Summary
نحن تصف طريقة موثوق بها لعزل العضلية الماوس الكبار. هذا البروتوكول تعطي نتيجة متسقة لثقافة الكبار العضلية وظيفية من مجموعة متنوعة من الفئران المعدلة وراثيا.
Abstract
جعلت التطورات التكنولوجية الفئران المعدلة وراثيا، بما في ذلك المعدلة وراثيا والفئران خروج المغلوب الجينات، وأداة أساسية في العديد من المجالات البحثية. تحظى بقبول واسع العضلية الكبار كنموذج جيد للالفيزيولوجيا الخلوية القلب والفيزيولوجيا المرضية، فضلا عن التدخل الصيدلانية. الفئران المعدلة وراثيا يحول دون الحاجة إلى عمليات العدوى cardiomyocyte معقدة التركيب الوراثي لتوليد المرجوة، والتي هي غير فعالة نظرا لتمايز محطة العضلية. سوف العزلة وثقافة كمية عالية الجودة والعضلية وظيفية تستفيد بشكل كبير بحوث القلب والأوعية الدموية، وتوفير أداة مهمة للإشارة الخلية البحوث والتنمية تنبيغ المخدرات. هنا، نحن تصف طريقة راسخة لعزل العضلية الماوس الكبار التي يمكن تنفيذها مع قليل من التدريب. يتم استئصاله قلب الفأر ومقنى إلى نظام القلب معزولة، ثم مع perfused ع خالية من الكالسيوم وعاليةotassium العازلة تليها النوع الثاني كولاجيناز الهضم في وضع Langendorff نضح الوراء. هذا البروتوكول تعطي نتيجة متسقة لجمع الوظيفية العضلية الماوس الكبار من مجموعة متنوعة من الفئران المعدلة وراثيا.
Introduction
العضلية ليست التكاثري. هناك بعض خطوط الخلايا cardiomyocyte الأذيني، مثل HL-1 و AT-1 الخلايا المشتقة من الأورام الأذيني الماوس؛ ومع ذلك، لا توجد البطين الكبار cardiomyocyte خطوط الخلايا المتاحة للبحوث. مزارع الخلايا العضلية الأولية من الماوس الكبار تقدم نموذجا قويا للأبحاث القلب على المستويات الخلوية والجزيئية. حتى الآن، كانت قد استخدمت على نطاق واسع لالبيوكيميائية والفسيولوجية والدوائية والبحوث 1. بالإضافة إلى ذلك، فإن الاستخدام المتكرر من الفئران المعدلة وراثيا وقد استلزم أساليب فعالة من cardiomyocyte العزلة. يسمح ثقافة نقية لظروف خالية من التفاعل مع أجهزة أخرى والدوران الجهازي، مثل من خلال العوامل الهرمونية العصبية والهرمونات مثل الذاتية 2،3. ومع ذلك، والعزلة الناجح العضلية يمكن أن يكون تحديا.
ويستند البروتوكول ونحن نقدم هنا على تجاربنا مع cardiomyocyt الفئران الكباروفاق وطريقة وصفها أوكونيل وآخرون 4،5. وخاصة في عام 2007 5، وصفوه تقنيات مفصل من الاستعدادات عازلة لزراعة الخلايا وفحص وظيفية. منذ myocytes الماوس هي عرضة للانكماش مقارنة العضلية الفئران، وتستكمل المخازن المؤقتة أو وسائل الإعلام المستخدمة في نضح، والهضم، كا 2 + تسامح، والطلاء والثقافة في بروتوكول الماوس مع غير محدد الإثارة، تقلص اقتران المانع، 2، 3 Butanedione monoxime (بي دي إم) لمنع الانكماش لعفوية، وبالتالي الجدوى والعائد من myocytes على شكل قضيب تحسن إلى حد كبير. في البروتوكول قدم هنا، يتم فصل myocytes في منطقة عازلة البوتاسيوم عالية من القلب معزولة عن طريق تعديل نضح Langendorff مع النوع الثاني كولاجيناز. كولاجيناز الثاني فواصل بفعالية أسفل المصفوفة بين الخلايا والخلايا النشرات. يبقي الحل نضح أيضا الأيض الخلوي عند مستوى منخفض 6. في additiعلى، ونظام القلب معزولة عن جهاز هارفارد كنا هنا هو مصممة تصميما جيدا لدرجة حرارة محددة وثابتة السيطرة على ضغط 7. ويوفر هذا النهج الاستعدادات تكرار للغاية والسكان موحدة من نوع خلية واحدة، والتي يمكن استخدامها في الثقافة بين عشية وضحاها لقياس إشارات البروتينات أو الثقافة 2-3 اليوم لفحوصات القلب الضخامي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
وقد تم كل البحوث التي أجريت على الفئران وفقا للإجراءات ومبادئ توجيهية من المعاهد الوطنية للصحة، وتمت الموافقة على البروتوكولات من قبل اللجنة المؤسسية رعاية الحيوان واستخدام جامعة توليدو، كلية الطب وعلوم الحياة.
1. الإرواء تحضير النظام
- قبل يوم من العزلة، وملء نظام الارواء بأكمله (بما في ذلك الخزانات) مع حل سريع قلوية خالية من بقايا المنظفات. يسمح الحل لنقع في النظام لبضع ساعات أو بين عشية وضحاها.
- في صباح اليوم التالي، وضبط درجة حرارة thermocycler إلى 37 درجة مئوية، والسماح للحل لالاحماء. إزالة الحل المنظفات وطرد النظام جيدا بالماء المقطر المعقم. لا ننسى كل الأفرع الجانبية.
