Summary
Nous décrivons une méthode fiable pour l'isolement des cardiomyocytes de souris adultes. Ce protocole donne un résultat cohérent pour la culture des cardiomyocytes adultes fonctionnels à partir d'une variété de souris génétiquement modifiées.
Abstract
Les progrès technologiques ont fait des souris génétiquement modifiées, y compris les souris transgéniques et knock-out de gène, un outil essentiel dans de nombreux domaines de recherche. Cardiomyocytes adultes sont largement acceptés comme un bon modèle pour la physiologie cellulaire cardiaque et la physiopathologie, ainsi que de l'intervention pharmaceutique. Les souris génétiquement modifiées interdisent la nécessité de processus d'infection des cardiomyocytes complexes pour générer le génotype désiré, qui sont inefficaces en raison de la différenciation terminale des cardiomyocytes. Isolement et culture de haute qualité et de quantité des cardiomyocytes fonctionnels seront considérablement profit de la recherche cardiovasculaire et de fournir un outil important pour la recherche sur la transduction de la signalisation cellulaire et le développement de médicaments. Ici, nous décrivons une méthode bien établie pour l'isolement des cardiomyocytes de souris adultes qui peuvent être mises en œuvre avec peu de formation. Le cœur de la souris est excisé et une canule à un système de cœur isolé, alors perfusé avec un sans calcium et de haute potassium tampon suivie par collagénase de type II digestion en mode perfusion rétrograde de Langendorff. Ce protocole donne un résultat uniforme pour la collecte des cardiomyocytes fonctionnels de souris adulte à partir d'une variété de souris génétiquement modifiées.
Introduction
Les cardiomyocytes sont pas proliférative. Il existe certaines lignées de cellules cardiomyocytes auriculaires, telles que HL-1 et les cellules AT-1 dérivées de tumeurs de souris atriaux; cependant, il n'y a pas de lignées cellulaires de cardiomyocytes ventriculaires adultes disponibles pour la recherche. Cultures de cellules primaires de cardiomyocytes de souris adultes fournissent un modèle puissant pour la recherche cardiaque au niveau cellulaire et moléculaire. À ce jour, ils ont été largement utilisés pour biochimique, physiologique et pharmacologique recherche 1. En outre, l'utilisation fréquente de souris génétiquement modifiées a nécessité des méthodes efficaces d'isolement des cardiomyocytes. Culture pure permet des conditions libres de l'interaction avec d'autres organes et la circulation systémique, par exemple par des facteurs neuro-hormonaux et hormone-like endogènes 2,3. Cependant, l'isolement de succès des cardiomyocytes peut être difficile.
Le protocole que nous présentons ici sont basées sur nos expériences avec cardiomyocyt de rat adultees et la méthode décrite par O'Connell et al 4,5. Surtout en 2007 5, ils ont décrit des techniques détaillées à partir de préparations de tampons à la culture de cellules et analyse fonctionnelle. Etant donné que les myocytes de souris sont très sensibles à la contracture par rapport aux cardiomyocytes de rats, des tampons ou des milieux utilisés pour la perfusion, la digestion, la Ca 2 + tolérance, le placage et la culture dans le protocole de la souris sont complétées avec un inhibiteur de couplage excitation-contraction non spécifique, 2, 3 Butanedione monoxime (BDM) pour inhiber leur contraction spontanée, donc la viabilité et le rendement des myocytes en forme de tige d'améliorer de manière significative. Dans le protocole présenté ici, les myocytes sont séparées dans un tampon à haute teneur en potassium du coeur isolé par perfusion de Langendorff modifié avec de la collagénase de type II. Collagénase II rompt effectivement vers le bas la matrice intercellulaire et cellules libère. La solution de perfusion conserve également le métabolisme cellulaire à un faible niveau 6. En additi, le système cardiaque isolé de Harvard Apparatus, nous avons utilisé ici est bien conçu pour une température précise et un contrôle permanent de la pression 7. Cette approche fournit des préparations hautement reproductibles et des populations uniformes de type cellulaire unique, qui peut être utilisé dans la culture pendant une nuit pour la mesure de protéines de signalisation ou de la culture de 2-3 jours pour les dosages hypertrophiques cardiaques.
