Summary
우리는 성인 마우스 심근의 분리를 위해 신뢰할 수있는 방법에 대해 설명합니다. 이 프로토콜은 유전자 변형 마우스의 다양한 기능에서 성인 심근의 문화에 대한 일관성있는 결과를 얻을 수 있습니다.
Abstract
기술의 발전은 유전자 변형과 유전자 녹아웃 마우스, 많은 연구 분야에서 필수적인 도구를 포함하여, 유 전적으로 변형 된 쥐를 만들었습니다. 성인 심근 널리 좋은 심장 세포 생리학 및 병태 생리에 대한 모델뿐만 아니라 제약의 개입으로 사용할 수 있습니다. 유전자 변형 마우스에 의한 심근 '말단 분화 비효율적 원하는 유전자형을 생성하는 복잡한 심근 감염 프로세스에 대한 필요성을 배제. 높은 수량과 품질 기능 심근의 분리 및 문화 극적으로 심장 혈관 연구를 혜택을 세포 신호 전달 연구 및 약물 개발을위한 중요한 도구를 제공합니다. 여기에서, 우리는 약간의 훈련으로 구현 될 수있는 어른 쥐의 심근 세포의 분리를 위해 잘 확립 된 방법을 설명합니다. 마우스 마음이 절제와 격리 된 심장 시스템에 유관 된 다음 칼슘이없는 높은 P와 관류otassium 랑겐 역 행성 관류 모드에서 유형 II 콜라게나 소화 다음 버퍼. 이 프로토콜은 유전자 변형 마우스의 다양한 기능에서 성인 마우스 심근의 컬렉션에 대한 일관성있는 결과를 얻을 수 있습니다.
Introduction
심근 증식하지 않습니다. HL-1 및 마우스 심방 종양 유래 AT-1 세포와 같은 일부 심방 심근 세포주가있다; 그러나, 연구에는 성인 심실 심근 세포주가 없다. 성인 마우스 심근의 기본 세포 배양은 세포 및 분자 수준에서 심장 연구를위한 강력한 모델을 제공합니다. 지금까지, 그들은 생화학 생리 및 약리학 적 연구 1에 광범위하게 사용되어왔다. 또한, 유전자 변형 생쥐의 빈번한 사용은 심근 분리의 효과적인 방법을 필요하게되었다. 순수 배양은 다른 기관과의 상호 작용이없는 상태와 같은 내인성 신경 호르몬 및 호르몬과 같은 요인에 2,3를 통해 같은 전신 순환 할 수 있습니다. 그러나 심근을 성공적으로 격리 도전하실 수 있습니다.
우리가 여기에서 소개하는 프로토콜은 성인 쥐 cardiomyocyt와 우리의 경험을 기반으로합니다에스 오코넬 등 4,5에서 설명하는 방법. 특히 2007 5, 그들은 세포 배양 및 기능 분석에 버퍼 준비에서 자세한 방법을 설명했다. 마우스의 근육 세포가 쥐의 심근에 비해 구축에 매우 민감하기 때문에, 마우스 프로토콜의 관류, 소화, 칼슘 2 + 관용, 도금 및 문화에 사용되는 버퍼 나 미디어는 비특이적 여기 수축 커플 링 억제제, 2 보충된다 자신의 자발적인 수축을 억제하는 3 - 부탄의 monoxime (BDM)가, 따라서 생존과 막대 모양의 근육 세포의 수율을 크게 향상시킬 수 있습니다. 여기에 소개 된 프로토콜에서 근육 세포는 타입 II 콜라와 수정 랑겐 재관류에 의해 고립 된 마음에서 고 칼륨 버퍼에 구분됩니다. 콜라게나 II 효과적으로 간 매트릭스 해제 세포를 분해. 관류 솔루션은 낮은 레벨 6에서 세포의 신진 대사를 유지합니다. 책상 외에도에서에, 우리는 여기에 사용 된 하버드 장치에서 분리 된 심장 시스템은 정확한 온도와 일정한 압력 제어 7 잘 설계되어 있습니다. 이러한 접근법은 높은 재현성 제제 및 심장 비대 분석법위한 신호 단백질 또는 2~3일 배양을 측정 밤새 배양에 사용할 수있는 단일 셀 타입의 균일 한 집단을 제공한다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
마우스의 모든 연구는 절차와 건강의 국립 연구소의 가이드 라인에 따라 수행하고, 프로토콜은 톨레도 대학의 기관 동물 케어 및 사용위원회, 의학 및 생명 과학 대학에 의해 승인되었습니다.
