Summary
We beschrijven een betrouwbare methode voor het isoleren van volwassen muis hartspiercellen. Dit protocol geeft een consistent resultaat voor de cultuur van functionele volwassen hartspiercellen uit verschillende genetisch gemodificeerde muizen.
Abstract
Technologische vooruitgang heeft genetisch gemodificeerde muizen gemaakt, met inbegrip van transgene en knockout muizen, een essentieel instrument in veel onderzoeksgebieden. Volwassen hartspiercellen zijn algemeen aanvaard als een goed model voor hart cellulaire fysiologie en pathofysiologie, en voor farmaceutische interventie. Genetisch gemodificeerde muizen weg aan de behoefte aan ingewikkelde cardiomyocyte infectie processen om de gewenste genotype, die inefficiënt door terminale differentiatie hartspiercellen 'te genereren. Isolatie en cultuur van hoge kwaliteit en kwantiteit functionele cardiomyocyten zal drastisch profiteren cardiovasculair onderzoek en een belangrijk instrument voor cell signaling transductie onderzoek en ontwikkeling van geneesmiddelen. Hier beschrijven we een bekende methode voor het isoleren van volwassen muis hartspiercellen die met weinig training kan worden uitgevoerd. De muis hart is uitgesneden en gecanuleerde om een geïsoleerd hart systeem, dan perfusie met een calcium-vrije en hoge potassium buffer gevolgd door type II collagenase vertering in Langendorff retrograde perfusie modus. Dit protocol geeft een consistent resultaat voor het verzamelen van functionele volwassen muis hartspiercellen uit verschillende genetisch gemodificeerde muizen.
Introduction
Cardiomyocyten niet proliferatieve. Er zijn een aantal atriale cardiomyocyt cellijnen, zoals HL-1 en OP-1 cellen afkomstig van muizen atriale tumoren; er zijn echter geen volwassen ventriculaire cardiomyocyte cellijnen voor onderzoek beschikbaar. Primaire celculturen van volwassen muis hartspiercellen een krachtig model voor hart-onderzoek op cellulair en moleculair niveau. Tot op heden hebben zij uitgebreid gebruikt voor biochemische, fysiologische en farmacologische onderzoek 1. Bovendien, het veelvuldig gebruik van genetisch gemodificeerde muizen noodzakelijk doeltreffende methoden cardiomyocyt isolatie. Reincultuur maakt omstandigheden vrij van interactie met andere organen en de systemische circulatie, bijvoorbeeld door endogene neurohormonale en hormoonachtige factoren 2,3. Echter, succesvolle isolatie van hartspiercellen uitdaging zijn.
Het protocol we hierin stellen, is gebaseerd op onze ervaringen met volwassen rat cardiomyocytes en de door O'Connell et al. 4,5 methode. Vooral in 2007 5, beschreven ze gedetailleerde technieken uit buffer voorbereidingen om celcultuur en functionele test. Aangezien muis myocyten zijn zeer gevoelig voor contractuur opzichte van de cardiomyocyten van de rat, worden de buffers of media die voor de perfusie, spijsvertering, Ca 2 + tolerantie, plating en cultuur in de muis protocol aangevuld met een niet-specifieke excitatie-contractie koppeling remmer, 2, 3-butaandion monoxime (BDM) om hun spontane contractie remmen, vandaar de levensvatbaarheid en de opbrengst van staafvormige myocytes aanzienlijk verbeteren. In het protocol hier geïntroduceerd, worden de myocytes in een hoog kaliumgehalte buffer van het geïsoleerde hart gescheiden door gewijzigde Langendorff perfusie met collagenase type II. Collagenase II effectief breekt de intercellulaire matrix en releases cellen. De perfusie oplossing houdt ook cellulaire stofwisseling op een laag niveau 6. In additiop, het geïsoleerde hart systeem van Harvard Apparatus we hier gebruikt wordt is goed ontworpen voor een nauwkeurige temperatuur en constante druk 7. Deze benadering levert reproduceerbare preparaten en uniforme populaties van enkele celtype, dat kan worden gebruikt voor het meten nachtkweek signaaleiwitten of 2-3 dagen cultuur cardiale hypertrofische assays.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle onderzoek op muizen werd uitgevoerd volgens de procedures en richtlijnen van de National Institutes of Health, en de protocollen werden goedgekeurd door de Institutional Animal Care en gebruik Comite van de Universiteit van Toledo, College of Medicine and Life Sciences.