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Protocol
Toutes les recherches sur des souris a été fait selon les procédures et les lignes directrices des Instituts nationaux de la santé, et les protocoles ont été approuvés par le Comité institutionnel de protection et d'utilisation des animaux de l'Université de Toledo, Collège de médecine et de sciences de la vie.
1. Préparation système de perfusion
- La veille de l'isolement, de remplir le système de perfusion entier (y compris les réservoirs) avec une solution de détergent sans résidus alcaline rapide. Laisser la solution de pénétrer dans le système pendant quelques heures ou toute la nuit.
- Le lendemain matin, régler la température de cyclage thermique à 37 ° C et laissez la solution se réchauffer. Retirer la solution de détergent et rincer soigneusement le système avec de l'eau distillée stérilisée. Ne pas oublier toutes les branches latérales.
- Remplir le système de tampon de perfusion via une pompe péristaltique constante et d'en tirer les bulles d'air hors de la chambre de l'aorte (piège à bulles) avec une seringue latéral pour protégerau cœur de l'occlusion coronaire. Le débit de la pompe péristaltique de débit doit être vérifié régulièrement.
2. Préparation de tampons, milieux de culture, et plats
- Perfusion tampon: Faire 500 ml de tampon de perfusion 1x avant utilisation. Ce tampon sans calcium contient 113 mM de NaCl, 4,7 mM de KCl, 0,6 mM KH 2 PO 4, 0,6 mM Na 2 HPO 4, 1,2 mM MgSO 4, 10 mM de Na-HEPES, 12 mM NaHCO 3, 10 mM KHCO3, 0,032 phénol mM rouge, 30 mM taurine, mM BDM 10, et 5,5 mM de glucose. Ajuster le pH à 7,0 avec HCl 2 M et filtrer à travers un filtre de 0,2 um, conserver à 4 ° C.
Note: a) La solution de perfusion doit être préparé le jour même où elle est utilisée. Dans certains cas, il est acceptable pour stocker la solution pendant moins de 3 jours à 4 ° C. b) Ce tampon a une concentration élevée en potassium à 15,3 mM, qui peut garder les cardiomyocytes de repos, réduire ATP consommation et augmenter le Ca 2 + capacité tolérant. - Digestion Buffer (300 U / ml de 25-50 ml / coeur): préparer juste avant la perfusion. Peser 15 000 U de l'activité totale de collagénase de type II, dissoudre dans 50 ml de tampon de perfusion dans la culture capot. Ajouter 25 ul de 100 mM de CaCl2 (solution de stock, filtre stérilisé) pour rendre la concentration de calcium finale 50 uM. Réchauffer le tampon à 37 ° C lorsqu'il est prêt à l'isolement. Contrairement à la trypsine, la collagénase fonctionne mieux en présence de 50-100 pM Ca 2 +.
- Stop Buffer (50 ml / coeur): Utiliser la culture capot. Mélanger 45 ml de tampon de perfusion avec 5 ml de FBS stérile.
- Ca 2 + solution I (12,5 uM de Ca 2 +): Ajouter 2,5 pi de 100 mM de CaCl 2 à 20 ml de tampon d'arrêt et mélanger.
- Ca 2 + solution II (100 uM de Ca 2 +): Ajouter 10 ul de 100 mM de CaCl 2 à 10 ml de tampon d'arrêt et mélanger.
- Ca 2 + solution III (400 uM de Ca 2 +): Ajouter 40 ul de 100 mM de CaCl 2 à 10 ml de tampon d'arrêt et mélanger.
- Ca 2 + solution IV (900 uM de Ca 2 +): Ajouter 90 ul de 100 mM de CaCl 2 à 10 ml de tampon d'arrêt et mélanger.
