gadolinio inyectado artificialmente (Gd), emitidas a partir de nanopartículas a base de D-os. Imágenes de los elementos químicos alcanzaron una resolución de 100 micras y la sensibilidad cuantitativa sub-mM. La compatibilidad de la instalación con el microscopio óptico estándar enfatiza su potencial para proporcionar múltiples imágenes de un mismo tejido biológico.
Abstract
Espectroscopía de emisión de plasma inducida por láser se aplicó a análisis elemental de las muestras biológicas. Espectroscopía de descomposición inducida por láser (LIBS) realizado en secciones finas de tejidos de roedores: riñones y el tumor, permite la detección de elementos inorgánicos tales como (i) Na, Ca, Cu, Mg, P, y Fe, presente de forma natural en el cuerpo y (ii) Si y Di-s, detectados después de la inyección de nanopartículas a base de gadolinio. Los animales fueron sacrificados 1 a 24 horas después de la inyección intravenosa de partículas. Una exploración bidimensional de la muestra, lleva a cabo utilizando una micrométrico-etapa 3D motorizado, permite el haz de láser infrarrojo explorar la superficie con una resolución lateral de menos de 100 μ m. Imágenes químico cuantitativo de elemento de Di-s en el interior del órgano se obtuvieron con sensibilidad sub-mM. LIBS ofrece un método simple y robusto para estudiar la distribución de materiales inorgánicos sin ningún labeli específicang. Por otra parte, la compatibilidad de la instalación con el microscopio óptico estándar enfatiza su potencial para proporcionar múltiples imágenes del mismo tejido biológico con diferentes tipos de respuesta: elemental, moleculares o celulares.
Introduction
El amplio desarrollo de las nanopartículas para aplicaciones biológicas instó a la mejora paralela de técnicas analíticas para su cuantificación y de formación de imágenes en muestras biológicas. Por lo general, la detección y el mapeo de las nanopartículas en los órganos son hechas por fluorescencia o microscopía confocal. Desafortunadamente estos métodos requieren el etiquetado de las nanopartículas por un colorante de infrarrojo cercano que puede modificar la biodistribución de las nanopartículas, especialmente para nanopartículas muy pequeñas debido a sus propiedades hidrófobas. La detección de nanopartículas marcadas, y en especial las nanopartículas muy pequeñas (de tamaño <10 nm), por lo tanto podría interferir con su biodistribución en toda la escala del cuerpo, sino también en los tejidos y de células niveles. El desarrollo de nuevos dispositivos capaces de detectar las nanopartículas sin ningún etiquetado ofrece nuevas posibilidades para el estudio de su comportamiento y la cinética. Por otra parte, el papel de los elementos traza tales como hierro y cobre en el cerebro enfermedades Und enfermedades neurodegenerativas tales como la enfermedad de Alzheimer 1, de Menkes 2,3, o Wilson 4 sugieren el interés para estudiar y localizar estos elementos en los tejidos.
Diversas técnicas se han utilizado para proporcionar el mapeo elemental o microanálisis de diferentes materiales. En su artículo de revisión publicado en 2006, R. lobinski et al. Proporcionan una visión general de las técnicas estándar disponibles para microanálisis elemental en el entorno biológico, uno de los entornos más difíciles para las ciencias analíticas 5. La microsonda de electrones, que se compone de energía dispersiva de microanálisis de rayos X en un microscopio electrónico de transmisión, se puede aplicar a numerosos estudios si la concentración elemento es suficiente (> 100-1.000 mg / g). Para llegar a los límites de detección más bajos, se han utilizado las siguientes técnicas:
- microsonda haz de iones usando partículas inducida por rayos X de emisión μ-PIXE (1-10 mg / g) 6
- synchrotron microanálisis radiación μ-SXRF (0,1-1 mg / g) 7
- espectrometría de masas de iones secundarios SIMS (0,1 mg / g) 8
- la ablación con láser acoplado inductivamente espectrometría de masas LA-ICP-MS (hasta 0,01 mg / g) 9,10
Las técnicas mencionadas anteriormente-proporcionan una resolución micrométrica como se muestra en la Tabla 1 extraído de lobinski et al.