1. Perfusiesysteem Voorbereiding
- De dag voor isolatie, vul het hele perfusie-systeem (met inbegrip van reservoirs) met een oplossing van snelle alkalische residu-vrij wasmiddel. Laat de oplossing inwerken in het systeem voor een paar uur of een nacht.
- De volgende ochtend, stel de thermocycler temperatuur tot 37 ° C en laat de oplossing op te warmen. Verwijder het reinigingsmiddel en spoel het systeem grondig met gesteriliseerd gedestilleerd water. Vergeet niet alle zijtakken.
- Vul het systeem met perfusie buffer via een constante peristaltische pomp en trek eventuele luchtbellen uit de aorta kamer (bubble trap) met een aan de zijkant gemonteerde spuit te beschermenhet hart van coronaire occlusie. De stroomsnelheid van de peristaltische pomp moet regelmatig worden gecontroleerd.
2. Voorbereiding van Buffers, Cultuur Media en Gerechten
- Perfusie Buffer: Voeg 500 ml van 1x perfusie buffer vóór gebruik. Deze calciumvrije buffer bevat 113 mM NaCl, 4,7 mM KCl, 0,6 mM KH 2PO 4, 0,6 mM Na 2 HPO 4, 1,2 mM MgSO4, 10 mM Na-HEPES, 12 mM NaHCO 3, 10 mM KHCO3, 0.032 mM fenolrood, 30 mM taurine, 10 mM BDM en 5,5 mM glucose. Stel de pH op 7,0 met 2 M HCl en filtreer door een 0,2 um filter, bewaren bij 4 ° C.
Opmerking: a) De perfusie dient te worden bereid op dezelfde dag dat het wordt gebruikt. In sommige gevallen, is het aanvaardbaar om de oplossing minder dan 3 dagen bewaren bij 4 ° C. b) Deze buffer heeft een hoge kalium concentratie tot 15,3 mM, die de hartspiercellen kunnen houden in rust, verminderen ATP consumption en verhoging van Ca 2 +-tolerant vermogen. - Digestion Buffer (300 E / ml, 25-50 ml / hart): net voor het perfusie. Weeg 15.000 E van de totale activiteit van het type II collagenase, los op in 50 ml perfusiebuffer in cultuur kap. Voeg 25 ul van 100 mM CaCl2 (voorraadoplossing, filter gesteriliseerd) bij de uiteindelijke calciumconcentratie maken 50 uM. Verwarm de buffer tot 37 ° C, wanneer klaar voor isolatie. Unlike trypsine, collagenase werkt het best in aanwezigheid van 50-100 uM Ca2 +.
- Stop Buffer (50 ml / hart): Gebruik in cultuur kap. Meng 45 ml van de perfusie buffer met 5 ml steriel FBS.
- Ca 2 +-oplossing (12,5 uM Ca2 +): Voeg 2,5 ul van 100 mM CaCl2 aan 20 ml stopbuffer en meng.
- Ca 2 +-II-oplossing (100 uM Ca2 +) Voeg 10 ul van 100 mM CaCl2 aan 10 ml stopbuffer en meng.
- Ca 2 +-oplossing III (400 uM Ca 2 +): Voeg 40 ul van 100 mM CaCl2 aan 10 ml stopbuffer en meng.
- Ca 2 +-oplossing IV (900 uM Ca2 +) Voeg 90 ul van 100 mM CaCl2 aan 10 ml stopbuffer en meng.
