Summary
Vi beskriver en tillförlitlig metod för isolering av vuxen mus hjärtmuskelceller. Protokollet ger ett konsekvent resultat för kulturen i funktionella vuxna cardiomyocytes från olika genetiskt modifierade möss.
Abstract
Teknologiska framsteg har gjort genetiskt modifierade möss, inklusive transgena och gen knockout-möss, ett viktigt verktyg inom många forskningsområden. Vuxna cardiomyocytes är allmänt accepterat som en bra modell för hjärt-cellulär fysiologi och patofysiologi, samt för läkemedels ingripande. Genmodifierade möss utesluter behovet av komplicerade cardiomyocyte infektionsprocesser för att generera den önskade genotypen, som är ineffektiv på grund av kardiomyocyter 'terminal differentiering. Isolering och kultur av hög kvantitet och kvalitet funktionella cardiomyocytes kommer dramatiskt att gynna kardiovaskulär forskning och ge ett viktigt verktyg för cellsignalering transduktion forskning och läkemedelsutveckling. Här beskriver vi en väletablerad metod för isolering av vuxna mus hjärtmuskelceller som kan genomföras med lite träning. Musen hjärtat skärs ut och kanylerades till en isolerad hjärtsystem och efter perfusion med kalciumfritt och hög potassium buffert följt av typ II kollagenasdigestion i Langendorff retrograd perfusion läge. Protokollet ger ett konsekvent resultat för insamling av funktionella vuxen mus cardiomyocytes från en rad olika genetiskt modifierade möss.
Introduction
Cardiomyocytes inte proliferativ. Det finns några förmaks cardiomyocyte cellinjer, som HL-1 och AT-1 celler från mus förmaks tumörer; emellertid finns det inga vuxen ventrikulär cardiomyocyte cellinjer finns tillgängliga för forskning. Primära cellkulturer av vuxna mus cardiomyocytes ger en kraftfull modell för hjärtforskning på cellulär och molekylär nivå. Hitintills har de använts i stor utsträckning för biokemiska, fysiologiska och farmakologiska forskningen 1. Dessutom har den frekventa användningen av genetiskt modifierade möss som krävde effektiva metoder för cardiomyocyte isolering. Ren kultur tillåter förhållanden fri från samverkan med andra organ och den systemiska cirkulationen, exempelvis genom endogena neurohormonala och hormonliknande faktorer 2,3. Däremot kan framgångsrik isolering av hjärtmuskelceller vara utmanande.
Protokollet vi introducerar detta dokument baseras på våra erfarenheter med vuxna råttor cardiomyocytes och den metod som beskrivs av O'Connell et al 4,5. Särskilt under 2007 5, beskrev de detaljerade tekniker från förberedelser buffert till cellodling och funktionell analys. Eftersom mus-myocyter är mycket mottagliga för kontraktur jämfört med de råttkardiomyocyter är de buffertar eller media som används för perfusionen, matsmältning, Ca 2 + tolerans, plätering och kultur i musprotokollet kompletterat med en ospecifik excitation-kontraktion kopplings inhibitor, 2, 3-butandion monoxim (BDM) för att hämma deras spontana kontraktion, därav lönsamheten och avkastningen av stavformade muskelceller förbättras avsevärt. I protokollet införs här, är myocyterna separeras i en hög kalium buffert från det isolerade hjärtat av modifierad Langendorff perfusion med typ II kollagenas. Kollagenas II bryter effektivt ned den intercellulära matrisen och frigör celler. Perfusionslösningen behåller även cellulär metabolism på en låg nivå 6. I additipå, är det isolerade hjärtsystemet från Harvard Apparatus vi använt här väl utformad för exakt temperatur och konstant tryck kontroll 7. Denna metod ger mycket reproducerbara förberedelser och enhetliga populationer av enstaka celltyp, som kan användas i natten kultur för mätning av signalproteiner eller 2-3 dagars kultur för hjärt hypertrofiska analyser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
All forskning på möss gjordes enligt rutiner och riktlinjer för National Institutes of Health, och de protokoll som godkändes av Institutional Animal Care och användning kommittén vid University of Toledo, College of Medicine och livsvetenskaper.