Reconstrucción 3D de las investigaciones en 2D de serie también se podría proponer para la reconstrucción de los tejidos más profundos 11. Sin embargo, todos los dispositivos y sistemas requieren tanto de los profesionales cualificados, moderados a equipos muy caros y los experimentos de larga duración (por lo general más de 4 h para una 100 m x 100 m para μ-SXRF y 10 mm x 10 mm de LA-ICP-MS ) 12. En conjunto, estos requisitos hacen microanálisis elemental muy restrictivo e incompatible con los sistemas de imagen óptica convencionales,microscopía de fluorescencia o microscopía no lineal. Otro punto que se puede mencionar es que la capacidad de medición cuantitativa es aún bastante limitado y depende de la disponibilidad de las normas de laboratorio con ajuste matricial. La mayor generalización del uso de microanálisis elemental en procesos de la industria, la geología, la biología y otras áreas de aplicaciones generará avances conceptuales y tecnológicos significativos.
El propósito de la presente manuscrito es proponer soluciones para el mapeo elemental cuantitativo (o microanálisis elemental) en los tejidos biológicos con una instrumentación mesa totalmente compatible con la microscopía óptica convencional. Nuestro enfoque se basa en la espectroscopía de descomposición inducida por láser (tecnología LIBS). En LIBS, un pulso de láser se enfoca en la muestra de interés para crear la descomposición y la chispa del material. La radiación emitida atómica en el plasma se analizó posteriormente por un espectrómetro y la elementalconcentraciones mentales se pueden recuperar con las medidas de calibración realizados previamente 13,14. Las ventajas de LIBS incluyen sensibilidad (g / g para casi todos los elementos), la compacidad, la preparación de la muestra muy básico, ausencia de contacto con la muestra, respuesta instantánea y precisamente localizada (micro) análisis de superficie. Sin embargo, la aplicación de imagen química del tejido sigue siendo un reto ya que la ablación con láser de tejido debe ser controlado finamente para realizar mapas con alta resolución espacial, junto con la sensibilidad en el rango g / g 15,16.
Con esa solución, no se necesita la adición de trazadores o agentes de etiquetado, que permite la detección de elementos inorgánicos directamente en su entorno nativo en los tejidos biológicos. El instrumento LIBS desarrollado en nuestro laboratorio ofrece una resolución de corriente inferior a 100 micras con una sensibilidad estimada para Di-s por debajo de 35 g / g, equivalente a 0,1 mM de 16, lo que permitela asignación de muestras grandes (> 1 cm 2) dentro de 30 min. Además, el software hecho en casa facilita la adquisición y explotación de los datos. Este instrumento se utiliza para detectar, cartografiar y cuantificar la distribución tisular de gadolinio nanopartículas (Gd) basados en 17 a 18 en los riñones y muestras de tumores de animales pequeños, de 1 a 24 horas después de la inyección intravenosa de las partículas (tamaño <5 nm) . Elementos inorgánicos, que son intrínsecamente contenidas en un tejido biológico, tales como Fe, Ca, Na, y P, también se han detectado y fotografiado.
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Protocol
1. Preparación de la muestra biológica
Todos los experimentos descritos en este estudio fueron aprobados por el Comité del CECCAPP (Lyon, Francia) (autorización # LYONSUD_2012_004) Cuidado de Animales y el empleo, y los experimentos se llevaron a cabo bajo la supervisión de las personas autorizadas (L. Sancey, DDPP autorización # 38 05 32).
- Añadir 1 ml de H 2 O a 100 mol de nanopartículas a base de gadolinio (Gd), esperar 15 minutos y añadir 20 l de HEPES 50 mM, NaCl 1,325 M, CaCl2 20 mM a 100 l de H 2 O y 80 l de la solución primaria de nanopartículas a base de Di-s para obtener una solución de 200 l de 40 mM listas para inyectar (Ciudad: Villeurbanne, en el laboratorio).
- Se inyecta la solución de nanopartículas a base de Di-s 200 l por vía intravenosa en los roedores portadores de tumores anestesiados (Ciudad: Lyon Sud (Oullins), a 15 km de laboratorio).