- Placage moyen (50 ml / coeur): Transfert 43 ml de MEM contenant 2 mM de L-glutamine et 1,26 mM de CaCl2 dans un tube conique de 50 ml stérile dans la culture capot et ajouter 5 ml de FBS, 1 ml de solution stock BDM ( 500 mM, stérilisée par filtration), et 0,5 ml de pénicilline / streptomycine (10 000 U / ml). Mélanger et équilibrer pendant 2 à 3 heures avant l'isolement des myocytes dans 2% de CO2, 37 ° C incubateur avec les bouchons en vrac. Juste avant myocytes placage, ajouter 0,5 ml de 200 mM d'ATP (pH 7.2, solution de stock, filtre stérilisé) dans le milieu.
- Le milieu de culture (50 ml / coeur): Transfert de 48 ml de MEM contenant 2 mM de L-glutamine et 1,26 mM de CaCl2 dans un tube conique de 50 ml stérile dans la culture capot et ajouter 1 ml de solution stock BDM (500 mM, filter stérilisé), et 0,5 ml de pénicilline / streptomycine (10 000 U / ml). Mélanger et s'équilibrer dans 2% de CO2, 37 ° C incubateur avant l'isolement des myocytes. Avant l'utilisation, ajouter 0,5 ml de 100 mg / ml de BSA (filtre stérilisé) dans le milieu.
Remarque: L'utilisation d'un incubateur à CO2 de 2% facilite maintenant le milieu de culture à pH 6,9-7,0, ce qui aide les myoctyes conservent leur morphologie en forme de tige jusqu'à 24 h. - Laminine (1-2 mg / cm 2) plats revêtus ou plaques: Transfert 200 pi de 1 mg / ml de laminine de souris naturel à 20 ml de PBS stérile (w / o calcium et magnésium) et mélanger. Ajouter 1 ml de boîtes de 35 mm, 2,5 ml aux plats de 60 mm, ou 5 ml de plats de 100 mm, agiter pour couvrir uniformément les surfaces, et le lieu dans 2% de CO 2, 37 ° C incubateur jusqu'à myocytes placage.
Remarque: Si la vaisselle ou les plaques ne sont pas utilisés sur la journée couché, ils peuvent être scellés avec du Parafilm et conservés à 4 ° C pendant la nuit (de revêtement lent). L'étanchéité est requIRED pour éviter l'évaporation et la contamination. Des plaques revêtues peuvent être conservés à 4 ° C pendant 1 semaine.
3. Retrait de souris de coeur et Canulation
- Faire tremper les ciseaux et des pinces dans 70% d'éthanol pendant 30 minutes et laissez-les sécher.
- Peser la souris à 0,1 gramme près. Enregistrer son poids corporel, la souche, le sexe et la date de naissance.
- Injecter 200 ul de l'héparine (100 IU / souris) ip 10 min avant l'anesthésie pour empêcher la coagulation du sang dans les artères coronaires. Anesthésier les souris avec 200 mg / kg de poids corporel de kétamine et 10 mg / kg de poids corporel de xylazine par injection ip et attendre 5 à 10 min jusqu'à ce que la souris ne répond plus à pincées queue / d'orteil.
- Fixez la souris en position couchée en fixant délicatement les pattes de devant et pattes arrière sur une surface de travail pinnable (c.-à-styromousse) sur un plateau de chirurgie animale ou une table banc près le système de perfusion.
- Essuyez la poitrine et l'abdomen avec 70% d'éthanol. Faire une ligne médiane peau incision de la mi abdomen à la membrane avec une paire de ciseaux chirurgicaux.
- Couper le diaphragme avec un autre ciseaux chirurgicaux et maintenez le sternum avec des pinces dentelées courbes. Couper bilatérale et Retroflect cage thoracique pour exposer le coeur.
- Soulevez le coeur légèrement à l'aide de fines pinces dentelées et atraumatiques courbes et disséquer le cœur de la cavité thoracique aussi proche que possible de la paroi thoracique dorsale.
- Transférer le cœur à une boîte de 100 mm contenant un tampon de perfusion froide. Couper avec précaution loin les tissus conjonctifs tels que les poumons, le thymus, et des bronches.