1. 관류 시스템 준비
- 격리 전날, 빠른 알칼리 잔류 물이없는 세제와 (저수지 포함) 전체를 관류 시스템을 입력합니다. 이 솔루션은 몇 시간 또는 밤새 시스템에 흡수 할 수 있습니다.
- 다음 날 아침, 37 ° C의 열 순환기 온도를 조정하고 솔루션을 따뜻하게 할 수 있습니다. 세제 액을 제거하고 멸균 증류수로 철저히 시스템을 세척하십시오. 모든 측면 가지를 잊지 말라.
- 일정한 연동 펌프를 통해 관류 버퍼 시스템을 입력하고 모든 공기 보호 측면에 장착 된 주사기와 대동맥 챔버 (버블 트랩)으로부터 거품 그리기관상 동맥 폐색의 마음. 연동 펌프의 유량은 정기적으로 점검해야한다.
2. 버퍼의 준비, 문화, 미디어 및 요리
- 관류 버퍼 : 1X 관류 버퍼 500 ㎖ 사용하기 전에 확인합니다. 이 칼슘 무료 버퍼는 113 mM의 NaCl을 4.7 밀리미터의 KCl, 0.6 mM의 KH 2 PO 4, 0.6 ㎜ 나 2 HPO 4, 1.2 ㎜ 망초, 10 mM의 NA-HEPES, 12 mM의 탄산 수소 나트륨, 10 mM의 KHCO 3를 포함 0.032 빨간색 mM의 페놀, 30 mM의 타우린, 10 mM의 BDM, 5.5 mM의 포도당. 2 M 염산으로 7.0으로 산도를 조정하고 4 ℃에서 0.2 μm의 필터, 매장을 통해 필터링
주 :이 사용될 때) 관류 용액 당일에 준비되어야한다. 경우에 따라서는 4 ° C. 미만 3 일간 용액을 저장하는 수용 B)이 버퍼는 ATP의 C에게 감소, 대기 심근을 유지할 수 있습니다 15.3 mm로 높은 칼륨 농도를 위로,가onsumption 및 CA 2 + 허용 능력을 향상시킬 수 있습니다. - 소화 버퍼 (300 U / ㎖, 25 ~ 50 ㎖ / 마음) : 직전 관류에 준비합니다. 문화 후드에서 50 ㎖ 관류 버퍼에 용해, 유형 II 콜라게나 제의 전체 활동의 15,000 U 무게. 최종 칼슘 농도 50 μM을 만들기 위해 100 ㎜ 염화칼슘의 25 μL (살균 원액, 필터)를 추가합니다. 분리를위한 준비 37 ° C의 버퍼를 따뜻하게. 트립신과는 달리, 콜라게나 제는 50 ~ 100 μm의 칼슘 2 +의 존재에 가장 잘 작동합니다.
- 정지 버퍼 (50 ㎖ / 하트) : 문화 후드에서 작동합니다. 5 ㎖ 멸균 FBS와 관류 버퍼 45 ㎖를 혼합.
- 칼슘 2 + 솔루션은 I (12.5 μM 칼슘 2 +) : 정지 버퍼 20 ㎖에 100 ㎜ 염화칼슘 2.5 μl를 추가하고 혼합한다.
- 칼슘 2 + 솔루션 II (100 μM 칼슘 2 +) : 정지 버퍼 10 ㎖에 100 ㎜ 염화칼슘의 10 μl를 추가하고 혼합한다.
- 칼슘 2 + 솔루션 III (400 μM 칼슘 2 +) : 정지 버퍼 10 ㎖에 100 ㎜ 염화칼슘의 40 μl를 추가하고 혼합한다.
- 칼슘 2 + 솔루션 IV (900 μM 칼슘 2 +) : 정지 버퍼 10 ㎖에 100 ㎜ 염화칼슘의 90 μl를 추가하고 혼합한다.