1. Perfusion System Preparation
- Dagen före isolering, fylla hela perfusionssystemet (inklusive reservoarer) med en lösning av snabb alkalisk rest fritt tvättmedel. Låt lösningen tränga in i systemet under några timmar eller över natten.
- Nästa morgon, justera termocykeltemperaturen till 37 ° C och låt lösningen värmas upp. Avlägsna rengöringsmedel och spola systemet noggrant med steriliserat destillerat vatten. Glöm inte alla sidogrenar.
- Fyll systemet med perfusionsbuffert via en konstant peristaltisk pump och dra några luftbubblor ut från aorta kammaren (bubbelfälla) med en spruta sidmonterad att skyddahjärtat från koronar ocklusion. Bör kontrolleras flödeshastigheten för den peristaltiska pumpen rutinmässigt.
2. Beredning av buffertar, Kultur Media, och rätter
- Perfusionsbuffert: Gör 500 ml 1x perfusionsbuffert före användning. Denna kalciumfritt bufferten innehåller 113 mM NaCl, 4,7 mM KCl, 0,6 mM KH 2 PO 4, 0,6 mM Na 2 HPO 4, 1,2 mM MgSO 4, 10 mM Na-HEPES, 12 mM NaHCOa 3, 10 mM KHCO3, 0,032 mM fenolrött, 30 mM taurin, 10 mM BDM, och 5,5 mM glukos. Justera pH till 7,0 med 2 M HCl och filtrera genom ett 0,2 pm filter, förvara vid 4 ° C.
Anm: a) perfusion lösning bör beredas på samma dag när den används. I vissa fall är det acceptabelt att lagra lösningen under mindre än 3 dagar vid 4 ° C. b) Denna buffert har en hög kaliumkoncentration upp till 15,3 mm, vilket kan hålla hjärtmuskelceller vilande, minskar ATP-consumption och ökar Ca2 +-tolerant förmåga. - Digestion Buffer (300 U / ml, 25-50 ml / heart): förbereda strax före perfusion. Väg 15.000 U av total aktivitet av typ II kollagenas, lös upp i 50 ml perfusionsbuffert i kultur huva. Tillsätt 25 | il av 100 mM CaCl2 (stamlösning, filter steriliserad) för att göra den slutliga kalciumkoncentration 50 pM. Värm buffert till 37 ° C när de är färdiga för isolering. Till skillnad från trypsin, fungerar kollagenas bäst i närvaro av 50-100 | iM Ca2 +.
- Stop Buffer (50 ml / heart): Kör i kultur huva. Blanda 45 ml perfusionsbuffert med 5 ml sterilt FBS.
- Ca 2 +-lösning I (12,5 pM Ca 2 +): Lägg till 2,5 | il av 100 mM CaCl2 till 20 ml stoppbuffert och blanda.
- Ca2 +-lösning II (100 M Ca 2 +): Tillsätt 10 l av 100 mM CaCl2 till 10 ml av stoppbuffert och blanda.
- Ca 2 +-lösning III (400 pM Ca 2 +): Tillsätt 40 | il av 100 mM CaCl2 till 10 ml med stoppbuffert och blanda.
- Ca2 +-lösning IV (900 mikroM Ca 2 +): Lägg till 90 l av 100 mM CaCl2 till 10 ml av stoppbuffert och blanda.