- Identifier l'aorte et de ses branches crâniens, qui sont habituellement dissimulés par le thymus et coussinet adipeux. Coupez l'aorte en dessous de sa première branche 13, saisir la paroi aortique, soulever le cœur, et légèrement glisser sur la canule aortique de perfusion remplie de liquide (1,0 mm OD canule en acier inoxydable avec pointe émoussée / plat et encoches 1 et 2 mm au-dessus la pointe, ou une aiguille 22 G d'alimentation réutilisable) en utilisant deux ultra fine pointe forceps.
Remarque: a) Le liquide de perfusion doit être ruisselant pendant la canulation coeur pour empêcher les bulles de gaz de pénétrer dans les artères coronaires; b) Garder la pointe de la canule juste au-dessus de la valve aortique. - Fixer l'aorte à la canule et ligaturer l'aorte à la canule de soie 6-0 chirurgicale. L'ensemble canule devrait prendre moins de 120 secondes.
4. Coeur perfusion et digestion
- Perfuser le coeur avec le tampon de perfusion exempte de calcium à raison de 4 ml / min environ 4-5 min jusqu'à ce que les effluents deviennent claires, puis passer à un tampon de digestion contenant 50 uM CaCl2 et perfuser pour 3,5 à 20 min selon la souche de souris, la pression de perfusion et de l'activité de la collagénase. Le cas échéant, augmenter la pression de l'aorte à 70-80 mmHg lors de la digestion. Si nécessaire, enzyme de perfusion peut être recyclé pour la digestion. Typiquement, le tampon 300 U / ml d'enzyme va digérer un coeur en 10 à 12 min à un débit de 4 ml / min de débit;Si l'application de la pression de la post-charge à 70 mmHg, 300 U / ml auront seulement 3,5-5,5 min à une vitesse de 4 ml / min.
- Arrêtez la digestion quand le coeur devient légèrement pâle et flasque. Il devrait être spongieux lorsqu'on la pince doucement.
5. Cellules dissociation et de calcium réintroduction
- Tirez l'aorte de la canule avec 70% d'éthanol forceps trempé et mettre le cœur dans un plat stérile de 60 mm contenant 2,5 ml de tampon de digestion. Déplacer dans la hotte de culture en utilisant des fournitures stériles, rester conscient de techniques stériles pour cela et des mesures de suivi.
- Retirer aorte, oreillettes, et des gros vaisseaux avec des ciseaux chirurgicaux fines. Doucement taquiner le ventricule en 10-12 petits morceaux avec deux pinces à pointe fine.
- Pipette délicatement les morceaux de coeur et les cellules de haut en bas ~ 10x avec une pipette de transfert de 10 ml et transférer dans un tube conique en polypropylène de 15 ml. Rincer le plat avec 7,5 ml de solution de calcium I contenant 12,5 uM CaCl 2 et le transfertce dans le tube, résultant en un volume final de 10 ml.
- Pipette doucement la suspension de cellules de haut en bas à l'aide d'une pipette de transfert fine pointe pour disperser les gros morceaux de tissu cardiaque.
- Puis centrifuger pendant 3 min à 20 xg de séparer les petites cellules non-myocytes, tels que des cellules endotheliales et des fibroblastes.
- Aspirer le surnageant et remettre le culot de myocytes dans 10 ml de solution de calcium je avec un supplément de 100 pi de 200 mM d'ATP (pH 7.2, solution de stock, filtre stérilisé). Laisser le tube dans la hotte pour 3-5 min.
- Transfert dupliquer des aliquotes de 10 pi à un hématimètre pour compter les myocytes en forme de tige et rond. Calculer le nombre total de myocytes et de calculer le pourcentage de myocytes en forme de tige.
- Centrifuger les myocytes de 3 min à 20 x g. Enlever le surnageant et remettre en suspension les pastilles dans 10 ml calcium solution II contenant 100 uM CaCl 2. Disperser les myocytes avec la pointe fine pipette de transfert par aspirationde haut en bas.
- Répéter l'étape ci-dessus (5,8) en utilisant une solution de calcium III (400 uM de CaCl2) et IV (900 uM de CaCl2), respectivement.
- Pour la culture primaire des myocytes de la souris, remettre en suspension la pastille finale de myocytes dans 5 ml de milieu d'étalement. Compter le nombre total de myocytes et de calculer le pourcentage de myocytes en forme de tige.