- 전송 문화 후드에서 멸균 50 ML 원뿔 튜브에 2 밀리미터 L-글루타민과 1.26 mM의 염화칼슘을 포함하고 FBS 5 ㎖를 추가 MEM 43 ㎖, BDM 원액 1 ㎖ (: (50 ㎖ / 하트) 매체를 도금 500 mm의 필터 살균), 0.5 ml의 페니실린 / 스트렙토 마이신 (10,000 U / ㎖). 혼합 2 %의 CO 2, 느슨한 모자와 37 ° C 배양기에서 이전의 심근 세포 분리에 2 ~ 3 시간 동안 평형. 오른쪽 심근 도금 전에 배지로 200 mM의 ATP 0.5 ㎖ (pH를 7.2, 스톡 용액, 멸균 필터)를 추가한다.
- 문화 매체 (50 ㎖ / 하트) : 이전 48 문화 후드에서 멸균 50 ML 원뿔 튜브에 2 밀리미터 L-글루타민과 1.26 mM의 염화칼슘을 포함하는 MEM ㎖ 및 BDM 원액 (500 mm의 1 ㎖, filte를 추가r)로 멸균하고, 0.5 ㎖의 페니실린 / 스트렙토 마이신 (10000 U / ㎖). 혼합 2 % CO 2, 37 ° C 배양기 이전에 심근 세포 분리에 평형. 사용 전에 배지에 100 ㎎ / ㎖ BSA 0.5 ㎖ (멸균 필터)를 추가한다.
참고 : 2 % CO 2 배양기를 사용하여 myoctyes은 24 시간까지 자신의 막대 모양의 형태를 유지하는 데 도움이 6.9-7.0의 배양액의 pH를 유지 용이하게한다. - 라미닌 (1-2 ㎍ / cm 2) 코팅 요리 또는 플레이트 : 멸균 PBS (w / 칼슘과 마그네슘 O) 20 ㎖를 혼합로 전송 / ㎖ 자연 마우스 라미닌 1 mg을 200 μl를. 100-mm 요리에 35-mm 요리, 60-mm 요리에 2.5 ㎖, 또는 5 ㎖에 1 ML을 추가 균일하게 표면을 커버하는 악수, 장소 CO 2 2 %에서, 37 ° C 배양기 심근 도금까지.
참고 : 요리 나 플레이트가 코팅 된 날에 사용하지 않으면, 그들은 파라 필름으로 밀봉하고 4 ° C 하룻밤 (느린 코팅)에 저장할 수 있습니다. 씰링 requ에있다IRED 증발 및 오염을 방지한다. 코팅 된 플레이트는 최대 1 주일 동안 4 ° C에 보관하실 수 있습니다.
3. 마우스 심장 제거 및 삽관
- 30 분 동안 70 % 에탄올에 가위와 집게를 만끽하고 건조 할 수 있습니다.
- 가장 가까운 0.1 그램으로 마우스의 무게를. 몸 무게, 변형, 성별, 생년월일을 기록합니다.
- 200 ㎕의 헤파린을 주입 (100 IU / 마우스) IP 10 분 이전에 관상 동맥에서 혈액의 응고를 방지하기 위해 마취. 200 케타민 (ketamine) / kg 체중 MG 및 IP 주사 자일 라진 10 ㎎ / ㎏ 체중으로 마우스를 마취하고 마우스 꼬리 / 발가락 핀치에 응답을 중지 할 때까지 5 ~ 10 분 동안 기다립니다.
- 부드럽게 관류 시스템 근처 동물 수술 트레이 또는 테이블 벤치에 pinnable 작업 표면 (예 : 스티로폼)에 앞발과 hindpaws를 고정하여 누운 위치에 마우스를 고정합니다.
- 70 % 에탄올로 가슴과 복부를 닦아주십시오. 중간 선 피부 나 만들기수술 가위와 다이어프램 중순 복부 ncision.
- 다른 수술 가위로 다이어프램을 잘라 곡선 톱니 모양의 집게와 흉골을 누르고 있습니다. 양측 잘라 마음을 노출 가슴 케이지를 retroflect.
- 미세한 톱니 모양의 곡선과 atraumatic 집게를 사용하여 약간의 마음을 들어 올려 등의 흉부 벽에 최대한 가깝게 흉강 밖으로 마음을 해부하다.
- 차가운 관류 버퍼를 포함하는 100-mm 요리에 마음을 전송합니다. 조심스럽게 이러한 폐, 흉선, 그리고 기관지 등의 결합 조직을 멀리 트림.