- Plätering medium (50 ml / heart): Överför 43 ml MEM innehållande 2 mM L-glutamin och 1,26 mM CaCl2 i en steril 50 ml koniskt rör i kultur huva och tillsätt 5 ml FBS, 1 ml BDM stamlösning ( 500 mM, filtersteriliserad) och 0,5 ml penicillin / streptomycin (10000 U / ml). Blanda och jämvikt i 2-3 timmar innan myocyt isolering i 2% CO2, 37 ° C inkubator med locken löst. Precis innan myocyt plätering, tillsätt 0,5 ml 200 mM ATP (pH 7.2, stamlösning, filtrera steriliseras) i mediet.
- Odlingsmedium (50 ml / heart): Överför 48 ml MEM innehållande 2 mM L-glutamin och 1,26 mM CaCl2 i en steril 50 ml koniskt rör i kultur huva och tillsätt 1 ml BDM stamlösning (500 mM, filter steriliserad) och 0,5 ml penicillin / streptomycin (10000 U / ml). Blanda och jämvikta i 2% CO2, 37 ° C inkubator före myocyt isolering. Före användning, tillsätt 0,5 ml av 100 mg / ml BSA (filtersteriliserad) till mediet.
Anm: Med hjälp av en 2% CO2 inkubator underlättar att upprätthålla odlingsmediet pH på 6,9-7,0, vilket hjälper myoctyes behålla sin stavformade morfologi upp till 24 tim. - Laminin (1-2 mikrogram / cm 2)-belagda rätter eller plattor: Överför 200 l av 1 mg / ml naturlig muslaminin till 20 ml steriliserat PBS (w / o kalcium och magnesium) och blanda. Tillsätt 1 ml till 35-mm skålar, 2,5 ml till 60-mm skålar, eller 5 ml till 100-mm skålar, skaka till jämnt täcka ytor och plats i 2% CO2, 37 ° C inkubator tills myocyt plätering.
OBS: Om disken eller plattorna inte används på dagen belagda, kan de förseglas med Parafilm och förvaras vid 4 ° C över natten (långsam Coating). Tätning är required att förhindra avdunstning och kontamination. Belagda plattor kan förvaras vid 4 ° C i upp till en vecka.
3. Mouse Heart Borttagning och Kanyle
- Blötlägg sax och pincett i 70% etanol i 30 min och låt dem torka.
- Väg musen till närmaste 0,1 gram. Spela in sin kroppsvikt, stammar, kön och födelsedatum.
- Injicera 200 pl heparin (100 lU / mus) ip 10 minuter före anestesi för att förhindra koagulering av blod i kranskärlen. Bedöva musen med 200 mg / kg kroppsvikt av ketamin och 10 mg / kg kroppsvikt av xylazin genom ip-injektion och vänta 5-10 min tills musen slutar svara till svans / tå nypor.
- Sätt fast musen i ryggläge genom att försiktigt fastställande av tassarna och hindpaws till en pinnable arbetsyta (dvs. frigolit) på ett djur kirurgi bricka eller bord bänk nära perfusionssystemet.
- Torka av bröstet och buken med 70% etanol. Gör en mittlinjen hud incision från mitten av buken till membranet med en kirurgisk sax.
- Skär membranet med en annan kirurgisk sax och hålla bröstbenet med böjda sågtandade pincett. Klipp bilateralt och retroflect bröstkorg bur för att exponera hjärtat.
- Lyft hjärtat något med fina böjda sågtandade och atraumatisk pincett och dissekera hjärtat ur brösthålan så nära som möjligt till den dorsala thoraxväggen.
- Överför hjärtat till en 100-mm skål innehållande kall perfusionsbuffert. Trimma försiktigt bort den bindväv såsom lungor, bräss, och bronker.
- Identifiera aorta och dess kraniala grenar, som vanligtvis döljs av bräss och fett pad. Skär aorta under dess första grenen 13, ta tag i aortaväggen, lyft hjärta, och något glida vidare till perfusion vätskefyllda aorta kanyl (1,0 mm YD rostfri kanyl med trubbig / flat spets och skårorna 1 och 2 mm ovanför spets, eller en 22 G återanvändbar utfodring nål) med två ultra fin spets forceps.