- Plating medium (50 ml / hart): Overdracht 43 ml MEM met 2 mM L-glutamine en 1,26 mM CaCl2 in een steriele 50 ml conische buis in cultuur kap en voeg 5 ml van FBS, 1 ml van BDM stockoplossing ( 500 mM, filter gesteriliseerd) en 0,5 ml penicilline / streptomycine (10.000 E / ml). Mix en evenwicht voor 2-3 uur voorafgaand aan myocyte isolatie in 2% CO 2, 37 ° C incubator met de doppen los. Vlak voor myocyte plating, voeg 0,5 ml 200 mM ATP (pH 7,2, stock oplossing, filter gesteriliseerd) in het medium.
- Kweekmedium (50 ml / hart): Overdracht 48 ml MEM met 2 mM L-glutamine en 1,26 mM CaCl2 in een steriele 50 ml conische buis in cultuur kap en voeg 1 ml van BDM voorraad oplossing (500 mM, filter gesteriliseerd) en 0,5 ml penicilline / streptomycine (10.000 E / ml). Meng en evenwicht in 2% CO2, 37 ° C incubator voor myocyten geïsoleerd. Voor gebruik wordt 0,5 ml 100 mg / ml BSA (filter gesteriliseerd) in het medium.
Opmerking: het gebruik van een 2% CO2 incubator vergemakkelijkt handhaving het kweekmedium pH 6,9-7,0, die helpt de myoctyes behouden hun staafvormige morfologie tot 24 uur. - Laminine (1-2 ug / cm 2) beklede borden of schalen: Overdracht 200 ul van 1 mg / ml natuurlijke muis laminine tot 20 ml gesteriliseerde PBS (w / o calcium en magnesium) en meng. Voeg 1 ml tot 35-mm gerechten, 2,5 ml tot 60-mm gerechten, of 5 ml tot 100-mm gerechten, schud gelijkmatig bedekken de oppervlakken, en plaats in 2% CO 2, 37 ° C incubator totdat myocyte plating.
Opmerking: Als de borden of schalen niet worden gebruikt op de dag bekleed, kunnen worden gesloten met Parafilm en bij 4 ° C gedurende de nacht (Slow Coating). Afdichting is required verdamping en besmetting te voorkomen. Gecoate platen bij 4 ° C worden bewaard tot 1 week.
3. Mouse Hart Verwijderen en Canulatie
- Week de schaar en pincet in 70% ethanol gedurende 30 minuten en laat ze drogen.
- Weeg de muis tot op 0,1 gram. Noteer zijn lichaamsgewicht, stam, hetzelfde geslacht en geboortedatum.
- Injecteer 200 ul heparine (100 IU / muis) ip 10 min voor anesthesie coagulatie van bloed in de coronaire slagaders. Verdoven van de muis met 200 mg / kg lichaamsgewicht van ketamine en 10 mg / kg lichaamsgewicht van xylazine door ip injectie en wacht 5-10 minuten totdat de muis reageert tot staart / teen wringt.
- Zet de muis in rugligging door voorzichtig de vaststelling van de voorpoten en achterpoten van een Speldbaar werkvlak (bijv. piepschuim) op een dier operatie lade of tafel bankje in de buurt van de perfusie-systeem.
- Veeg de borst en de buik met 70% ethanol. Maak een middellijn huid incision van half buik om het membraan met een chirurgische schaar.
- Snijd het membraan met een andere chirurgische schaar en houd het borstbeen met gebogen gekartelde tang. Knip bilateraal en retroflect borstkas naar het hart bloot te leggen.
- Til het hart licht met behulp van fijne gebogen gekartelde en atraumatische pincet en ontleden het hart uit de borstholte zo dicht mogelijk bij de dorsale thoraxwand.
- Breng het hart om een 100-mm schotel met koude perfusie buffer. Zorgvuldig knippen van weg het bindweefsel, zoals longen, thymus, en de bronchiën.
- Identificeer de aorta en zijn schedel-takken, die meestal verborgen door thymus en vet pad. Snijd de aorta hieronder zijn eerste filiaal 13, pakt de aorta, til het hart, en iets glijden op de perfusie vloeistof gevulde aorta canule (1,0 mm OD roestvrij stalen canule met stompe / platte tip en inkepingen 1 en 2 mm boven de tip, of een 22 G herbruikbare voedingsnaald) met behulp van twee ultra fine-tip forceps.