- 일반적으로 흉선 및 지방 패드에 의해 숨겨진 대동맥과 뇌 지점을 확인합니다. 마음을 들어 올려, 대동맥 벽을 파악, 최초의 지점 (13) 아래의 대동맥을 절단하고, 약간 관류 액으로 채워진 대동맥 캐뉼라 (평면 / 무딘 팁과 노치 1 위 2mm 1.0 mm 외경 스테인레스 스틸 캐 뉼러에 맵시 두 초 미세 팁 F를 사용하거나 22 G 재사용 먹이 바늘) 팁orceps.
주 : a) 관류 유체가 관상 동맥 들어가는 기포를 방지하는 심장 삽관 중에 적하한다; B) 바로 대동맥 판막 이상으로 정맥의 끝을 유지합니다. - 정맥에 대동맥 클램프와 6-0 수술 실크 정맥에 대동맥 결찰. 전체 삽관은 120 초 이하로해야한다.
4. 심장 관류 및 소화
- 4 ML의 유속으로 칼슘이없는 관류 버퍼 마음을 Perfuse / 분 약 4 ~ 5 분 폐수가 명확해질 때까지, 다음 50 μm의 염화칼슘을 포함하는 소화 버퍼로 전환 마우스의 변형에 따라 3.5-20 분 동안 perfuse, 관류 압 및 콜라게나 제 활성. 해당되는 경우 소화 할 때, 70 ~ 80 mmHg로 대동맥 압력을 증가시킨다. 필요한 경우, 효소 관류 소화를 위해 재순환 될 수있다. 전형적으로, 300 U / ml의 효소 버퍼 ㎖ / 분 (4)의 유속으로 10-12 분에서 심장을 소화 할 것이다;70 mmHg로 후 부하에 압력을인가하는 경우, 300 U / ml를 4 ml / 분의 유속으로 만 3.5-5.5 분 걸릴 것이다.
- 마음이 약간 창백하고 이완 될 때 소화를 중지합니다. 부드럽게 끼 때 스폰지해야한다.
오. 세포 해리 칼슘 재 도입
- 70 % 에탄올을 묻힌 집게와 정맥에서 대동맥을 당겨 2.5 ml의 소화 버퍼를 포함하는 멸균 60 mm 접시에 담아. 이 멸균 기술을 염두에 머물고 및 후속 단계 살균 용품을 사용하여 문화 후드로 이동합니다.
- 미세 수술 가위로 대동맥, 심방과 큰 혈관을 제거합니다. 조심스럽게 두 미세 팁 집게로 10-12 작은 조각으로 심실을 애타게.
- 조심스럽게 10 ML 전송 피펫으로 심장 조각 셀 위로 ~ 10 배 아래로 피펫 후 15 ㎖의 폴리 프로필렌 원뿔 튜브로 전송할 수 있습니다. I는 12.5 μM 염화칼슘 및 전송을 포함하는 7.5 ㎖의 칼슘 용액으로 요리를 씻어이 튜브에, 10 ㎖의 최종 부피의 결과.
- 살짝 위로 심장 조직의 큰 조각을 분산하기 위해 미세 팁 전송 피펫을 사용하여 아래로 세포 현탁액을 피펫.
- 다음과 같은 내피 세포와 섬유 아세포와 같은 작은 비 심근 세포를 분리하기 위해 20 XG에서 3 분 동안 원심 분리.
- 뜨는 대기음 및 10 ㎖의 칼슘 용액에 심근 세포 펠렛을 재현 탁 200 mM의 ATP 100 μL (산도 7.2, 원액, 살균 필터)의 보충과 I. 3 ~ 5 분 동안 후드에 튜브를 남겨주세요.
- 전송 막대 모양의 둥근 근육 세포를 계산하는 hemacytometer에 10 μL 씩 분주 중복. 심근 세포의 총 수를 계산하고 봉상 심근 세포의 비율을 계산한다.
- 20 X g에서 3 분의 근육 세포를 원심 분리기. 뜨는을 제거하고 100 μM 염화칼슘을 포함하는 10 ㎖의 칼슘 솔루션 II의 펠렛을 재현 탁. 피펫 팅에 의해 미세 팁 전송 피펫과 근육 세포를 분산상하.
- 각각 칼슘 용액 III (400 μM 염화칼슘)와 IV (900 μM 염화칼슘)를 사용하여 상기 단계 (5.8)를 반복합니다.