Anm: a) perfusion ska vätskan droppa under hjärtkanyle att förhindra gasbubblor kommer in i kranskärlen; b) Håll kanylens spets strax ovanför aortaklaffen. - Kläm aorta till kanylen och ligate aorta till kanylen med 6-0 kirurgiskt silke. Hela kanyle bör ta mindre än 120 sek.
4. Heart perfusion och matsmältning
- BEGJUTA hjärtat med kalciumfri perfusion buffert vid flödeshastighet av 4 ml / min ca 4-5 min tills utflödet blir klar, sedan byta till matsmältningen buffert innehållande 50 ^ M CaCl2 och BEGJUTA för 3,5-20 min beroende på musstam, perfusionstryck och kollagenasaktivitet. Om tillämpligt, ökar aorta trycket till 70-80 mmHg vid smälta. När så är nödvändigt kan enzym perfusat återcirkuleras för matsmältningen. Typiskt kommer 300 U / ml enzymbuffert smälta ett hjärta i 10 till 12 minuter vid en flödeshastighet av 4 ml / min;Om ansöker afterload tryck vid 70 mm Hg, kommer 300 U / ml ta endast 3,5-5,5 min vid en flödeshastighet av 4 ml / min.
- Sluta matsmältningen när hjärtat blir något blek och slapp. Det bör vara svampig när försiktigt nöp.
5. Celler dissociation och kalcium återinförande
- Dra aorta från kanylen med 70% etanol-indränkt pincett och placera hjärtat i en steril 60-mm skål innehållande 2,5 ml digereringsbuffert. Flytta in i kulturen huva med sterila förbrukningsmaterial, stanna medveten om sterila tekniker för detta och uppföljande åtgärder.
- Ta aorta, förmak, och stora fartyg med fina kirurgiska saxar. Retas försiktigt ventrikeln i 10-12 små bitar med två fina spets pincett.
- Försiktigt pipett hjärtbitar och celler upp och ner ~ 10x med en 10-ml överföringspipett och sedan överföra till en 15-ml polypropylen koniska rör. Skölj skålen med 7,5 ml kalciumlösning I innehållande 12,5 ^ M CaCl2 och överföringdetta in i röret, vilket resulterar i en slutlig volym av 10 ml.
- Pipett försiktigt cellsuspensionen upp och ner med hjälp av en fin spets överföringspipetten att skingra stora bitar av hjärtvävnad.
- Centrifugera därefter under 3 minuter vid 20 x g för att separera ut små icke-myocyt celler, såsom endotelceller och fibroblaster.
- Sug bort supernatanten och suspendera myocyte pelleten i 10 ml kalciumlösning jag med ett tillägg på 100 pl 200 mM ATP (pH 7.2, stamlösning, filtrera steriliserad). Låt röret i huven för 3-5 min.
- Transfer duplicera 10 l alikvoter till en hemacytometer räkna stavformade och runda myocyter. Beräkna det totala antalet myocyter och beräkna procentandelen av stavformade myocyter.
- Centrifugera myocyter till 3 minuter vid 20 x g. Avlägsna supernatanten och återsuspendera pelleten i 10 ml kalciumlösning II innehållande 100 pM CaCl2. Skingra myocyterna med fin spets överföringspipett genom att pipetterauppåt och nedåt.
- Upprepa ovanstående steg (5.8) med hjälp av kalcium-lösning III (400 ^ M CaCl2) och IV (900 ^ M CaCl2), respektive.
- För musen myocyt primär kultur, suspendera sista myocyt pelleten i 5 ml plätering medium. Räkna det totala antalet myocyter och beräkna procentandelen av stavformade myocyter.
6. Cellodling
- Justera koncentrationen av stavformade myocyter till 25000 stavformade myocyter / ml i en 50-ml rör. Pipett försiktigt myocyterna med hjälp av en 10-ml pipett för att upphäva dem väl. Undvik cellsedimentering i pipetten och röret för att säkerställa lika celltäthet för varje skål eller tallrik.
