Summary
Vi beskriver en pålidelig metode til isolering af voksne mus cardiomyocytter. Denne protokol giver et ensartet resultat til dyrkning af funktionelle voksne kardiomyocytter fra en række af genetisk modificerede mus.
Abstract
Teknologiske fremskridt har gjort genmodificerede mus, herunder transgene og gen-knockout-mus, et vigtigt redskab i mange forskningsområder. Voksen cardiomyocytes er bredt accepteret som en god model for hjerte-cellulær fysiologi og patofysiologi samt til farmaceutisk intervention. Genetisk modificerede mus udelukker behovet for komplicerede cardiomyocyte infektion processer til at generere den ønskede genotype, som er ineffektive på grund af cardiomyocytter 'terminal differentiering. Isolering og dyrkning af høj kvantitet og kvalitet funktionelle cardiomyocytes vil dramatisk gavne hjerte-kar-forskning og give et vigtigt redskab til celle signalering transduktion forskning og udvikling af lægemidler. Her beskriver vi en veletableret metode til isolering af voksne mus cardiomyocytes, der kan gennemføres med lidt træning. Musen hjerte udskåret og kanyle til en isoleret hjerte-system, og derefter perfunderet med en calcium-fri og høj potassium puffer efterfulgt af type II collagenasefordøjelse i Langendorff retrograd perfusion mode. Denne protokol giver et ensartet resultat til indsamling af funktionelle voksen mus cardiomyocytter fra en række af genetisk modificerede mus.
Introduction
Cardiomyocytter ikke proliferativ. Der er nogle atrielle cardiomyocyte cellelinjer, som HL-1 og AT-1-celler afledt fra mus atrielle tumorer; men der er ingen voksne ventrikulære cardiomyocyte cellelinjer til rådighed for forskningen. Primære cellekulturer af voksne mus cardiomyocytes giver en kraftfuld model for hjerte forskning på de cellulære og molekylære niveau. Til dato har de været brugt i udstrakt grad til biokemiske, fysiologiske og farmakologiske forskning 1.. Derudover har den hyppige brug af genetisk modificerede mus nødvendiggjort effektive metoder til cardiomyocyte isolation. Renkultur giver mulighed for betingelser fri interaktion med andre organer og den systemiske cirkulation, såsom gennem endogene neurohormonal og hormon-lignende faktorer 2,3. Vellykket isolering af cardiomyocytes Dog kan være udfordrende.
Protokollen vi indfører heri er baseret på vores erfaringer med voksne rotter cardiomyocytes og beskrevet af O'Connell et al 4,5 metode. Især i 2007 5, de beskrev detaljerede teknikker fra buffer præparater til cellekultur og funktionel analyse. Da mus myocytes er meget modtagelige for kontraktur forhold til rotte cardiomyocytes er de buffere eller medier, der anvendes til perfusion, fordøjelse, Ca 2 + tolerance, plating og kultur i muse-protokol suppleret med en uspecifik excitation-kontraktion kobling inhibitor, 2, 3-butandion monoxime (BDM) for at hæmme deres spontane sammentrækning, dermed levedygtighed og udbyttet af stavformede myocytes forbedres markant. I protokollen indføres her, er myocytterne separeret i en høj kalium buffer fra den isolerede hjerte ved modificeret Langendorff perfusion med type II collagenase. Collagenase II effektivt nedbryder den intercellulære matrix og frigiver cellerne. Perfusionsopløsningen holder også cellulær metabolisme på et lavt niveau 6. I additipå den isolerede hjerte system fra Harvard Apparatus vi brugt her er godt designet til præcis temperatur og konstant tryk kontrol 7. Denne fremgangsmåde giver meget reproducerbare præparater og ensartede populationer af enkelt celletype, som kan anvendes i dyrkning natten over til måling signalproteiner eller 2-3 dages kultur for hjerte hypertrofiske assays.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Al forskning på mus blev udført i henhold til procedurer og retningslinjer for National Institutes of Health, og de protokoller, blev godkendt af Institutional Animal Care og brug Udvalg University of Toledo, College of Medicine og Life Sciences.