- 쥐 심근 일차 배양을 위해, 배지를 도금 5ml에 심근 최종 펠렛을 재현 탁. 심근 세포의 총 수를 계산 및 막대 형상 심근 세포의 비율을 계산한다.
6. 세포 배양
- 50 ㎖의 튜브에서 25,000 봉상 심근 세포 / ㎖로 막대 모양의 심근 세포의 농도를 조정. 부드럽게 잘을 일시 중지 10 ML의 피펫을 사용하여 근육 세포를 피펫. 각 접시 또는 플레이트 같은 세포의 밀도를 보장하기 위해 피펫 및 튜브에 세포의 침전을 피하십시오.
- 라미닌의 코팅 용액을 흡입 한 후, 그 그릇이나 접시에 근육 세포를 접시. 조심스럽게 문화 후드의 표면에 접시 또는 플레이트 전후 및 좌우 크로스와 같은 패턴 3 4 시간을 밀어 넣습니다.
- 2 %의 CO에서 요리 나 플레이트를 배치37 ℃에서 2 배양기 약 80 %의 비율로 심근 세포의 부착을 허용하는 1-3 시간 동안 배양한다.
- 부착 후, 온화 무소속 근세포 및 세포 파편을 포함하는 매체를 대기음. 부드럽게 요리 나 플레이트의 측면에 배지를 추가합니다. 하나이 매체 변경을 수행합니다. 즉시 인큐베이터에 요리 또는 번호판을 반환합니다.
- O / N 배양 후, 근세포 단기간 세포 신호의 연구 전에 BDM없이 동일 매체에 변경할 수있다. 비대 또는 세포 사멸 분석을위한 장기 문화 BDM을 유지합니다.
참고 : BDM (2,3 - 부탄 디온 monoxime)는 마이 오신 ATPase의 활성도를 억제하고 수축을 방지 할 수 있습니다. 마이 오신 기반 수축의 억제는 쉽게 뒤집을 수있다. 그것은 BDM는, 비특이적 포스파타제 역할 SR로부터의 칼슘 방출을 증가시키고 자유 칼슘 농도 및 셀룰러 전기 prope의 변질 등의 일부 잠재적 인 부작용을 가질 수 있다는 것을보고rties 때문에 치료 전, BDM은 제거되어야한다. 더욱이, 어떤 경우에는, 특정 미오신 II 억제제 Blebbistatin은 심근 수축을 억제하는 8,9 대체 약물이 될 수있다. 그러나, 우리의 경우에, BDM은 심근의 질과 양을 위해서 Blebbistatin보다 낫다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
1. 성공적인 분리 정량
두 가지 기준은 절연 성공을 정량화하기 위해 사용된다 : 첫째, 전체 절연 심장 근세포의 개수, 및 제, 봉상 칼슘 내성 반올림 비 내성 근세포의 비율. 일반적으로이 프로토콜은 심장 제거에서 심근 도금 한 성인 마우스 마음에서 수율 약 1 백만 막대 모양의 심근 (수확 전체 근육 세포 70 ~ 90 %)을 주위에 75 ~ 90 분입니다. 이 기능은 마우스의 체중과 변형에 따라 다를 수 있습니다. 일반적으로 0.7 ~ 1.0 백만 막대 모양의 근육 세포는 ~ 25g의 C57BL/6J 마우스, ~ 35g으로 블랙 스위스 마우스에서 1.2-1600000 막대 모양의 근육 세포 및 0.7-1200000 막대 모양의 근육 세포에서 수집 할 수 있습니다 ~ 30g 나 / K-ATPase의의 이형 (α1의 S / R) 10 ~ 22g 심장 특정 NCX-KO 마우스 (11)로부터 수집. 고립 된 근육 세포는 일반적으로 직사각형 끝 명확한 교차 줄무늬가있는 별개의 막대 모양이그림 1.
2. 세포의 기능 식별
우리의 이전 데이터는 명확하게 배양 신생아 쥐의 심근에, 100 μM의 ouabain는 PI 3에게 K-종속 된 Akt의 인산화를 활성화하고 비대 (12)을 유도 할 수있는 것으로 나타났습니다. 더욱 성숙한 쥐 심장 근세포에서 이러한 결과를 확인하기 위하여, 성숙한 C57BL/6J 마우스 심장 근세포를 배양하고 ouabain 처리 하였다. 2 및 3 깨끗이 ouabain이 용량 의존적으로 Akt 포스 포 릴레이션을 증가 [3 H] - 류신을 유도 할 수 있음을 보여준다 단백질 합성시.