- 1-24 horas después de la inyección, sacrificar a los ratones unad Vuelva a colocar las muestras biológicas en isopentano enfriado con nitrógeno líquido. Almacene las muestras a - 80 ° C (Ciudad: Lyon Sud (Oullins), a 15 km desde el laboratorio).
- Cortar la muestra (Ciudad: generalmente Grenoble, a 100 km desde el laboratorio, voy a tratar de tener un acceso en Lyon Sud) en 100 diapositivas micras de espesor y poner las diapositivas biológicas en platos de plástico específicos (plato de Petri). Almacenar a -80 ° C.
Nota: Los platos de plástico son básicamente una muestra de polímero de alta pureza. Se utilizan para evitar la interferencia con los elementos contenidos en el tejido.
2. Preparación de muestras para la calibración
- Preparar viales con dosis crecientes de nanopartículas a base de Gd en agua (0 nM, 100 nM, 500 nM, 1 mM, 5 mM, 10 mM, 50 mM, 100 mM, 500 mM, 1 mM y 5 mM).
- Ponga un l-gota de cada solución de separación constante de 3 mm en la placa de Petri 5.
- En seco a temperatura ambiente durante 20 min.
3. Experimento LIBS
- La inicialización del programa de instalación LIBS
- Configuración de láser. Después de conectar los instrumentos, espere 10-20 minutos para la estabilización de la energía del pulso láser y el enfriamiento de la cámara ICCD hasta -20 ° C. Ajuste la energía de pulso con el atenuador.
Nota: Los parámetros del láser óptimas para tejidos de mapeo son 5 ns de duración de impulsos, 1064 nm de longitud de onda y la energía de pulso de aproximadamente 4 mJ. El láser utiliza un típico Nd: YAG láser de nanosegundos. - LIBS Configuración. Establecer la posición de enfoque del láser (con respecto a la superficie de la muestra) para obtener el diámetro del cráter más pequeño (alrededor de 50 micras o menos).
Nota: Esto corresponde a una focalización pulso de láser 100 micras por debajo de la superficie de la muestra. - Configuración del espectrómetro. Utilice el espectrómetro de Czerny-Turner combinado con un 1200 líneas / mm rejilla y una cámara de alta resolución ICCD temporal. Controlar todos estos dispositivos por ordenador. Establezca el valor de hendidura de entrada a 40 micras. Ajuste el rango espectral reGårding el elemento a analizar. Utilice el rango espectral que cubre 325-355 nm para detectar Di-s con alta sensibilidad, así como de Na, Cu y Ca. Establezca los parámetros ICCD con un retraso de 300 nanosegundos, una puerta de 2 microsegundos, y una ganancia de 200.
- Configuración de láser. Después de conectar los instrumentos, espere 10-20 minutos para la estabilización de la energía del pulso láser y el enfriamiento de la cámara ICCD hasta -20 ° C. Ajuste la energía de pulso con el atenuador.
- Medición Mapping
- Coloque la muestra biológica en el soporte de la muestra LIBS motorizados.
- Ajuste la altura de la muestra de acuerdo con la posición de enfoque del láser.
- Tome una fotografía de alta resolución de la rebanada de la muestra.
- Ajuste el módulo de mapeo del software de adquisición de LIBS para realizar un mapa con los típicos 100 x 100 puntos de medición separados por una resolución de alrededor de 100 micras.
- Inicie la adquisición. Desde este punto de automatizar todo; la secuencia, así como la grabación del espectro en movimiento y el ahorro. Se requieren 40 minutos para una cartografía de los 10.000 puntos (equivalente a 1 cm 2 para una resolución de 100 m). Reagrupar todos los espectros registrados en un mismo archivo.
- Cuando finished, tomar una segunda fotografía de la rebanada de la muestra
- Medición Calibración
Con los mismos parámetros experimentales, medir las muestras de calibración (para los detalles de preparación, ver sección 2). Realizar un mapa o ficha 25 espectros (obtenido a partir de los sitios de medición en la parte central de la gota) en cada una de las gotas de calibración.