1.. Perfusionssystem Forberedelse
- Dagen før isolation, udfylde hele perfusion (herunder reservoirer) med en opløsning af hurtig alkalisk rester vaskemiddel. Lad opløsningen suge ind i systemet i et par timer eller natten over.
- Den næste morgen, justere thermocycler temperaturen til 37 ° C, og tillade opløsningen at varme op. Fjern rengøringsmiddel og skyl systemet grundigt med steriliseret destilleret vand. Må ikke glemme alle de sidegrene.
- Fyld systemet med perfusionsbuffer via et konstant peristaltisk pumpe og drage nogen luftbobler fra aorta kammer (boblerør) med en sidemonteret sprøjte til at beskyttehjertet af koronar okklusion. Flowet af peristaltikpumpen bør kontrolleres rutinemæssigt.
2.. Udarbejdelse af buffere, kultur Media og Dishes
- Perfusionsbuffer: Lav 500 ml 1x perfusionsbuffer før brug. Denne calcium-fri buffer indeholder 113 mM NaCI, 4,7 mM KCI, 0,6 mM KH 2PO 4, 0,6 mM Na 2 HPO 4, 1,2 mM MgSO4, 10 mM Na-HEPES, 12 mM NaHCO3, 10 mM KHCO3, 0,032 mM phenolrødt, 30 mM taurin, 10 mM BDM og 5,5 mM glucose. PH-værdien justeres til 7,0 med 2 M HCI og filtreres gennem et 0,2 um filter, opbevares ved 4 ° C.
Bemærk: a) perfusionsopløsningen skal være forberedt på den samme dag, hvor det bruges. I nogle tilfælde er det acceptabelt at opbevare opløsningen i mindre end 3 dage ved 4 ° C. b) Denne buffer har en høj koncentration af kalium op til 15,3 mm, hvilket kan holde cardiomyocytes hvilende, reducere ATP consumption og forøge Ca2 +-tolerante evne. - Digestion Buffer (300 U / ml, 25-50 ml / hjerte): forberede lige før perfusion. 15.000 U samlede aktivitet af type II collagenase afvejes og opløses i 50 ml perfusionsbuffer i kultur hætte. Tilsættes 25 pi 100 mM CaCl2 (stamopløsning, filtersteriliseret) at foretage den endelige calciumkoncentration 50 uM. Varm buffer til 37 ° C, når de er klar til isolering. I modsætning til trypsin, collagenase fungerer bedst i nærvær af 50-100 uM Ca 2 +.
- Stop Buffer (50 ml / hjerte): Operate i kultur hætte. Bland 45 ml perfusionsbuffer med 5 ml steril FBS.
- Ca 2 +-opløsning I (12,5 uM Ca 2 +): Add 2.5 pi 100 mM CaCl2 til 20 ml stopbuffer og blandes.
- Ca 2 + opløsning II (100 uM Ca 2 +): Tilsæt 10 ul 100 mM CaCl2 til 10 ml af stopbuffer og blandes.
- Ca 2 +-opløsning III (400 uM Ca 2 +): Tilsæt 40 ul 100 mM CaCl2 til 10 ml af stopbuffer og blandes.
- Ca 2 +-opløsning IV (900 uM Ca 2 +): Tilføj 90 pi af 100 mM CaCl2 til 10 ml af stopbuffer og blandes.
- Udpladningsmedium (50 ml / hjerte): Overførsel 43 ml MEM indeholdende 2 mM L-glutamin og 1,26 mM CaCl2 i en steril 50 ml konisk rør i kultur hætte og tilsættes 5 ml FBS, 1 ml BDM stamopløsning ( 500 mM, filtersteriliseret) og 0,5 ml penicillin / streptomycin (10.000 U / ml). Mix og ligevægt i 2-3 hr før myocyt isolation i 2% CO 2, 37 ° C inkubator med hætter løs. Lige før myocyt udpladning tilsættes 0,5 ml 200 mM ATP (pH 7,2, stamopløsning, filtrer steriliseret) i mediet.