Opmerking: a) de perfusievloeistof te druipen tijdens hart canule te voorkomen dat gasbellen uit het invoeren van de kransslagaders; b) houden de punt van de canule boven de aortaklep. - Klem de aorta aan de canule en de aorta ligeren aan de canule met 6-0 chirurgische zijde. De gehele canule moet minder dan 120 seconden duren.
4. Hart perfusie en de spijsvertering
- Perfuseren het hart met calciumvrije perfusie buffer bij stroomsnelheid van 4 ml / min 4-5 min tot de effluenten duidelijk worden, daarna naar digestie buffer die 50 uM CaCl2 en perfuseren van 3,5-20 min afhankelijk muizenstam, perfusiedruk en collagenase activiteit. Indien van toepassing, verhogen de aorta druk tot 70-80 mmHg bij het verteren. Indien nodig kan enzym perfusaat worden gerecirculeerd voor de spijsvertering. Meestal zal 300 U / ml enzym buffer hart verteren 10-12 minuten bij een stroomsnelheid van 4 ml / min;Bij het aanbrengen afterload druk bij 70 mmHg, zal 300 U / ml uitsluitend 3,5-5,5 min opbrengst bij een stroomsnelheid van 4 ml / min.
- Stop de spijsvertering wanneer het hart wordt iets bleek en slap. Het moet sponsachtig zijn wanneer zachtjes geknepen.
5. Cellen dissociatie en Calcium herintroductie
- Trek de aorta van de canule met 70%-ethanol gedrenkte tang en zet het hart in een steriele 60-mm schotel met 2,5 ml buffer spijsvertering. Verplaatsen in de cultuur kap met behulp van steriele hulpmiddelen, blijven bewust van steriele technieken voor dit en vervolgstappen.
- Verwijder aorta, atria en grote vaten met fijne chirurgische schaar. Zachtjes plagen de hartkamer in 10-12 kleine stukjes met twee fijne tip pincet.
- Voorzichtig pipet het hart stukken en cellen op en neer ~ 10x met een 10-ml pipet en vervolgens over te dragen aan een 15 ml polypropyleen conische buis. Spoel de schotel met 7,5 ml calcium-oplossing I met 12,5 uM CaCl2 en overdrachtdit in de buis, waardoor een eindvolume van 10 ml.
- Voorzichtig pipet de celsuspensie op en neer met een fijn-tip transferpipet om de grote stukken van hartweefsel verspreiden.
- Centrifugeer gedurende 3 min bij 20 xg te scheiden van kleine niet-cardiomyocyt cellen zoals endotheelcellen en fibroblasten.
- Zuig het supernatant en resuspendeer de myocyte pellet in 10 ml calcium oplossing die ik met een supplement van 100 ul van 200 mM ATP (pH 7,2, stock oplossing, filter gesteriliseerd). Laat de buis in de kap voor 3-5 minuten.
- Overdracht dupliceren 10 ul aliquots een hemacytometer om staafvormig en rond myocyten tellen. Bereken het totale aantal myocyten en bereken het percentage staafvormige myocyten.
- Centrifugeer de myocyten gedurende 3 min bij 20 x g. Verwijder het supernatant en resuspendeer de pellets in 10 ml calciumoplossing II die 100 uM CaCl2. Verspreiden de myocytes met de fine-tip transferpipet door pipetterenop en neer.
- Herhaal de bovenstaande stap (5.8) met calcium oplossing III (400 uM CaCl2) en IV (900 uM CaCl2), respectievelijk.
- Voor muis myocyte primaire cultuur, resuspendeer de laatste myocyte pellet in 5 ml plating medium. Tel het aantal myocyten en bereken het percentage staafvormige myocyten.