4 Análisis de espectro LIBS:. Construcción de Imágenes Químicas
- Grabar todos los espectros LIBS del mapeo del tejido y cargarlos en el análisis de software LIBS. Reste la línea de base para cada espectro y construir las imágenes químicas con escala de intensidad relativa usando un color falso.
Nota: Un algoritmo recupera intensidad de las líneas específicas, tales como Gd, Cu, Na, o Ca. - Realice la misma operación en el espectro medido de la muestra calibrada para permitir el cálculo de las curvas de calibración (relación entre la intensidad y la concentración) y construir aqmapa cuantitativas a o imagen de Di-s (u otro elemento de interés).
- Aplicar los tratamientos adecuados para las imágenes químicos, tales como la interpolación o suavizado. Guarde los mapas de intensidad o concentración en formato de imagen (mapa de bits).
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Representative Results
Como se muestra en la Figura 1, el haz de un láser de Nd: YAG en la longitud de onda fundamental de 1064 nm se centra verticalmente hacia abajo sobre la lámina de tejido por una lente de cuarzo de 50 mm de distancia focal. La energía de pulso fue de 4 mJ y la tasa de repetición de 10 Hz. Con el fin de evitar la generación de plasma en el aire, el haz de láser se enfoca alrededor de 100 micras bajo la superficie de la muestra. No plasma de aire se observó en esta condición. Durante los experimentos, la muestra fue movido por un motor paso a paso con el fin de generar un plasma en una sola posición en la muestra (disparo único). A la observación microscópica de los cráteres generados en el sustrato mostró un diámetro del cráter inferior a 50 micras. El plasma generado fue fotografiada por un par de lente sobre la entrada de una fibra óptica conectada en el otro extremo a un espectrógrafo de Czerny-sintonizador equipado con una rejilla de 1200 líneas por mm (ardían a 300 nm). Una cámara ICCD fue montado en el plano focal de salida del espectrógrafopara registrar el espectro. Durante las mediciones, la altura de la superficie de la muestra (con respecto a la posición de enfoque de láser) se controla usando el método trigonométrico con un haz incidente oblicuamente desde un bajo CW potencia del diodo láser sobre la superficie de la muestra y un monitor de la cámara CCD. El ICCD fue desencadenada por el Q-switch laser y el 400 ns y 2 microsegundos se establecieron, respectivamente, para los parámetros de retardo y de la puerta. Durante una asignación, la muestra se desplaza por un desplazamiento de 100 micras después de cada disparo de láser. Un espectro se registró para cada disparo de láser. Software de hecho en casa desarrollado en el entorno de LabVIEW controla todo el equipo y se dejó llevar a cabo secuencia automatizada para escanear el área de interés de la muestra de tejido con una resolución lateral específica.
Ejemplo de espectros de disparo único, grabado en diferentes regiones de un tejido renal después de la inyección IV de nanopartículas a base de Gd se muestra en la Figura 2. Las nanopartículas se sintetizaron como se described en Mignot et al 17. Brevemente, las nanopartículas están compuestas de una matriz de polisiloxano, que sostiene DOTAGA-Gd 3 + quelatos en su superficie. Se desarrollan para (i) de formación de imágenes multi-modal, ya que pueden ser usados en MRI, imágenes nucleares y de imágenes de fluorescencia, por separado o simultáneamente, y (ii) la función terapéutica como radiosensibilizador (es decir, aumentar localmente la eficacia de la radioterapia) 18. El rango espectral utilizado (286 a 320 nm) permite detectar diferentes elementos tales como Gd, Ca, Fe, Si y Al. El espectro azul se registró en la región central del riñón (la médula), el espectro rojo correspondía a la membrana del riñón (cápsula) y el espectro verde a la zona periférica (corteza). También es de destacar que el Di-s, Si, Al, Ca, Fe y intensidades son muy variables en las diferentes regiones, lo que sugiere una gran heterogeneidad de estos elementos concentraciones dentro del tejido. Básicamente Di-s y Si se contienen en la base de Di-sd nanopartículas, Fe era específica para los vasos sanguíneos, CA desde la misma muestra biológica.