그림 1. 블랙 스위스 마우스에서 일반 막대 모양의 심근 하룻밤 후문화. 근육 세포는 사진 소프트웨어를 사용하여 위상차 현미경에서 촬영되었다.
배양 성인 C57BL/6J 마우스의 심근에 ouabain에 의한 Akt의 그림 2. 정품 인증. 심근 세포는 5 분 ~ 50 μM의 ouabain에 노출되고, 해물은 서양에 의해 인산화 (SER 473)의 Akt (P-Akt의)과의 Akt에 대해 분석 하였다 오. 정품 인증은 총 Akt의 인산화의 비율 (N = 5-10)로 정량 하였다. * P <0.05 제어 대, ** P <제어 대 0.01.
그림 3. Ouabai., n은 4 시간의 혈청 부족하면 근육 세포가 함께있는 ouabain 또는 100 nm의 ET-1 (양성 대조군)의 존재 또는 부재 [3 H]에서 발생한 상황을 처리 하였다 배양 성인 C57BL/6J 마우스의 심근에서 단백질 합성을 자극 - 12 시간 동안 로이신 (1 μCi / ㎖). 세포 용 해물을 5 % TCA로 침전 및 0.2 M NaOH/0.1 % SDS에 재현 탁하고, 방사능은 섬광 계수기에서 계수 하였다 하였다. 샘플 당 단백질 합성 / mg의 단백질 및 제어에 비해 정규화 CPM을 계산되었다.
솔루션 / 버퍼 | 관류 버퍼 | 소화 버퍼 | 버퍼를 중지 | 칼슘 2 + 솔루션 I | 칼슘 2 + 솔루션 II | 칼슘 2 + 솔루션 III | 칼슘 2 + 솔루션 IV |
113 | 113 | 113 | 113 | 113 | 113 | 113 | |
의 KCl, MM | 4.7 | 4.7 | 4.7 | 4.7 | 4.7 | 4.7 | 4.7 |
KH 2 PO 4, MM | 0.6 | 0.6 | 0.6 | 0.6 | 0.6 | 0.6 | 0.6 |
나 2 HPO 4, MM | 0.6 | 0.6 | 0.6 | 0.6 | 0.6 | 0.6 | 0.6 |
황산, MM | 1.2 | 1.2 | 1.2 | 1.2 | 1.2 | 1.2 | 1.2 |
NA-HEPES, MM | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 |
탄산 수소 나트륨, MM | 12 | 12 | 12 | 12 | 12 | 12 | 12 |
KHCO 3, MM | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 |
페놀 레드, μM | 32 | 32 | 32 | 32 | 32 | 32 | 32 |
타우린, MM | (30) | (30) | (30) | (30) | (30) | (30) | (30) |
BDM, MM | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 |
포도당, MM | 5.5 | 5.5 | 5.5 | 5.5 | 5.5 | 5.5 | 5.5 |
FBS, % (V / V) | 0 | 0 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 |
콜라게나 II, ㎎ / ㎖ | 0 | 1 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
염화칼슘, μM | 0 | (50) | 0 | 12.5 | (100) | (400) | 900 |
성인 마우스 심근 격리를위한 표 1. 솔루션 / 버퍼.