- Dyrkningsmedium (50 ml / heart): Overførsel 48 ml MEM indeholdende 2 mM L-glutamin og 1,26 mM CaCl2 i en steril 50 ml konisk rør i kultur hætte og tilsæt 1 ml BDM stamopløsning (500 mM, filter steriliseret) og 0,5 ml penicillin / streptomycin (10.000 U / ml). Bland og tempereres i 2% CO 2, 37 ° C inkubator før myocyt isolation. Før anvendelse tilsættes 0,5 ml 100 mg / ml BSA (filter steriliseret) i mediet.
Bemærk: Ved hjælp af en 2% CO2-inkubator letter opretholdelse dyrkningsmediet pH på 6,9-7,0, som hjælper myoctyes opretholde deres stavformet morfologi op til 24 timer. - Laminin (1-2 ug / cm 2)-coatede skåle eller tallerkener: Overfør 200 pi 1 mg / ml naturlig muselaminin til 20 ml steriliseret PBS (w / o calcium og magnesium) og blandes. 1 ml til 35 mm retter, 2,5 ml til 60 mm skåle eller 5 ml til 100 mm skåle, ryst at jævnt dække overfladerne, og sted i 2% CO 2, 37 ° C inkubator indtil myocyt plating.
Bemærk: Hvis fade eller tallerkener ikke anvendes på dagen overtrukket, kan de forsegles med parafilm og opbevaret ved 4 ° C natten over (Langsom Coating). Sealing er requIRED at forhindre fordampning og kontaminering. Coatede plader kan opbevares ved 4 ° C i op til 1 uge.
3.. Mouse Heart Fjernelse og Kanylerings
- Soak saks og pincet i 70% ethanol i 30 min og lad dem tørre.
- Musen afvejes til nærmeste 0,1 gram. Optag sin kropsvægt, stamme, køn og fødselsdato.
- Injicer 200 pi heparin (100 IU / mus) ip 10 minutter før anæstesi for at forhindre koagulation af blod i kranspulsårerne. Bedøve mus med 200 mg / kg legemsvægt ketamin og 10 mg / kg legemsvægt xylazin ved ip injektion og vente i 5-10 minutter, indtil musen reagerer til hale / tå trykker.
- Fastgør musen i liggende stilling ved forsigtigt fastsættelse forpoterne og bagpoter til en nålbar arbejde overflade (dvs. styrofoam) på et dyr kirurgi bakke eller et bord bænk nær perfusionssystemet.
- Tør bryst og mave med 70% ethanol. Lav en midterlinjen hud incision fra midten maven til mellemgulvet med en kirurgisk saks.
- Skær membranen med en anden kirurgisk saks og holde brystbenet med buede savtakkede pincet. Skær bilateralt og retroflect brystkassen at eksponere hjertet.
- Løft hjerte lidt hjælp fine buede savtakkede og atraumatisk pincet og dissekere hjerte ud af brysthulen så tæt som muligt på den dorsale thorax væg.
- Overfør hjertet til en 100 mm skål indeholdende kold perfusionsbuffer. Trimme forsigtigt væk bindevæv såsom lunger, thymus, og bronkier.
- Identificer aorta og dens kranielle grene, som normalt skjult af thymus og fedt pad. Skær aorta under sin første filial 13, tage fat aortavæggen, løft hjerte, og lidt slip den til perfusionsvæske fyldt aorta kanyle (1,0 mm OD rustfrit stål kanyle med stump / flad spids og hak 1 og 2 mm over spidsen, eller en 22 G genanvendelig fodring nål) ved hjælp af to ultrafine-tip forceps.