Las muestras de tejido fueron analizados rebanada punto por punto, mover la muestra en la posición X e Y. Resolución lateral estaba cerca de 100 micras. Un espectro solo se registró para cada posición (medición de un solo cuadro). Intensidades de línea se extrajeron de los espectros usando una sustracción de fondo. Las imágenes químicas fueron entonces construyen a partir de estas intensidades. Un ejemplo se muestra en la Figura 3 para Di-s, Si y Fe. Líneas utilizados para construir estas imágenes químicos se muestran en la Tabla 2. El análisis se correlacionó a la fotografía de color de la muestra biológica antes del experimento para mejorar la localización y mapeo de los diferentes elementos. En el riñón, las señales de Gd y Si se co-localizados, pero esta co-localización no encajan con la distribución de la Fe, lo que indica una distribución específica.
SimiLAR resultados se obtuvieron con muestras tumorales. Un ejemplo de medición en el tejido tumoral SQ20B se muestra en la Figura 4. En este caso, el mapa química de Gd, que se muestra con una escala de colores falsa, se ha superpuesto a la imagen de la luz natural. Para esta medición, el análisis cuantitativo se ha realizado para recuperar la concentración de gadolinio local (véase el procedimiento en la sección de protocolo). Para este experimento, las nanopartículas se administraron directamente en el tumor, que se retiró 1 h después de la inyección y en rodajas para el análisis. Como se ve en la Figura 4, las partículas difundidas en el tejido del punto de inyección en el centro del tumor a la periferia. 1 h después de la inyección, aproximadamente la mitad del volumen del tumor contenía algunas partículas. Tal mapeo puede ayudar a proporcionar información sobre el protocolo terapéutico. Para una eficacia óptima del tratamiento, las nanopartículas deben difundirse dentro de todo el tumor; después de 1 hora, sólo haLF del tumor contenía algunas partículas, lo que sugiere que sería necesario un tiempo de difusión más largo para una difusión óptima y por lo tanto el tratamiento efectivo.
Tabla 1. Principal resuelto espacialmente las técnicas analíticas para la imagen elemental química. (Lobinski et al. 5). Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta tabla.
Figura 1. Representación esquemática del montaje experimental utilizado LIBS. (Motto-Ros et al. 15).
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Figura 2. LIBS espectros de disparo único obtenido en tres regiones diferentes del tejido renal. Estas regiones son la médula (parte central del riñón), la cápsula en rojo y la corteza en verde. Los espectros se han desplazado verticalmente para mayor claridad.
Figura 3. LIBS mapeo elemental de Di-s, Si y Fe en un trozo de riñón de ratón preparado de acuerdo con las condiciones especificadas en el texto. La intensidad de la escala de las imágenes químicas se expresa en una unidad arbitraria. Una fotografía con luz natural también se muestra en la parte superior izquierda de la figura.
Tabla 2. Líneas espectrales utilizadas para la detección de Di-s, Si y Fe en un riñón de ratón (líneas atómicas están etiquetados I y líneas iónicos están etiquetados II).
Figura 4. LIBS mapeo cuantitativo de Di-s en el interior de un trozo de tejido del tumor. La escala de colores falsos va desde 0,1 mm (verde) hasta 20 mm (violeta).
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Discussion
Aplicado a la muestra biológica, esta técnica permite que la imagen química, es decir, el mapeo y cuantificación, de Di-s y Si a partir de nanopartículas basadas-Di-s inyectados en diferentes órganos. A partir de los ajustes principales críticos, el control de las propiedades de láser (longitud de onda, la energía de pulso, de enfoque, y de estabilidad) es crítico para una ablación del tejido preciso y fino (es decir, una resolución de mapeo), así como para la sensibilidad. Trabajar en la alta energía proporciona una mejor sensibilidad pero lamentablemente genera resolución espacial degradado. Además, el tipo de espectrómetro utilizado debe ser revisado cuidadosamente. Básicamente, una investigación de banda ancha (por ejemplo, utilizando un espectrómetro echelle) permitirá a una gran variedad de especies elementales pero con baja sensibilidad, mientras que utilizando un espectrómetro de Czerny-Turner (equipado con un ICCD o un PMT) permitirá detectar un menor número de elementos, pero con mucha más sensibilidad. Todos los ajustes seleccionados de la gama de longitud de onda probed deben ajustarse a la pROPÓSITO de la investigación.