6. Celkweek
- Stel de concentratie van staafvormige myocyten 25.000 staafvormige myocyten / ml in een 50 ml buisje. Voorzichtig pipet de myocytes met een pipet van 10 ml om ze goed op te schorten. Vermijd cel sedimentatie in de pipet en de buis op gelijke celdichtheid voor elk gerecht of plaat te garanderen.
- Na het opzuigen van de laminin coating oplossing, plaat de myocytes in die borden of schalen. Schuif de borden of schalen vooruit en achteruit en side-to-side in een kruisvormige patroon drie tot vier keer het oppervlak van de cultuur kap.
- De schaaltjes of platen in een 2% CO2 incubator bij 37 ° C. Incubeer gedurende 1-3 uur tot myocyte attachment dat bij een snelheid van ongeveer 80%.
- Na bevestiging, Zuig voorzichtig uit het medium met losse myocytes en celresten. Voeg voorzichtig kweekmedium aan de zijkanten van de borden of schalen. Voer deze medium verandering op een rijtje. Onmiddellijk terug de borden of schalen in de broedstoof.
- Na O / N cultuur, kan de myocytes worden veranderd in hetzelfde medium zonder BDM voor studies van korte termijn cell signaling. Houd de BDM in lange termijn de cultuur voor hypertrofische of apoptose assays.
Opmerking: BDM (2,3-butaandion monoxime) kan de myosine-ATPase te remmen en krimp te voorkomen. De remming van myosine gebaseerde contractie is gemakkelijk omkeerbaar. Er is gemeld dat BDM sommige potentiële bijwerkingen, zoals als een niet-specifieke fosfatase, calcium toenemende afgifte van SR en wijziging vrije calciumconcentratie en cellulaire elektrische prope wellichtrties, dus voordat de behandeling, de BDM moeten worden verwijderd. Bovendien, in sommige gevallen, een specifiek myosine II inhibitor Blebbistatin zou een alternatief geneesmiddel voor cardiomyocyten krimp 8,9 remmen. In ons geval BDM beter dan Blebbistatin omwille van de kwaliteit en kwantiteit van de cardiomyocyten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
1. Succesvolle isolatie Kwantificering
Twee criteria worden gebruikt om het succes van de isolatie kwantificeren: eerst, het totale aantal cardiomyocyten geïsoleerd, en anderzijds de verhouding van staafvormige calcium-tolerant ronde niet-tolerante myocyten. Over het algemeen dit protocol duurt ongeveer 75-90 minuten van hart verhuizing naar myocyte plating en levert ongeveer 1 miljoen staafvormige hartspiercellen (70-90% van de totale geoogste myocytes) van een volwassen muis hart. Deze kunnen variëren met muis lichaamsgewicht en zeef. Meestal kan 0,7-1,0 miljoen staafvormige myocytes worden verzameld uit een ~ 25 g C57BL/6J muis, 1,2-1.600.000 staafvormige myocyten van een ~ 35 g zwarte Zwitserse muis, en 0,7-1.200.000 staafvormige myocytes kan worden verzameld uit een ~ 30 g Na / K-ATPase heterozygote (α1 S / R) 10 of ~ 22 g cardiaal specifiek NCX-KO muis 11. Geïsoleerde myocytes hebben doorgaans een duidelijke staaf-vorm met rechthoekige uiteinden en duidelijke cross-strepen,Figuur 1.
2. Cell Functie Identificatie
Onze eerdere gegevens hebben duidelijk aangetoond dat in gekweekte neonatale cardiomyocyten van de rat, kan 100 uM ouabain activeren PI 3 K-afhankelijke Akt fosforylering en induceren hypertrofie 12. Om deze resultaten volwassen muis hartspiercellen verder te bevestigen, volwassen hartspiercellen C57BL/6J muizen werden gekweekt en behandeld met ouabain. Figuren 2 en 3 tonen duidelijk dat ouabaïne Akt fosforylering kan nemen op een dosis-afhankelijke wijze en induceren [3H]-leucine incorporatie tijdens eiwitsynthese.
Figuur 1. Normal staafvormige hartspiercellen van Black Zwitserse muis na een nachtcultuur. Myocyten werden gefotografeerd onder fasecontrastmicroscopie gebruik fotosoftware.