- Efter avsugning av laminin beläggningslösningen, tallrik myocyterna i dessa rätter eller plattor. Skjut försiktigt rätter eller plattor fram och tillbaka och från sida till sida i ett korsliknande mönster tre till fyra gånger på ytan av kulturen huva.
- Placera skålarna eller plattorna i en 2% CO2-inkubator vid 37 ° C. Inkubera i 1-3 timmar för att tillåta myocyt infästning i en hastighet av ca 80%.
- Efter fastsättning, försiktigt aspirera bort medium som innehåller lös myocytes och cellrester. Försiktigt lägga odlingsmedium till sidorna av disken eller plattor. Utför detta medium förändring en efter en. Omedelbart tillbaka disken eller plattor till inkubatorn.
- Efter O / N-kulturen, kan de myocyter ändras till samma medium utan BDM före studier av kortsiktiga cellsignalering. Håll BDM på lång sikt kultur för hypertrofiska eller apoptosanalyser.
Anmärkning: BDM (2,3-butandion monoxim) kan hämma myosin-ATPas och förhindra kontraktion. Dess hämning av myosin-baserade kontraktion kan snabbt hävas. Det har rapporterats att BDM kan ha vissa potentiella biverkningar, såsom i egenskap av en icke-specifik fosfatas, ökande kalciumfrisättning från SR, och ändring av fri kalciumkoncentration och cellulär elektrisk properties, så innan behandlingen, BDM bör tas bort. Dessutom i vissa fall kan en specifik myosin II inhibitor blebbistatin vara ett alternativt läkemedel att inhibera cardiomyocyte kontraktion 8,9. Men i vårt fall, är bättre än blebbistatin av hänsyn till kvalitet och kvantitet av de hjärtmuskelceller BDM.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
1. Framgångsrik Isolation Kvantifiering
Två kriterier används för att kvantifiera framgången med isolering: första, det totala antalet hjärtmuskelceller isolerade, och andra, förhållandet mellan stavformade kalcium tolerant att runda icke-toleranta myocyter. Generellt detta protokoll tar ca 75-90 min från centrum bort till myocyt plätering och ger ca 1 miljon stavformade hjärtmuskelceller (70-90% av totala myocyter skördade) från en vuxen mus hjärta. Detta kan variera med mus kroppsvikt och påfrestningar. Normalt kan 0,7-1,0 miljoner stavformade myocyter samlas in från en ~ 25 g C57BL/6J mus, 1,2-1.600.000 stavformade muskelceller från en ~ 35 g svart schweizisk mus, och 0,7-1.200.000 stavformade myocyter kan samlas in från en ~ 30 g Na / K-ATPas heterozygot (α1 S / R) 10 eller ~ 22 g hjärt specifik NCX-KO-mus 11. Isolerade myocyter har normalt en distinkt stavform med rektangulära ändar och tydliga kors strimmor,som visas i figur 1.
2. Cell Function Identifiering
Våra tidigare uppgifter har tydligt visat att i odlade neonatala råttkardiomyocyter, kan 100 ^ M ouabain aktivera PI 3 K-beroende Akt fosforylering och inducerar hypertrofi 12. För att ytterligare bekräfta dessa resultat i vuxen mus kardiomyocyter, vuxen C57BL/6J mus kardiomyocyter odlades och behandlades med ouabain. Figurerna 2 och 3 visar klart att ouabain kan öka Akt-fosforylering på ett dosberoende sätt och inducera [3 H]-leucin-inkorporering under proteinsyntes.
Figur 1. Normala stavformade hjärtmuskelceller från Black schweizisk mus efter nattenkultur. Myocyter fotograferades under faskontrastmikroskopi med hjälp av fotoprogram.