6. Culture cellulaire
- Ajuster la concentration des myocytes en forme de tige à 25 000 en forme de tige myocytes / ml dans un tube de 50 ml. Pipette doucement les myocytes en utilisant une pipette de 10 ml pour les suspendre bien. Éviter la sédimentation des cellules dans la pipette et le tube pour assurer l'égalité de la densité cellulaire pour chaque plat ou une assiette.
- Après aspiration de la solution de revêtement de la laminine, plaquer les myocytes dans les plats ou assiettes. Faites glisser délicatement les plats ou assiettes à terme et trois à quatre fois en amont et secondaires à côté dans un motif en forme de croix sur la surface de la hotte de culture.
- Placez les plats ou assiettes dans un 2% de CO2 étuve à 37 ° C. Incuber pendant 1 à 3 heures pour permettre la fixation de myocytes à une vitesse d'environ 80%.
- Après fixation, aspirer doucement le milieu contenant les myocytes seules et les débris cellulaires. Ajouter doucement le milieu de culture pour les côtés des boîtes ou des plaques. Effectuer ce changement moyen un par un. Remettre immédiatement les plats ou assiettes à l'incubateur.
- Après O / N culture, les myocytes peuvent être modifiés dans le même milieu sans BDM avant que les études de la signalisation cellulaire à court terme. Gardez la BDM dans la culture à long terme pour les essais hypertrophiques ou apoptose.
Remarque: BDM (2,3-butanedione monoxime) peut inhiber la myosine-ATPase et de prévenir la contraction. Son inhibition de la contraction base myosine est facilement réversible. Il est rapporté que BDM peut avoir des effets secondaires potentiels, tels que agissant comme une phosphatase non spécifique, l'augmentation de la libération de calcium à partir de SR, et la modification de la concentration de calcium libre et prope électrique cellulaireles parties prenantes, donc avant le traitement, la BDM doit être supprimée. En outre, dans certains cas, un inhibiteur spécifique de la myosine II blebbistatin pourrait être un autre médicament pour inhiber la contraction des cardiomyocytes 8,9. Cependant, dans nos cas, BDM est mieux que blebbistatin pour le bien de la qualité et la quantité des cardiomyocytes.
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Representative Results
1. Isolation réussie Quantification
Deux critères sont utilisés pour quantifier le succès de l'isolation: d'abord, le nombre total des cardiomyocytes isolés, et d'autre part, le rapport des myocytes non tolérants au calcium tolérant pour arrondir en forme de tige. En général, ce protocole prend environ 75-90 min de l'enlèvement de coeur de myocytes placage et des rendements d'environ 1 million de cardiomyocytes en forme de tige (70-90% du total des myocytes récoltés) d'un coeur de souris adulte. Cela peut varier en fonction du poids corporel de la souris et la souche. Typiquement, 0,7-1,0 millions de myocytes en forme de tige peuvent être collectées à partir d'un ~ 25 g C57BL/6J souris, de 1,2 à 1.600.000 myocytes en forme de tige d'un ~ 35 g noir souris suisse, et de 0,7 à 1.200.000 myocytes en forme de tige peut être collectées à partir d'un g Na / K-ATPase hétérozygote ~ 30 (α1 S / R) 10 ou ~ 22 g cardiaque spécifique du NCX-souris KO 11. Myocytes isolés ont normalement une tige-forme distincte avec des extrémités rectangulaires et stries transversales claires,représenté sur la Figure 1.
2. Fonction de la cellule d'identification
Nos données précédentes ont clairement montré que, dans des cardiomyocytes de rat nouveau-né en culture, 100 uM ouabaïne peut activer la phosphorylation de Akt PI 3 K-dépendant et induire l'hypertrophie 12. Pour confirmer davantage les résultats dans les cardiomyocytes de souris adultes, les cardiomyocytes C57BL/6J des adultes de souris ont été cultivés et traités par l'ouabaïne. Figures 2 et 3 montrent clairement que l'ouabaïne peut augmenter la phosphorylation de Akt dans une manière dépendante de la dose et d'induire la [3 H]-leucine incorporation au cours de la synthèse des protéines.