Figuur 2. Activering van Akt door ouabain in gekweekte volwassen hartspiercellen C57BL/6J muizen. Myocyten werden blootgesteld aan 0,50 uM ouabaïne gedurende 5 min, en lysaten werden geanalyseerd op gefosforyleerd (Ser 473) Akt (Akt-p) en Akt door westerse blots. Activering werd gekwantificeerd als verhouding van de totale gefosforyleerde Akt (n = 5-10). * P <0,05 versus controle, ** p <0,01 versus controle.
Figuur 3. Ouabain stimuleert de eiwitsynthese in gekweekte volwassen hartspiercellen C57BL/6J muizen na 4 uur serumdeprivatie, myocyten werden behandeld met de aangegeven omstandigheden in aanwezigheid of afwezigheid van ouabain of 100 nM ET-1 (positieve controle) met [3 H]. - leucine (1 uCi / ml) gedurende 12 uur. Cellulaire lysaten werden geprecipiteerd met 5% TCA en opnieuw gesuspendeerd in 0,2 M NaOH/0.1% SDS, en de radioactiviteit werd geteld in een scintillatieteller. De eiwitsynthese per monster werd berekend / mg eiwit en genormaliseerd ten opzichte van de controle cpm.
| Oplossing / Buffer | Perfusiebuffer | Digestion Buffer | Stop buffer | Ca 2 + Solution I | Ca 2 + Solution II | Ca 2 + Solution III | Ca 2 + Solution IV |
| 113 | 113 | 113 | 113 | 113 | 113 | 113 | |
| KCl, mM | 4.7 | 4.7 | 4.7 | 4.7 | 4.7 | 4.7 | 4.7 |
| KH 2 PO 4, mM | 0.6 | 0.6 | 0.6 | 0.6 | 0.6 | 0.6 | 0.6 |
| Na 2 HPO 4 mM | 0.6 | 0.6 | 0.6 | 0.6 | 0.6 | 0.6 | 0.6 |
| MgSO4 mM | 1.2 | 1.2 | 1.2 | 1.2 | 1.2 | 1.2 | 1.2 |
| Na-HEPES, mM | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 |
| NaHCO3 mM | 12 | 12 | 12 | 12 | 12 | 12 | 12 |
| KHCO3, mM | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 |
| Fenolrood, uM | 32 | 32 | 32 | 32 | 32 | 32 | 32 |
| Taurine, mM | 30 | 30 | 30 | 30 | 30 | 30 | 30 |
| BDM, mM | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 |
| Glucose, mM | 5.5 | 5.5 | 5.5 | 5.5 | 5.5 | 5.5 | 5.5 |
| FBS,% (v / v) | 0 | 0 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 |
| Collagenase II mg / ml | 0 | 1 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| CaCl2, uM | 0 | 50 | 0 | 12.5 | 100 | 400 | 900 |
Tabel 1. Oplossingen / buffers voor volwassen muis hartspiercellen isolatie.