Figur 2. Aktivering av Akt genom ouabain i odlade vuxen C57BL/6J mus kardiomyocyter. Myocyter exponerades för 0-50 uM ouabain under 5 min, och lysaten analyserades med avseende fosforylerad (Ser 473) Akt (p-Akt) och Akt genom western blotting. Aktivering kvantifierades som förhållandet mellan fosforyleras till total Akt (n = 5-10). * P <0,05 jämfört med kontroll, ** P <0,01 jämfört med kontroll.
Figur 3. Ouabain stimulerar proteinsyntes i odlade vuxen C57BL/6J mus kardiomyocyter Efter 4 tim serumbrist, var myocyter som behandlats med de angivna betingelser i närvaro eller frånvaro av ouabain eller 100 nM ET-1 (positiv kontroll) tillsammans med [3H]. - leucin (1 pCi / ml) under 12 timmar. Cellulära lysat fälldes ut med 5% TCA och återsuspenderades i 0,2 M NaOH/0.1% SDS, och radioaktiviteten räknades i en scintillationsräknare. Den proteinsyntes per prov beräknades cpm / mg protein och normaliserades i jämförelse med kontrollen.
| Lösning / Buffer | Perfusionsbuffert | Digestion Buffert | Stop-buffert | Ca2 +-lösning I | Ca 2 + Lösning II | Ca 2 + Lösning III | Ca2 + Solution IV |
| 113 | 113 | 113 | 113 | 113 | 113 | 113 | |
| KCl, mM | 4,7 | 4,7 | 4,7 | 4,7 | 4,7 | 4,7 | 4,7 |
| KH 2 PO 4, mM | 0,6 | 0,6 | 0,6 | 0,6 | 0,6 | 0,6 | 0,6 |
| Na 2 HPO 4, mM | 0,6 | 0,6 | 0,6 | 0,6 | 0,6 | 0,6 | 0,6 |
| MgSO4, mM | 1,2 | 1,2 | 1,2 | 1,2 | 1,2 | 1,2 | 1,2 |
| Na-HEPES, mM | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 |
| NaHCO 3, mM | 12 | 12 | 12 | 12 | 12 | 12 | 12 |
| KHCO3, mM | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 |
| Fenolrött, iM | 32 | 32 | 32 | 32 | 32 | 32 | 32 |
| Taurin, mM | 30 | 30 | 30 | 30 | 30 | 30 | 30 |
| BDM, mM | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 |
| Glukos, mM | 5,5 | 5,5 | 5,5 | 5,5 | 5,5 | 5,5 | 5,5 |
| FBS,% (vol / vol) | 0 | 0 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 |
| Kollagenas II mg / ml | 0 | 1 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| CaCl2, iM | 0 | 50 | 0 | 12,5 | 100 | 400 | 900 |
Tabell 1. Lösningar / buffertar för vuxen mus cardiomyocytes isolering.