이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 준비하기 | 저장 |
태아 혈청 (FBS) | 애틀랜타 Biolgoicals | S11550 | N / A | -20 ℃에서 멸균 50 ML 튜브에 25 ㎖ 분량 씩 |
소 혈청 알부민 (BSA) 100 ㎎ / ㎖, 100X | 시그마 | A7906 | 50 ㎖ DIH 2 O, 0.22 μm의 멸균 주사기 F를 통해 살균 필터 5gilter | -20 ℃에서 멸균 15 ML 튜브에 5 ㎖ 분량 씩 |
염화칼슘 100 ㎜, 100 배 | 시그마 | C4901 | 0.22 μm의 멸균 주사기 필터를 통해 0.555 50 ㎖ DIH 2 O에서 g, 및 살균 필터 | 실온에서 멸균 15 ML 튜브에 10 ㎖ 분량 씩. |
라미닌 1 ㎎ / ㎖, 100 배 | 삶의 기술 | 23017-015 | N / A | -20 ℃에서 멸균 0.5 ML의 microcentrifuge 튜브에 200 ㎕의 분취 |
2,3 - 부탄 디온 monoxime (BDM) 500 mm의 50 배 | 시그마 | B0753 | 20 ㎖ DIH 2 O 1.01 g의 BDM은 후드에서 0.22 μm의 필터를 통해 필터링하여 솔루션을 소독. | 4 ℃에서 보관 |
아데노신-5'-삼인산 나트륨 염 (나 2-ATP) 200 mm의 100 배 | 시그마 | A6419 | 추가 5 ㎖ DIH 2 O1g 50 ㎖의 원심 분리 관에 2-ATP 나를 용해, 다음 7.2로 산도를 조정하고 DIH 2 O와 함께 10 ml로 최종 볼륨을 가지고 2 몰 / L의 수산화 나트륨을 사용하여 0.22 μM 주사기 필터를 통해 용액을 살균. | -20 ° C에서 1.5 ML 멸균 마이크로 원심 튜브에 0.5 ㎖ 분량 씩 |
염화나트륨 3.77 M, 33.3x | 시그마 | S7653 | 300 ㎖의 DIH 2 O에 66g | 4 ℃에서 보관 |
의 KCl 470 밀리미터, 100 배 | 피셔 과학 | P217 | 100 ㎖의 DIH 2 O 3.5 g | 4 ℃에서 보관 |
KH 2 PO 4 60 밀리미터, 100 배 | 시그마 | P5379 | 100 ㎖의 DIH 2 O 0.82 g | 4 ℃에서 보관 |
2 HPO 4 60 밀리미터, 100 배 나 | 시그마 | S0876 | 100 ㎖의 DIH 2 O 0.85 g | 4 ℃에서 보관 |
망초 120 밀리미터, 100 배 | 시그마 | M-1880 | 100 ㎖의 DIH 2 O에 3g | 4 ℃에서 보관 |
HEPES 1 M, 100 배 | 삶의 기술 | 15630-080 | N / A | 4 ℃에서 보관 |
탄산 수소 나트륨 600 mm의 50 배 | 시그마 | S6014 | 200 ㎖의 DIH 2 O 10.1 g | 4 ℃에서 보관 |
KHCO 3 1 M, 100 배 | 피셔 과학 | P235 | 100 ㎖의 DIH 2 O 10.1 g | 4 ℃에서 보관 |
페놀 레드 3.2 ㎜, 100 배 | 시그마 | P5530 | 100 ㎖의 DIH 2 O 0.12 g | 상온에서 보관. |
표 2. 성인 마우스 심근의 분리 및 배양 원액 준비 및 저장.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
최선의 준비를 위해, 가장 중요한 단계는 다음과 같습니다 : 1) 즉시 절제 후 정맥에 마우스 마음을 접선; 2) 적절한 심장 관류. 또한, 물 품질, 관류 온도, 버퍼의 산도, 살균, 화학 순도, 깨끗하고 오염되지 않은 튜브와 챔버도 중요한 요소를 확인합니다. 18.2 mΩ의 분자 생물학 수준의 H 2 O는 높은 버퍼를 준비하는 것이 좋습니다. 200 mM의 ATP 스톡 용액의 pH는 7.2, 쉽게 놓치는 단계로 조정되어야한다.
그것은 신속 대동맥을 식별하고 플린 (13)에 의해 도시 된 바와 같이 바로 아래의 제 1 분기 절단하는 것이 필수적이다. 효율적인 후크 업의 경우, 노치와 작은 톱니 모양의 크로스 클램프 적절한 크기의 스테인레스 스틸 캐 뉼러를 사용하는 것이 좋습니다. 결찰 후, 캐뉼라의 선단은 콜라게나 제를 완전히 순환 중에 관상 심장 조직과 상호 작용하는 것을 돕기 위하여 대동맥판 이상이어야한다. 경우에 따라 세포 수율은 큰 초기 보인다하지만, 많은 세포들은 둥근 형상 칼슘 관용 단계 이후이다. 한 설명은 혈관에서 응고 된 혈액이 부적절 소화에 이르게 심장에서 제거되지 않을 수 있다는 것입니다. 또 다른 가능성은 심장의 소화 이상이다. 콜라에 장시간 노출은 심근 세포의 칼슘 허용 오차 2를 줄일 수 있습니다. 해리 및 칼슘 재 도입 동안, 온화 심근 세포의 생존을 유지하기 위해 가능한 한 심장 근세포를 처리하는 것도 중요하다.