| Naam | Vennootschap | Catalog # | Voorbereiding | Opslagruimte |
| Foetaal runderserum (FBS) | Atlanta Biolgoicals | S11550 | N / A | 25 ml porties in steriele 50 ml buizen bij -20 ° C. |
| Bovine serum albumine (BSA) 100 mg / ml, 100x | Sigma | A7906 | 5 g in 50 ml DiH 2 O, steriele filter door 0,22 urn steriele spuit filter | 5 ml aliquots in steriele 15 ml buizen bij -20 ° C. |
| CaCl2 100 mM, 100x | Sigma | C4901 | 0.555 g in 50 ml DiH 2 O, en steriele filter door 0,22 um steriele spuit filter | 10 ml porties in steriele 15 ml buizen bij kamertemperatuur. |
| Laminine 1 mg / ml, 100x | Life-technologieën | 23017-015 | N / A | 200 ul aliquots in steriele 0,5 ml microcentrifuge buisjes bij -20 ° C. |
| 2,3-butaandion monoxime (BDM) 500 mm, 50x | Sigma | B0753 | 1,01 g BDM in 20 ml DiH 2 O, steriliseren van de oplossing door te filteren door 0,22 um filter in capuchon. | bewaren bij 4 ° C. |
| Adenosine-5'-trifosfaat dinatriumzout (Na 2-ATP) 200 mm, 100x | Sigma | A6419 | 5 Voeg ml DIH 2 Otot 1 g Na2-ATP in 50 ml centrifugebuis lossen, vervolgens 2 mol / l NaOH om de pH op 7,2 te brengen en het eindvolume tot 9 ml met DIH 2 O. Steriliseer de oplossing door 0,22 pm spuitfilter. | 0,5 ml porties in 1,5 ml steriele microcentrifuge buisjes bij -20 ° C. |
| NaCl 3,77 M, 33.3x | Sigma | S7653 | 66 g in 300 ml DIH 2 O | bewaren bij 4 ° C. |
| KCl 470 mM, 100x | Fisher Scientific | P217 | 3,5 g in 100 ml DIH 2 O | bewaren bij 4 ° C. |
| KH 2PO 4 60 mM, 100x | Sigma | P5379 | 0,82 g in 100 ml DIH 2 O | bewaren bij 4 ° C. |
| Na 2 HPO 4 60 mM, 100x | Sigma | S0876 | 0,85 g in 100 ml DIH 2 O | bewaren bij 4 ° C. |
| MgSO4 120 mm, 100x | Sigma | M-1880 | 3 g in 100 ml DIH 2 O | bewaren bij 4 ° C. |
| HEPES 1 M, 100x | Life-technologieën | 15630-080 | N / A | bewaren bij 4 ° C. |
| NaHCO3 600 mM, 50x | Sigma | S6014 | 10,1 g in 200 ml DIH 2 O | bewaren bij 4 ° C. |
| KHCO3 1 M, 100x | Fisher Scientific | P235 | 10,1 g in 100 ml DIH 2 O | bewaren bij 4 ° C. |
| Fenolrood 3,2 mm, 100x | Sigma | P5530 | 0,12 g in 100 ml DIH 2 O | bewaren bij kamertemperatuur. |
Tabel 2. Stamoplossing bereiding en de opslag voor volwassen muis hartspiercellen isolatie en cultuur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Voor de beste voorbereiding, de meest kritische stappen: 1) direct aansluiten van de muis hart naar de canule na excisie; 2) passende hart perfusie. Merk ook op dat de waterkwaliteit, perfusie temperatuur, pH buffer, sterilisatie, chemische zuiverheid en schone, niet-verontreinigde buizen en kamers zijn ook belangrijke factoren. 18.2 mQ moleculaire biologie-grade H 2 O wordt sterk aanbevolen voor buffer voorbereiding. De pH van 200 mM ATP voorraadoplossing worden ingesteld op 7,2, een stap die gemakkelijk gemist.
Het is essentieel om snel de aorta en juist onder de eerste tak zoals door Flynn 13. Voor het efficiënt hook-up, een voldoende omvang roestvrijstalen canule met inkepingen en kleine gekartelde kruis klem worden aanbevolen. Na ligatie moet de punt van de canule boven de aortaklep om te helpen de collagenase volledige interactie met hartweefsel tijdens coronaire circulatie. Soms is de celopbrengst lijkt groot aanvankelijkmaar veel cellen zijn ronde vorm na de calcium tolerantie stap. Een verklaring is dat gecoaguleerd bloed in de vaten niet volledig kunnen worden verwijderd uit het hart, wat leidt tot onvoldoende digestie. Een andere mogelijkheid is via digestie van het hart. Langdurige blootstelling aan collagenase vermindert myocyte calcium-tolerantie 2. Tijdens dissociatie en calcium herintroductie, is het ook belangrijk om de cardiomyocyten zo voorzichtig mogelijk myocyten levensvatbaarheid behouden behandelen.