Bemærk: a) perfusionsvæske skal dryp under hjerte kanylering at forhindre gasbobler i at komme ind kranspulsårerne; b) holde spidsen af kanylen lige over aortaklappen. - Clamp aorta til kanylen og liger aorta til kanylen med 6-0 kirurgisk silke. Hele kanylering bør tage mindre end 120 sek.
4.. Heart perfusion og fordøjelse
- Perfuse hjertet med calcium-fri perfusionsbuffer ved flowhastighed på 4 ml / min omkring 4-5 min, indtil spildevandet blevet klart, derefter skifte til fordøjelsen indeholdende 50 uM CaCl2 og perfuse for 3,5-20 min afhængig musestamme, perfusionstryk og collagenase aktivitet. Hvis det er relevant, øge aorta trykket til 70-80 mmHg, når fordøje. Når det er nødvendigt, kan enzym perfusat recirkuleres for fordøjelsen. Typisk vil 300 U / ml enzymbuffer fordøje et hjerte i 10-12 minutter ved en strømningshastighed på 4 ml / min;Hvis man anvender afterload tryk ved 70 mm Hg, vil 300 U / ml kun tage 3,5-5,5 minutter ved en strømningshastighed på 4 ml / min.
- Stop fordøjelse når hjertet bliver lidt bleg og slatten. Det bør være svampet når forsigtigt klemt.
5.. Celler dissociation og Calcium genindførelse
- Træk aorta fra kanylen med 70% ethanol-gennemblødt pincet og sætte hjertet i en steril 60 mm skål indeholdende 2,5 ml fordøjelse buffer. Flyt ind i kulturen hætte med sterile forsyninger, der opholder sig opmærksomme på sterile teknikker til dette og opfølgende skridt.
- Fjern aorta, atrier og store kar med fine kirurgiske sakse. Forsigtigt drille ventriklen i 10-12 små stykker med to fine-tip pincet.
- Pipettér forsigtigt hjertet stykker og celler op og ned ~ 10x med en 10-ml overførselspipette og derefter overføre til en 15 ml konisk polypropylen rør. Skyl fad med 7,5 ml calciumopløsning jeg indeholdende 12,5 uM CaCl2 og overførseldette ind i røret, hvilket resulterer i et endeligt volumen på 10 ml.
- Pipettér forsigtigt cellesuspensionen op og ned ved hjælp af en fin spids overførselspipetten at sprede store stykker af hjerte væv.
- Derefter centrifugeres i 3 minutter ved 20 x g for at adskille de små ikke-myocytter celler såsom endotelceller og fibroblaster.
- Aspirer supernatanten og resuspender myocyt pellet i 10 ml calcium løsning jeg med et tillæg på 100 ul 200 mM ATP (pH 7,2, stamopløsning, filtrer steriliseret). Lad røret i hætten i 3-5 min.
- Transfer duplikere 10 portioner pi til en hæmacytometer at tælle stavformet og rund myocytes. Beregn det samlede antal af myocytter og beregne den procentdel af stavformede myocytter.
- Centrifuger myocytterne i 3 min ved 20 x g. Fjern supernatanten og resuspender pellets i 10 ml calcium-opløsning II indeholdende 100 uM CaCl2. Sprede myocytterne med fin spids overførselspipetten ved pipetteringop og ned.
- Gentag ovenstående trin (5,8) under anvendelse af calcium-opløsning III (400 uM CaCl2) og IV (900 uM CaCl2), hhv.
- For muse myocyt primær kultur, resuspender endelige myocyt pellet i 5 ml udpladningsmedium. Tæl det samlede antal myocytter og beregne den procentdel af stavformede myocytter.
6.. Celledyrkning
- Juster koncentrationen af stavformede myocytter til 25.000 stavformede myocytter / ml i et 50 ml rør. Pipettér forsigtigt myocytterne ved hjælp af en 10 ml pipette til at suspendere dem godt. Undgå cellesedimentering i pipetten og røret for at sikre lige celletæthed for hvert fad eller tallerken.