Figure 1. Des cardiomyocytes en forme de tige normales de souris noir suisse après la nuitculture. myocytes ont été photographiés au microscope à contraste de phase en utilisant un logiciel de photo.
Figure 2. L'activation de Akt par l'ouabaïne dans des cardiomyocytes cultivés adultes de souris C57BL/6J. Myocytes ont été exposés à 0-50 uM ouabaïne pendant 5 min, et les lysats ont été analysés pour phosphorylée (Ser 473), d'Akt (p-Akt) et Akt par western blots. L'activation a été quantifiée comme rapport de phosphorylée totale Akt (n = 5-10). * P <0,05 par rapport au témoin, ** P <0,01 par rapport au témoin.
Figure 3. Ouabain stimule la synthèse des protéines dans les cardiomyocytes en culture adulte C57BL/6J de souris Après la privation de sérum de 4 heures, les myocytes ont été traités avec les conditions indiquées dans la présence ou l'absence de l'ouabaïne ou 100 nM ET-1 (contrôle positif) avec [3 H]. - leucine (1 pCi / ml) pendant 12 heures. Les lysats cellulaires ont été précipités avec 5% de TCA et remises en suspension dans 0,2 M NaOH/0.1% de SDS, et on compte la radioactivité dans un compteur à scintillation. La synthèse de protéine par échantillon a été calculée à cpm / mg de protéine et normalisée par rapport au contrôle.
| Solution / Tampon | Perfusion tampon | Digestion Buffer | Arrêtez tampon | Ca 2 + Solution je | Ca 2 + Solution II | Ca 2 + Solution III | Ca 2 + Solution IV |
| 113 | 113 | 113 | 113 | 113 | 113 | 113 | |
| KCl, mM | 4.7 | 4.7 | 4.7 | 4.7 | 4.7 | 4.7 | 4.7 |
| KH 2 PO 4, mM | 0,6 | 0,6 | 0,6 | 0,6 | 0,6 | 0,6 | 0,6 |
| Na 2 HPO 4, mM | 0,6 | 0,6 | 0,6 | 0,6 | 0,6 | 0,6 | 0,6 |
| MgSO4, mM | 1.2 | 1.2 | 1.2 | 1.2 | 1.2 | 1.2 | 1.2 |
| Na-HEPES, mM | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 |
| NaHCO 3, mM | 12 | 12 | 12 | 12 | 12 | 12 | 12 |
| KHCO3, mM | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 |
| Rouge de phénol, uM | 32 | 32 | 32 | 32 | 32 | 32 | 32 |
| Taurine, mM | 30 | 30 | 30 | 30 | 30 | 30 | 30 |
| BDM, mM | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 |
| Glucose, mM | 5.5 | 5.5 | 5.5 | 5.5 | 5.5 | 5.5 | 5.5 |
| FBS,% (v / v) | 0 | 0 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 |
| Collagénase II, mg / ml | 0 | 1 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| CaCl 2, uM | 0 | 50 | 0 | 12,5 | 100 | 400 | 900 |
Tableau 1. Solutions / tampons pour les cardiomyocytes de souris adultes isolement.