Samengevat, volwassen cardiomyocyte cultuur van genetisch gemodificeerde muizen is een krachtig hulpmiddel voor hartonderzoek. Toch moet de toekomstige werkzaamheden rekening houden met de genetische verschil tussen mensen en knaagdieren bij het interpreteren van de resultaten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door de National Heart, Lung, and Blood Institute Grant HL-36573. Wij danken de heer David Sowa voor het bewerken van dit manuscript.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Isolated heart system for small rodent | Harvard Apparatus | IHSR-mouse 73-4019 | |
| Aortic Cannula, OD 1.0 mm | Harvard Apparatus | 73-2816 | |
| Dumont #4 Forceps | Fine science tools | 11294-00 | |
| Straight sharp serrated scissors | Fine science tools | 14070-12 | |
| Serrated Graefe forceps | Fine science tools | 11050-10 | |
| Curved, serrated Graefe forceps | Fine science tools | 11052-10 | |
| Straight Mini Serrefines clamps | Fine science tools | 18054-28 | |
| MEM | Gibco | 11575-032 | |
| Collagenase II | Worthington | 4176 | |
| Mucosal universal detergent | Sigma | Z637181 | Mucasol is a fast alkaline residue-free detergent. |
References
- Louch, W. E., Sheehan, K. A., Wolska, B. M. Methods in cardiomyocyte isolation, culture, and gene transfer. J. Mol. Cell. 51, 288-298 (2011).
- Gross, D. R. Isolated heart preparations, problems, and pitfalls. In: Animal Models in Cardiovascular Research. Gross, D. R. , 3rd edition, Springer. 109-130 (2009).
- Schlüter, K. D., Piper, H. M. Isolation and culture of adult ventricular cardiomyocytes. Practical Methods in Cardiovascular Research. Dheim, S., Mohr, F. W., Delmar, M. , Springer. 557-567 (2005).
- O'Connell, T. D., Ni, Y. G., Lin, K. M., Han, H. P., Yan, Z. Isolation and culture of adult cardiac myocytes for signaling studies. AfCS research reports. 1 (5), 1-9 (2003).
- O'Connell, T. D., Rodrigo, M. C., Simpon, P. C. Isolation and culture of adult mouse cardiac myocytes. Methods in Molecular Biology. Vivanco, F. 35, Humana Press. 271-296 (2007).
- Nilolskaya, A., Sharma, V. Cell culture models and methods. Cardiac Electrophysiology Methods and Models. Sigg, D. C., Laizzo, P. S., Xiao, Y. F. , Springer. 213-235 (2010).
- Merx, M. W., Schrader, M. The working heart. Practical Methods in Cardiovascular Research. Dhein, S., Mohr, F. W., Delmar, M. , Springer-Verlag. Berlin Heidelberg, Germany. 173-189 (2005).
- Kabaeva, Z., Zhao, M., Michele, D. E. Blebbistatin extends culture life of adult mouse cardiac myocytes and allows efficient and stable transgene expression. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 294, 1667-1674 (2008).
- Lou, Q., Li, W., Efimov, I. R. The role of dynamic instability and wavelength in arrhythmia maintenance as revealed by panoramic imaging with blebbistatin vs. 2,3-butanedione monoxime. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 302, 262-269 (2012).
- Liu, C. X., et al. Reduction of Na/K-ATPase potentiates Marinobufagenin-induced cardiac dysfunction and myocyte apoptosis. J. Biol. Chem. 287 (20), 16390-16398 (2012).
- Bai, Y., et al. Different roles of the cardiac Na+/Ca2+-exchanger in ouabain-induced inotropy, cell signaling, and hypertrophy. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 304, 427-435 (2013).
- Liu, L. J., Zhao, X. C., Pierre, S. V., Askari, A. Association of PI3K-AKT signaling pathway with digitalis-induced hypertrophy of cardiac myocytes. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 293, 1489-1497 (2007).
- Flynn, J. M., Santana, L. F., Melov, S. Single Cell Transcriptional Profiling of Adult Mouse Cardiomyocytes. J. Vis. Exp. (58), (2011).