En cuanto a la propia muestra biológica, su espesor y la dureza también pueden interferir con la calidad del espectro. Una muestra muy delgada sería totalmente rociado y el soporte de la muestra sería atacado también por el disparo de láser, mientras que una muestra demasiado grueso podría sufrir de su en-homogeneidad de su constitución que se repercutió en la en-homogeneidad de la cantidad de rociado materia (presencia de grandes vasos, etc). Desde el estudio elemental, la elección del soporte podría ser anticipado; Por ejemplo, si el elemento investigado es Si, la muestra debe ser presentada en plástico puro pero el vidrio debe evitar ya que contiene grandes cantidades de Si. Del mismo modo, la muestra puede ser preparado y fijado en condiciones específicas para evitar cualquier componente del fijador para contaminar el nivel del elemento estudiado.
Esta técnica podría ser muy útil para el análisis de muestras pre-clínicos. LIBS couLD permitir la detección de elementos metálicos anormales tales como Fe y Cu, en particular en muestras de cerebro. Una limitación particular con Fe debe ser el alto contenido de Fe en la hemoglobina; la muestra preparada con cuidado y la evaluación de un ensayo de calibración es obligatoria. En el campo de las biotecnologías aplicadas a la biología o la medicina, LIBS podría permitir la detección de cualquier compuesto o partícula que contiene un elemento específico como Au, Di-s, Cu, etc
La instrumentación de sobremesa es totalmente compatible con el microscopio óptico estándar, lo que demuestra su gran potencial uso en biología y la medicina como una herramienta para la observación complementaria de elementos traza metálicos. Este tipo de proyección de imagen elemental, la combinación de alta resolución lateral (<50 micras) con límites de detección bajos (en el intervalo de mg / kg), en general, implica un alto nivel de equipo necesario, tales como microanálisis de radiación de sincrotrón (SXRF) o ablación con láser acoplado inductivamente espectrometría de masasmetría (LA-ICP-MS), por lo que es muy restrictivo e incompatible con los sistemas de imágenes microscópicas disponibles comercialmente. La instrumentación LIBS no es muy caro, dependiendo de la resolución y sensibilidad requerida (de precio entre 100 y 200 K €). Actualmente una muestra de 1 cm 2 podría ser analizada dentro de 30 a 40 min; este tiempo de adquisición podría no cambiar después de la adición de otras técnicas microscópicas, tales como la detección de fluorescencia y formación de imágenes de color de la muestra. La corriente de resolución espacial 100 micras ya muestra la eficacia para el mapeo de los tejidos biológicos. Sin embargo, esta resolución se podría mejorar en gran medida mediante el uso de un microscopio óptico en lugar de una simple lente para enfocar el pulso de láser de ablación. Resolución Micrómetro teóricamente puede ser alcanzado, a pesar de que la sensibilidad se reducirá, ya que será extirpada menos material. El aumento de la resolución de 10 micras permitiría una localización precisa de las nanopartículas que se observa a nivel celular.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Los autores agradecen el apoyo financiero de la Labex-Imust.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Laser nanosecond Nd:YAG | Quantel | Brillant | 5 nsec pulse width, wavelength 1,064 nm |
| Spectrometer | Andor Technology | Shamrock 303 | with 1,200 lines/mm blazed at 300 nm grating |
| Detector ICCD | Andor Technology | Istar | 2 nsec temporal resolution |
| LIBS Unit | ILM | Homemade Instrumentation | |
| Gd-based nanoparticles | Nano-H | particles | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | for particle's dilution |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | 21108 | for particle's dilution |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S5886 | for particle's dilution |
| Mice | Charles River | depending of animal breeding | |
| Isoflurane | Coveto / Virbac | for anaesthesia - Isofluranum | |
| Isopentane | Sigma-Aldrich | 59060 | to froze the sample slowly |
| Liquid nitrogen | Air Liquide | to cool down the isopentane | |
| Cryostat | Leica | CM-3050S | to slide the samples |
| Petri dishes | Dutscher | 353004 | to stick the sample |
References
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