| Nom | Entreprise | Catalogue # | Préparation | Stockage |
| Sérum bovin fœtal (FBS) | Atlanta Biolgoicals | S11550 | N / A | 25 ml aliquotes dans des tubes stériles de 50 ml à -20 ° C. |
| Albumine de sérum bovin (BSA) à 100 mg / ml, 100x | Sigma | A7906 | 5 g dans 50 ml DIH 2 O, filtre stérile de 0,22 um seringue stérile filter | 5 ml aliquotes dans des tubes stériles de 15 ml à -20 ° C. |
| CaCl2 100 mM, 100x | Sigma | C4901 | 0,555 g dans 50 ml Dih 2 O, et le filtre stérile de 0,22 um filtre à seringue stérile | Aliquotes de 10 ml dans des tubes stériles de 15 ml à la température ambiante. |
| La laminine 1 mg / ml, 100x | Life Technologies | 23017-015 | N / A | Aliquotes de 200 pl dans 0,5 ml microtubes stériles à -20 ° C. |
| 2,3-Butanedione monoxime (BDM) 500 mM, 50x | Sigma | B0753 | 1,01 g dans 20 ml BDM diH 2 O, stériliser la solution par filtration sur filtre de 0,22 um dans le capot. | stocker à 4 ° C. |
| Adénosine-5'-triphosphate sel disodique (Na 2 ATP) 200 mM, 100x | Sigma | A6419 | Ajouter 5 ml diH 2 Opour dissoudre 1 g de Na 2-ATP dans 50 ml tube de centrifugation, puis d'utiliser NaOH 2 mol / l pour ajuster le pH à 7,2 et porter le volume final de 9 ml avec diH 2 O. stériliser la solution à travers le filtre de 0,22 um de seringue. | Aliquotes de 0,5 ml à 1,5 ml tubes à centrifuger stériles à -20 ° C. |
| NaCl 3,77 M, 33.3x | Sigma | S7653 | 66 g dans 300 ml diH 2 O | stocker à 4 ° C. |
| KCl 470 mM, 100x | Fisher Scientific | P217 | 3,5 g dans 100 ml diH 2 O | stocker à 4 ° C. |
| KH 2 PO 4 60 mM, 100x | Sigma | P5379 | 0,82 g dans 100 ml diH 2 O | stocker à 4 ° C. |
| Na 2 HPO 4 60 mM, 100x | Sigma | S0876 | 0,85 g dans 100 ml diH 2 O | stocker à 4 ° C. |
| MgSO 4 120 mM, 100x | Sigma | M-1880 | 3 g dans 100 ml diH 2 O | stocker à 4 ° C. |
| HEPES 1 M, 100x | Life Technologies | 15630-080 | N / A | stocker à 4 ° C. |
| NaHCO 3 600 mm, 50x | Sigma | S6014 | 10,1 g dans 200 ml diH 2 O | stocker à 4 ° C. |
| KHCO3 1 M, 100x | Fisher Scientific | P235 | 10,1 g dans 100 ml diH 2 O | stocker à 4 ° C. |
| Rouge de phénol 3,2 mM, 100x | Sigma | P5530 | 0,12 g dans 100 ml diH 2 O | stocker à température ambiante. |
Tableau 2. Stock préparation de la solution et de stockage pour la souris adulte cardiomyocytes isolement et la culture.
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Discussion
Pour la meilleure préparation, les étapes les plus importantes sont: 1) l'accrochage rapidement le cœur de la souris à la canule après l'excision; 2) la perfusion cardiaque approprié. Notez également que la qualité de l'eau, température de perfusion, le pH du tampon, la stérilisation, la pureté chimique, et propre, des tubes et des chambres non-contaminés sont également des facteurs importants. 18.2 mQ biologie moléculaire de qualité H 2 O est fortement recommandé pour la préparation de tampon. Le pH de la solution mère mM ATP 200 devrait être ajusté à 7,2, une étape qui est facilement manquée.
Il est essentiel d'identifier rapidement l'aorte et de couper juste au-dessous de sa première branche, comme indiqué par Flynn 13. Pour efficace hook-up, une canule en acier inoxydable de taille appropriée avec des encoches et petite croix dentelée pince est recommandé. Après ligature, la pointe de la canule doit être au-dessus de la valve aortique afin d'aider à la collagénase interagir pleinement avec le tissu cardiaque pendant la circulation coronaire. Parfois, le rendement cellulaire semble importante initialementmais de nombreuses cellules sont, après l'étape de tolérance de calcium de forme ronde. Une explication est que le sang coagulé dans les récipients peut ne pas être complètement retirée du coeur, ce qui conduit à la digestion inadéquate. Une autre possibilité est de plus de digestion du coeur. Une exposition prolongée à la collagénase réduit myocytes calcium tolérance 2. Au cours de la dissociation et la réintroduction de calcium, il est également important de manipuler les cardiomyocytes aussi doucement que possible pour maintenir la viabilité des myocytes.