요약하면, 유전자 변형 마우스의 성인 심근 문화는 심장 연구를위한 강력한 도구입니다. 결과를 해석 할 때 그러나, 미래의 일이 마음에 인간과 설치류 사이의 유전 적 차이를 유지해야합니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
저자는 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다.
Acknowledgments
이 작품은 국립 심장, 폐, 혈액 연구소 부여 HL-36573에 의해 지원되었다. 우리는이 원고를 편집 데이비드 씨 Sowa의 감사합니다.
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Isolated heart system for small rodent | Harvard Apparatus | IHSR-mouse 73-4019 | |
Aortic Cannula, OD 1.0 mm | Harvard Apparatus | 73-2816 | |
Dumont #4 Forceps | Fine science tools | 11294-00 | |
Straight sharp serrated scissors | Fine science tools | 14070-12 | |
Serrated Graefe forceps | Fine science tools | 11050-10 | |
Curved, serrated Graefe forceps | Fine science tools | 11052-10 | |
Straight Mini Serrefines clamps | Fine science tools | 18054-28 | |
MEM | Gibco | 11575-032 | |
Collagenase II | Worthington | 4176 | |
Mucosal universal detergent | Sigma | Z637181 | Mucasol is a fast alkaline residue-free detergent. |
References
- Louch, W. E., Sheehan, K. A., Wolska, B. M. Methods in cardiomyocyte isolation, culture, and gene transfer. J. Mol. Cell. 51, 288-298 (2011).
- Gross, D. R. Isolated heart preparations, problems, and pitfalls. In: Animal Models in Cardiovascular Research. Gross, D. R. , 3rd edition, Springer. 109-130 (2009).
- Schlüter, K. D., Piper, H. M. Isolation and culture of adult ventricular cardiomyocytes. Practical Methods in Cardiovascular Research. Dheim, S., Mohr, F. W., Delmar, M. , Springer. 557-567 (2005).
- O'Connell, T. D., Ni, Y. G., Lin, K. M., Han, H. P., Yan, Z. Isolation and culture of adult cardiac myocytes for signaling studies. AfCS research reports. 1 (5), 1-9 (2003).
- O'Connell, T. D., Rodrigo, M. C., Simpon, P. C. Isolation and culture of adult mouse cardiac myocytes. Methods in Molecular Biology. Vivanco, F. 35, Humana Press. 271-296 (2007).
- Nilolskaya, A., Sharma, V. Cell culture models and methods. Cardiac Electrophysiology Methods and Models. Sigg, D. C., Laizzo, P. S., Xiao, Y. F. , Springer. 213-235 (2010).
- Merx, M. W., Schrader, M. The working heart. Practical Methods in Cardiovascular Research. Dhein, S., Mohr, F. W., Delmar, M. , Springer-Verlag. Berlin Heidelberg, Germany. 173-189 (2005).
- Kabaeva, Z., Zhao, M., Michele, D. E. Blebbistatin extends culture life of adult mouse cardiac myocytes and allows efficient and stable transgene expression. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 294, 1667-1674 (2008).
- Lou, Q., Li, W., Efimov, I. R. The role of dynamic instability and wavelength in arrhythmia maintenance as revealed by panoramic imaging with blebbistatin vs. 2,3-butanedione monoxime. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 302, 262-269 (2012).
- Liu, C. X., et al. Reduction of Na/K-ATPase potentiates Marinobufagenin-induced cardiac dysfunction and myocyte apoptosis. J. Biol. Chem. 287 (20), 16390-16398 (2012).
- Bai, Y., et al. Different roles of the cardiac Na+/Ca2+-exchanger in ouabain-induced inotropy, cell signaling, and hypertrophy. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 304, 427-435 (2013).
- Liu, L. J., Zhao, X. C., Pierre, S. V., Askari, A. Association of PI3K-AKT signaling pathway with digitalis-induced hypertrophy of cardiac myocytes. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 293, 1489-1497 (2007).
- Flynn, J. M., Santana, L. F., Melov, S. Single Cell Transcriptional Profiling of Adult Mouse Cardiomyocytes. J. Vis. Exp. (58), (2011).