| Namn | Company | Katalog # | Framställning | Förvaring |
| Fetalt bovint serum (FBS) | Atlanta Biolgoicals | S11550 | N / A | 25 ml alikvoter i sterila 50 ml rör vid -20 ° C. |
| Bovint serumalbumin (BSA) 100 mg / ml, 100x | Sigma | A7906 | 5 gi 50 ml DIH 2 O, sterila filter genom 0,22 ìm steril spruta filter | 5 ml alikvoter i sterila 15 ml rör vid -20 ° C. |
| CaCl2 100 mM, 100x | Sigma | C4901 | 0,555 g i 50 ml DIH 2 O, och sterilfilter med 0,22 ìm steril spruta filter | 10 ml alikvoter i sterila 15 ml rör vid rumstemperatur. |
| Laminin 1 mg / ml, 100x | Life technologies | 23017-015 | N / A | 200 | il alikvoter i sterila 0,5 ml mikrocentrifugrör vid -20 ° C. |
| 2,3-butandion monoxim (BDM) 500 mM, 50x | Sigma | B0753 | 1,01 g BDM i 20 ml DIH 2 O, sterilisera lösningen genom filtrering genom 0,22 ìm filter i huven. | lagra vid 4 ° C. |
| Adenosin-5'-trifosfat dinatrium salt (Na 2-ATP) 200 mM, 100x | Sigma | A6419 | Tillsätt 5 ml DIH 2 Oatt lösa upp 1 g Na-2-ATP i 50 ml centrifugrör och använd 2 mol / l NaOH för att justera pH till 7,2 och bringa den slutliga volymen till 9 ml med DIH 2 O. Sterilisera lösningen genom 0,22 fim sprutfilter. | 0,5 ml alikvoter i 1,5 ml sterila mikrocentrifugrör vid -20 ° C. |
| NaCl 3,77 M, 33.3x | Sigma | S7653 | 66 g i 300 ml DIH 2 O | lagra vid 4 ° C. |
| KCl 470 mM, 100x | Fisher Scientific | P217 | 3,5 g i 100 ml DIH 2 O | lagra vid 4 ° C. |
| KH 2 PO 4 60 mM, 100x | Sigma | P5379 | 0,82 g i 100 ml DIH 2 O | lagra vid 4 ° C. |
| Na 2 HPO 4 60 mM, 100x | Sigma | S0876 | 0,85 g i 100 ml DIH 2 O | lagra vid 4 ° C. |
| MgSO 4 120 mM, 100x | Sigma | M-1880 | 3 g i 100 ml DIH 2 O | lagra vid 4 ° C. |
| HEPES 1 M, 100x | Life technologies | 15630-080 | N / A | lagra vid 4 ° C. |
| NaHCOs 3 600 mM, 50x | Sigma | S6014 | 10,1 g i 200 ml DIH 2 O | lagra vid 4 ° C. |
| KHCO3 1 M, 100x | Fisher Scientific | P235 | 10,1 g i 100 ml DIH 2 O | lagra vid 4 ° C. |
| Fenolrött 3,2 mM, 100x | Sigma | P5530 | 0,12 g i 100 ml DIH 2 O | förvaras i rumstemperatur. |
Tabell 2. Stamlösning beredning och lagring för vuxen mus cardiomyocytes isolering och odling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
För den bästa förberedelsen, de mest kritiska stegen är: 1) omedelbart ansluter musen hjärta till kanylen efter excision; 2) lämplig hjärta perfusion. Observera också att vattenkvalitet, perfusion temperatur, pH buffert, sterilisering, kemisk renhet, och ren, icke-förorenad slangar och kammare är också viktiga faktorer. 18,2 mQ molekylärbiologi-grade H2O rekommenderas för buffert förberedelse. PH-värdet för 200 mM ATP stamlösning bör justeras till 7,2, ett steg som är lätt att missa.
Det är viktigt att snabbt identifiera aorta och skära strax under sin första filial som visas av Flynn 13. För effektiv hook-up, är en lämplig storlek rostfri kanyl med skåror och liten tandad kors klämma rekommenderas. Efter ligering, bör spetsen av kanylen vara ovanför aortaklaffen för att hjälpa den kollagenas fullt interagera med hjärtvävnad under kranskärlscirkulation. Ibland verkar cell avkastningen stora initialtmen många celler är runda formad efter det kalcium toleration steget. En förklaring är att koagulerat blod i kärlen inte kan tas bort helt från hjärtat, vilket leder till bristande matsmältning. En annan möjlighet är över matsmältningen av hjärtat. Långvarig exponering för kollagenas minskar myocyt kalcium-tolerans 2. Under dissociation och kalcium återinförande, är det också viktigt att hantera hjärtmuskelceller så skonsamt som möjligt för att bibehålla myocyt livskraft.