- Efter sugning fra laminin belægning løsning, tallerken myocytterne i disse retter eller plader. Skub forsigtigt retter eller plader frem og tilbage og fra side til side i en cross-lignende mønster tre til fire gange på overfladen af kulturen hætte.
- Placer retter eller plader i en CO 2%2-inkubator ved 37 ° C. Inkuber i 1-3 timer for at tillade myocyt vedhæftet fil med en hastighed på omkring 80%.
- Efter fastgørelse forsigtigt aspireres fra mediet, der indeholder separate myocytter og celle debris. Forsigtigt tilføje dyrkningsmedium til siderne af retter eller plader. Udfør dette medium forandring én efter én. Umiddelbart returnere retter eller plader til inkubatoren.
- Efter O / N-kulturen, kan myocytterne ændres til det samme medium uden BDM før studier af kortsigtet celle signalering. Hold BDM på lang sigt kultur for hypertrofiske eller apoptose analyser.
Bemærk: BDM (2,3-butandion monoxime) kan hæmme myosin-ATPase og forhindre sammentrækning. Dets inhibering af myosin-baserede sammentrækning er let reversibel. Det forlyder, at BDM kan have nogle potentielle bivirkninger, såsom at fungere som en ikke-specifik fosfatase, øget calcium frigivelse fra SR, og ændring af frit calcium koncentration og cellulære elektriske properties, så før behandlingen, BDM bør fjernes. I visse tilfælde kan en specifik myosin II inhibitor Blebbistatin være et alternativ lægemiddel til at inhibere cardiomyocyte sammentrækning 8,9. Men i vores tilfælde, BDM er bedre end Blebbistatin af hensyn til kvaliteten og mængden af de cardiomyocytes.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
1.. Vellykket Isolation Kvantificering
To kriterier anvendes til at kvantificere succes isolation: første, det samlede antal cardiomyocytes isolerede, og for det andet forholdet mellem stavformede calcium-tolerant at runde ikke-tolerante myocytes. Generelt dette protokol tager omkring 75-90 minutter fra hjertet fjernelse til myocyt yderklædningen og udbytter omkring 1 million stavformede cardiomyocytes (70-90% af den samlede myocytes høstet) fra en voksen mus hjerte. Dette kan variere med muse kropsvægt og stamme. Typisk kan fra 0,7 til 1,0 millioner stavformede myocytter indsamles fra en ~ 25 g C57BL/6J mus, 1,2-1600000 stavformede myocytter fra en ~ 35 g sort schweiziske mus og 0,7-1.200.000 stavformede myocytter kan indsamles fra en ~ 30 g Na / K-ATPase heterozygot (α1 S / R) 10 eller ~ 22 g hjerte-specifik NCX-KO mus 11. Isolerede myocytter normalt har en særskilt stang-form med rektangulære ender og klare cross-riller,vist i figur 1..
2.. Celle funktion Identifikation
Vores tidligere data har tydeligt vist, at i dyrkede neonatale rotte kardiomyocytter kan 100 uM ouabain aktivere PI 3 K-afhængige Akt phosphorylering og fremkalde hypertrofi 12. For yderligere at bekræfte disse resultater i voksne mus cardiomyocytter voksen C57BL/6J mus cardiomyocytter blev dyrket og behandlet med ouabain. Figur 2 og 3 viser klart, at ouabain kan øge Akt phosphorylering på en dosis-afhængig måde og fremkalde [3H]-leucin-inkorporering under proteinsyntese.
Fig. 1. Normale stavformede cardiomyocytter fra Black schweiziske mus efter nattenkultur. Myocytter blev fotograferet under fasekontrastmikroskopi ved brug af foto-software.