En résumé, la culture des cardiomyocytes adultes de souris génétiquement modifiées est un outil puissant pour la recherche en cardiologie. Toutefois, les travaux futurs devraient garder à l'esprit la différence génétique entre les humains et les rongeurs lors de l'interprétation des résultats.
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Disclosures
Les auteurs déclarent qu'ils n'ont aucun intérêt financier concurrents.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par National Heart, Lung, and Blood Institute Grant HL-36573. Nous remercions M. David Sowa pour l'édition de ce manuscrit.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Isolated heart system for small rodent | Harvard Apparatus | IHSR-mouse 73-4019 | |
| Aortic Cannula, OD 1.0 mm | Harvard Apparatus | 73-2816 | |
| Dumont #4 Forceps | Fine science tools | 11294-00 | |
| Straight sharp serrated scissors | Fine science tools | 14070-12 | |
| Serrated Graefe forceps | Fine science tools | 11050-10 | |
| Curved, serrated Graefe forceps | Fine science tools | 11052-10 | |
| Straight Mini Serrefines clamps | Fine science tools | 18054-28 | |
| MEM | Gibco | 11575-032 | |
| Collagenase II | Worthington | 4176 | |
| Mucosal universal detergent | Sigma | Z637181 | Mucasol is a fast alkaline residue-free detergent. |
References
- Louch, W. E., Sheehan, K. A., Wolska, B. M. Methods in cardiomyocyte isolation, culture, and gene transfer. J. Mol. Cell. 51, 288-298 (2011).
- Gross, D. R. Isolated heart preparations, problems, and pitfalls. In: Animal Models in Cardiovascular Research. Gross, D. R. , 3rd edition, Springer. 109-130 (2009).
- Schlüter, K. D., Piper, H. M. Isolation and culture of adult ventricular cardiomyocytes. Practical Methods in Cardiovascular Research. Dheim, S., Mohr, F. W., Delmar, M. , Springer. 557-567 (2005).
- O'Connell, T. D., Ni, Y. G., Lin, K. M., Han, H. P., Yan, Z. Isolation and culture of adult cardiac myocytes for signaling studies. AfCS research reports. 1 (5), 1-9 (2003).
- O'Connell, T. D., Rodrigo, M. C., Simpon, P. C. Isolation and culture of adult mouse cardiac myocytes. Methods in Molecular Biology. Vivanco, F. 35, Humana Press. 271-296 (2007).
- Nilolskaya, A., Sharma, V. Cell culture models and methods. Cardiac Electrophysiology Methods and Models. Sigg, D. C., Laizzo, P. S., Xiao, Y. F. , Springer. 213-235 (2010).
- Merx, M. W., Schrader, M. The working heart. Practical Methods in Cardiovascular Research. Dhein, S., Mohr, F. W., Delmar, M. , Springer-Verlag. Berlin Heidelberg, Germany. 173-189 (2005).
- Kabaeva, Z., Zhao, M., Michele, D. E. Blebbistatin extends culture life of adult mouse cardiac myocytes and allows efficient and stable transgene expression. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 294, 1667-1674 (2008).
- Lou, Q., Li, W., Efimov, I. R. The role of dynamic instability and wavelength in arrhythmia maintenance as revealed by panoramic imaging with blebbistatin vs. 2,3-butanedione monoxime. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 302, 262-269 (2012).
- Liu, C. X., et al. Reduction of Na/K-ATPase potentiates Marinobufagenin-induced cardiac dysfunction and myocyte apoptosis. J. Biol. Chem. 287 (20), 16390-16398 (2012).
- Bai, Y., et al. Different roles of the cardiac Na+/Ca2+-exchanger in ouabain-induced inotropy, cell signaling, and hypertrophy. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 304, 427-435 (2013).
- Liu, L. J., Zhao, X. C., Pierre, S. V., Askari, A. Association of PI3K-AKT signaling pathway with digitalis-induced hypertrophy of cardiac myocytes. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 293, 1489-1497 (2007).
- Flynn, J. M., Santana, L. F., Melov, S. Single Cell Transcriptional Profiling of Adult Mouse Cardiomyocytes. J. Vis. Exp. (58), (2011).