Sammanfattningsvis är vuxen cardiomyocyte kultur från genetiskt modifierade möss som ett kraftfullt verktyg för hjärtforskning. Dock bör det framtida arbetet ihåg den genetiska skillnaden mellan människor och gnagare vid tolkning av resultaten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande ekonomiska intressen.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av National Heart, Lung, and Blood Institute Grant HL-36573. Vi tackar David Sowa för att redigera detta manuskript.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Isolated heart system for small rodent | Harvard Apparatus | IHSR-mouse 73-4019 | |
| Aortic Cannula, OD 1.0 mm | Harvard Apparatus | 73-2816 | |
| Dumont #4 Forceps | Fine science tools | 11294-00 | |
| Straight sharp serrated scissors | Fine science tools | 14070-12 | |
| Serrated Graefe forceps | Fine science tools | 11050-10 | |
| Curved, serrated Graefe forceps | Fine science tools | 11052-10 | |
| Straight Mini Serrefines clamps | Fine science tools | 18054-28 | |
| MEM | Gibco | 11575-032 | |
| Collagenase II | Worthington | 4176 | |
| Mucosal universal detergent | Sigma | Z637181 | Mucasol is a fast alkaline residue-free detergent. |
References
- Louch, W. E., Sheehan, K. A., Wolska, B. M. Methods in cardiomyocyte isolation, culture, and gene transfer. J. Mol. Cell. 51, 288-298 (2011).
- Gross, D. R. Isolated heart preparations, problems, and pitfalls. In: Animal Models in Cardiovascular Research. Gross, D. R. , 3rd edition, Springer. 109-130 (2009).
- Schlüter, K. D., Piper, H. M. Isolation and culture of adult ventricular cardiomyocytes. Practical Methods in Cardiovascular Research. Dheim, S., Mohr, F. W., Delmar, M. , Springer. 557-567 (2005).
- O'Connell, T. D., Ni, Y. G., Lin, K. M., Han, H. P., Yan, Z. Isolation and culture of adult cardiac myocytes for signaling studies. AfCS research reports. 1 (5), 1-9 (2003).
- O'Connell, T. D., Rodrigo, M. C., Simpon, P. C. Isolation and culture of adult mouse cardiac myocytes. Methods in Molecular Biology. Vivanco, F. 35, Humana Press. 271-296 (2007).
- Nilolskaya, A., Sharma, V. Cell culture models and methods. Cardiac Electrophysiology Methods and Models. Sigg, D. C., Laizzo, P. S., Xiao, Y. F. , Springer. 213-235 (2010).
- Merx, M. W., Schrader, M. The working heart. Practical Methods in Cardiovascular Research. Dhein, S., Mohr, F. W., Delmar, M. , Springer-Verlag. Berlin Heidelberg, Germany. 173-189 (2005).
- Kabaeva, Z., Zhao, M., Michele, D. E. Blebbistatin extends culture life of adult mouse cardiac myocytes and allows efficient and stable transgene expression. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 294, 1667-1674 (2008).
- Lou, Q., Li, W., Efimov, I. R. The role of dynamic instability and wavelength in arrhythmia maintenance as revealed by panoramic imaging with blebbistatin vs. 2,3-butanedione monoxime. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 302, 262-269 (2012).
- Liu, C. X., et al. Reduction of Na/K-ATPase potentiates Marinobufagenin-induced cardiac dysfunction and myocyte apoptosis. J. Biol. Chem. 287 (20), 16390-16398 (2012).
- Bai, Y., et al. Different roles of the cardiac Na+/Ca2+-exchanger in ouabain-induced inotropy, cell signaling, and hypertrophy. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 304, 427-435 (2013).
- Liu, L. J., Zhao, X. C., Pierre, S. V., Askari, A. Association of PI3K-AKT signaling pathway with digitalis-induced hypertrophy of cardiac myocytes. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 293, 1489-1497 (2007).
- Flynn, J. M., Santana, L. F., Melov, S. Single Cell Transcriptional Profiling of Adult Mouse Cardiomyocytes. J. Vis. Exp. (58), (2011).