Figur 2. Aktivering af Akt af ouabain i dyrkede voksne C57BL/6J mus cardiomyocytter. Myocytter blev udsat for 0,50 uM ouabain i 5 minutter, og lysater blev analyseret for phosphoryleret (Ser 473) Akt (p-Akt) og Akt ved western blotting. Aktivering blev kvantificeret som forholdet af phosphoryleret til total Akt (n = 5-10). * P <0,05 vs kontrol, ** P <0,01 versus kontrol.
Figur 3. Ouabain stimulerer proteinsyntese i dyrkede voksne C57BL/6J mus cardiomyocytter Efter 4 timer serum deprivation blev myocytter behandlet med de angivne betingelser i nærvær eller fravær af ouabain eller 100 nM ET-1 (positiv kontrol) sammen med [3H]. - leucin (1 uCi / ml) i 12 timer. Cellelysater blev udfældet med 5% TCA og resuspenderet i 0,2 M NaOH/0.1% SDS, og radioaktiviteten blev talt i en scintillationstæller. Proteinsyntese per prøve blev beregnet til cpm / mg protein og normaliseret i forhold til kontrollen.
| Løsning / Buffer | Perfusion buffer | Digestion Buffer | Stop buffer | Ca2 + Opløsning I | Ca2 + Opløsning II | Ca2 + Solution III | Ca2 + Solution IV |
| 113 | 113 | 113 | 113 | 113 | 113 | 113 | |
| KCI, mM | 4.7 | 4.7 | 4.7 | 4.7 | 4.7 | 4.7 | 4.7 |
| KH 2 PO 4, mM | 0.6 | 0.6 | 0.6 | 0.6 | 0.6 | 0.6 | 0.6 |
| Na 2 HPO 4, mM | 0.6 | 0.6 | 0.6 | 0.6 | 0.6 | 0.6 | 0.6 |
| MgSO4, mM | 1.2 | 1.2 | 1.2 | 1.2 | 1.2 | 1.2 | 1.2 |
| Na-HEPES, mM | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 |
| NaHCO3, mM | 12 | 12 | 12 | 12 | 12 | 12 | 12 |
| KHCO 3 mM | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 |
| Phenolrødt, uM | 32 | 32 | 32 | 32 | 32 | 32 | 32 |
| Taurin, mM | 30 | 30 | 30 | 30 | 30 | 30 | 30 |
| BDM, mM | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 |
| Glukose, mM | 5.5 | 5.5 | 5.5 | 5.5 | 5.5 | 5.5 | 5.5 |
| FBS% (v / v) | 0 | 0 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 |
| Collagenase II mg / ml | 0 | 1 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| CaCl2, uM | 0 | 50 | 0 | 12.5 | 100 | 400 | 900 |
Tabel 1.. Solutions / buffere til voksen mus cardiomyocytes isolation.
| Navn | Firma | Catalog # | Forberedelse | Opbevaring |
| Føtalt bovint serum (FBS) | Atlanta Biolgoicals | S11550 | N / A | 25 ml portioner i sterile 50 ml rør ved -20 ° C. |
| Bovint serumalbumin (BSA) 100 mg / ml, 100x | Sigma | A7906 | 5 g i 50 ml DIH 2 O, steril filter gennem 0,22 um steril sprøjte filter | 5 ml portioner i sterile 15 ml rør ved -20 ° C. |
| CaCl2 100 mM, 100x | Sigma | C4901 | 0,555 g i 50 ml DIH 2 O, og sterilt filter gennem 0,22 um steril sprøjte filter | 10 ml portioner i sterile 15 ml rør ved stuetemperatur. |
| Laminin 1 mg / ml, 100x | Life-teknologier | 23017-015 | N / A | 200 pi alikvoter i sterile 0,5 ml mikrocentrifugerør ved -20 ° C. |
| 2,3-butandion monoxime (BDM) 500 mM, 50x | Sigma | B0753 | 1,01 g BDM i 20 ml DIH 2 O, sterilisere opløsningen ved filtrering gennem 0,22 um filter i hætte. | opbevares ved 4 ° C. |
| Adenosin-5'-triphosphat-dinatriumsalt (Na2-ATP) 200 mM, 100x | Sigma | A6419 | Der tilsættes 5 ml DIH 2 Oat opløse 1 g Na 2-ATP i 50 ml centrifugerør, derefter bruge 2 mol / l NaOH for at justere pH til 7,2, og bringe det endelige volumen til 9 ml med DIH 2 O. sterilisere opløsningen gennem 0,22 um sprøjtefilter. | 0,5 ml alikvoter i 1,5 ml sterile mikrocentrifugerør ved -20 ° C. |
| NaCl 3,77 M, 33.3x | Sigma | S7653 | 66 g i 300 ml DIH 2 O | opbevares ved 4 ° C. |
| KCI 470 mM, 100x | Fisher Scientific | P217 | 3,5 g i 100 ml DIH 2 O | opbevares ved 4 ° C. |
| KH 2 PO4 60 mM, 100x | Sigma | P5379 | 0,82 g i 100 ml DIH 2 O | opbevares ved 4 ° C. |
| Na 2 HPO 4 60 mM, 100x | Sigma | S0876 | 0,85 g i 100 ml DIH 2 O | opbevares ved 4 ° C. |
| MgSO4 120 mM, 100x | Sigma | M-1880 | 3 g i 100 ml DIH 2 O | opbevares ved 4 ° C. |
| HEPES 1 M, 100x | Life-teknologier | 15630-080 | N / A | opbevares ved 4 ° C. |
| NaHCO3 600 mm, 50x | Sigma | S6014 | 10,1 g i 200 ml DIH 2 O | opbevares ved 4 ° C. |
| KHCO3 1 M, 100x | Fisher Scientific | P235 | 10,1 g i 100 ml DIH 2 O | opbevares ved 4 ° C. |
| Phenolrødt 3,2 mM, 100x | Sigma | P5530 | 0,12 g i 100 ml DIH 2 O | opbevares ved stuetemperatur. |
Tabel 2.. Stamopløsning tilberedning og opbevaring for voksne mus cardiomyocytes isolation og kultur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
For den bedste forberedelse, de mest kritiske trin er: 1) omgående at tilslutte musen hjerte til kanylen efter udskæring; 2) passende hjerte perfusion. Bemærk også, at vandkvalitet, perfusion temperatur, pH buffer, sterilisering, kemisk renhed, og ren, ikke-forurenet slanger og kamre er også vigtige faktorer. 18,2 MOhm molekylærbiologi-grade H2O er stærkt anbefales til forberedelse buffer. PH-værdien af 200 mM ATP stamopløsning bør justeres til 7,2, et skridt, som er let at gå glip af.
Det er vigtigt hurtigt at identificere aorta og at skære lige under dens første gren, som vist ved Flynn 13. Til effektiv hook-up, er en passende størrelse rustfrit stål kanyle med indhak og lille savtakket cross klemme anbefales. Efter ligering skal spidsen af kanylen være over aortaklappen for at hjælpe collagenase fuldt interagere med hjertevæv under koronar cirkulation. Undertiden celleudbytte synes stort oprindeligtmen mange celler er rund efter calcium tolerance trin. En forklaring er, at koaguleret blod i blodkarrene ikke kan fjernes helt fra hjertet, hvilket fører til utilstrækkelig fordøjelse. En anden mulighed er over fordøjelse af hjertet. Langvarig udsættelse for collagenase reducerer myocyt calcium-tolerance 2. Under dissociation og calcium genindførelse, er det også vigtigt at håndtere cardiomyocytter så skånsomt som muligt at opretholde myocyt levedygtighed.
Sammenfattende voksen cardiomyocyte kultur af genetisk modificeret mus er et kraftfuldt værktøj til hjerte-forskning. Dog bør det fremtidige arbejde huske den genetiske forskel mellem mennesker og gnavere, når fortolke resultaterne.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af National Heart, Lung, og Blood Institute Grant HL-36573. Vi takker David Sowa til at redigere dette manuskript.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Isolated heart system for small rodent | Harvard Apparatus | IHSR-mouse 73-4019 | |
| Aortic Cannula, OD 1.0 mm | Harvard Apparatus | 73-2816 | |
| Dumont #4 Forceps | Fine science tools | 11294-00 | |
| Straight sharp serrated scissors | Fine science tools | 14070-12 | |
| Serrated Graefe forceps | Fine science tools | 11050-10 | |
| Curved, serrated Graefe forceps | Fine science tools | 11052-10 | |
| Straight Mini Serrefines clamps | Fine science tools | 18054-28 | |
| MEM | Gibco | 11575-032 | |
| Collagenase II | Worthington | 4176 | |
| Mucosal universal detergent | Sigma | Z637181 | Mucasol is a fast alkaline residue-free detergent. |
References
- Louch, W. E., Sheehan, K. A., Wolska, B. M. Methods in cardiomyocyte isolation, culture, and gene transfer. J. Mol. Cell. 51, 288-298 (2011).
- Gross, D. R. Isolated heart preparations, problems, and pitfalls. In: Animal Models in Cardiovascular Research. Gross, D. R. , 3rd edition, Springer. 109-130 (2009).
- Schlüter, K. D., Piper, H. M. Isolation and culture of adult ventricular cardiomyocytes. Practical Methods in Cardiovascular Research. Dheim, S., Mohr, F. W., Delmar, M. , Springer. 557-567 (2005).
- O'Connell, T. D., Ni, Y. G., Lin, K. M., Han, H. P., Yan, Z. Isolation and culture of adult cardiac myocytes for signaling studies. AfCS research reports. 1 (5), 1-9 (2003).
- O'Connell, T. D., Rodrigo, M. C., Simpon, P. C. Isolation and culture of adult mouse cardiac myocytes. Methods in Molecular Biology. Vivanco, F. 35, Humana Press. 271-296 (2007).
- Nilolskaya, A., Sharma, V. Cell culture models and methods. Cardiac Electrophysiology Methods and Models. Sigg, D. C., Laizzo, P. S., Xiao, Y. F. , Springer. 213-235 (2010).
- Merx, M. W., Schrader, M. The working heart. Practical Methods in Cardiovascular Research. Dhein, S., Mohr, F. W., Delmar, M. , Springer-Verlag. Berlin Heidelberg, Germany. 173-189 (2005).
- Kabaeva, Z., Zhao, M., Michele, D. E. Blebbistatin extends culture life of adult mouse cardiac myocytes and allows efficient and stable transgene expression. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 294, 1667-1674 (2008).
- Lou, Q., Li, W., Efimov, I. R. The role of dynamic instability and wavelength in arrhythmia maintenance as revealed by panoramic imaging with blebbistatin vs. 2,3-butanedione monoxime. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 302, 262-269 (2012).
- Liu, C. X., et al. Reduction of Na/K-ATPase potentiates Marinobufagenin-induced cardiac dysfunction and myocyte apoptosis. J. Biol. Chem. 287 (20), 16390-16398 (2012).
- Bai, Y., et al. Different roles of the cardiac Na+/Ca2+-exchanger in ouabain-induced inotropy, cell signaling, and hypertrophy. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 304, 427-435 (2013).
- Liu, L. J., Zhao, X. C., Pierre, S. V., Askari, A. Association of PI3K-AKT signaling pathway with digitalis-induced hypertrophy of cardiac myocytes. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 293, 1489-1497 (2007).
- Flynn, J. M., Santana, L. F., Melov, S. Single Cell Transcriptional Profiling of Adult Mouse Cardiomyocytes. J. Vis. Exp. (58), (2011).