- ملء النظام مع العازلة نضح عبر مضخة تحوي المستمر ورسم فقاعات الهواء من أي من الغرفة الشريان الأورطي (فخ فقاعة) مع حقنة الجانب محمولة لحمايةالقلب من انسداد الشريان التاجي. يجب فحص معدل تدفق المضخة تحوي بشكل روتيني.
2. إعداد المخازن، الثقافة وسائل الإعلام، وأطباق
- نضح العازلة: تقديم 500 مل من 1X العازلة نضح قبل استخدامها. هذا المخزن المؤقت خالية من الكالسيوم يحتوي على 113 ملي مول كلوريد الصوديوم، 4.7 ملي بوكل، 0.6 ملي KH 2 PO 4، 0.6 ملي نا 2 هبو 4، 1.2 ملي MgSO 4، 10 ملي نا HEPES، 12 مم 3 NaHCO، 10 ملي KHCO 3، 0.032 ملي الفينول الأحمر، 30 ملي التورين، 10 ملي BDM، و 5.5 ملي الجلوكوز. ضبط الرقم الهيدروجيني إلى 7.0 مع حمض الهيدروكلوريك 2 M وتصفية من خلال مرشح 0.2 ميكرون، المحل في 4 درجات مئوية.
ملاحظة: أ) ينبغي إعداد حل نضح في نفس اليوم الذي يتم استخدامه. في بعض الحالات، كان مقبولا لتخزين حل لأقل من 3 أيام في 4 درجات مئوية. ب) هذا المخزن المؤقت يحتوي على نسبة البوتاسيوم عالية تصل إلى 15.3 ملم، والتي يمكن أن تبقي على العضلية هادئة، والحد من ATP جonsumption وزيادة القدرة كا 2 +-تسامحا. - الهضم العازلة (300 U / مل، 25-50 مل / قلب): إعداد فقط قبل التروية. تزن 15،000 U من النشاط الكلي للنوع الثاني كولاجيناز، تذوب في 50 مل العازلة نضح في الثقافة غطاء محرك السيارة. إضافة 25 ميكرولتر من 100 مم CaCl 2 (محلول المخزون، فلتر تعقيم) لجعل تركيز الكالسيوم النهائي 50 ميكرومتر. تدفئة العازلة إلى 37 درجة مئوية عندما تصبح جاهزة للعزلة. على عكس التربسين، كولاجيناز يعمل بشكل أفضل في وجود 50-100 ميكرومتر كا 2 +.
- توقف مؤقت (50 مل / قلب): تعمل في الثقافة غطاء محرك السيارة. خلط 45 مل من العازلة نضح مع 5 مل العقيمة FBS.
- كا 2 + الحل الأول (12.5 ميكرومتر كا 2 +): إضافة 2.5 ميكرولتر من 100 مم CaCl 2 إلى 20 مل من العازلة وقف والمزيج.
- كا 2 + حل ثانيا (100 ميكرومتر كا 2 +): إضافة 10 ميكرولتر من 100 مم CaCl 2 إلى 10 مل من العازلة وقف والمزيج.
- كا 2 + حل ثالثا (400 ميكرومتر كا 2 +): إضافة 40 ميكرولتر من 100 مم CaCl 2 إلى 10 مل من العازلة وقف والمزيج.
- كا 2 + حل رابعا (900 ميكرومتر كا 2 +): إضافة 90 ميكرولتر من 100 مم CaCl 2 إلى 10 مل من العازلة وقف والمزيج.
- الطلاء المتوسطة (50 مل / قلب): نقل 43 مل من MEM تحتوي على 2 مم L-الجلوتامين و1.26 مم CaCl 2 في أنبوب مخروطي 50 مل العقيمة في الثقافة غطاء محرك السيارة وإضافة 5 مل من FBS، 1 مل من محلول المخزون BDM ( 500 ملم، فلتر تعقيم)، و 0.5 مل البنسلين / الستربتوميسين (10،000 U / مل). خلط وتتوازن لمدة 2-3 ساعة قبل خلية عضلية العزلة في 2٪ CO 2، 37 ° C حاضنة مع أغطية فضفاضة. الحق قبل الطلاء خلية عضلية، إضافة 0.5 مل من 200 ملي ATP (الرقم الهيدروجيني 7.2، حل الأسهم، فلتر تعقيم) في المتوسط.
- مستنبت (50 مل / قلب): نقل 48 مل من MEM تحتوي على 2 مم L-الجلوتامين و1.26 مم CaCl 2 في أنبوب مخروطي 50 مل العقيمة في الثقافة غطاء محرك السيارة وإضافة 1 مل من محلول المخزون BDM (500 ملي، الأنظفص تعقيمها)، و 0.5 مل البنسلين / الستربتوميسين (10،000 U / مل). خلط وتتوازن في 2٪ CO 2، 37 ° C الحاضنة قبل خلية عضلية العزلة. قبل استخدامها، إضافة 0.5 مل من 100 ملغ / مل BSA (فلتر تعقيم) في المتوسط.
ملاحظة: استخدام 2٪ CO 2 حاضنة يسهل الحفاظ على درجة الحموضة في مستنبت 6،9-7،0، مما يساعد على الحفاظ على myoctyes التشكل على شكل قضيب على ما يصل إلى 24 ساعة. - Laminin (1-2 ميكروغرام / سم 2) الأطباق المغلفة أو لوحات: نقل 200 ميكرولتر من 1 ملغ / مل laminin الماوس الطبيعي إلى 20 مل من برنامج تلفزيوني تعقيمها (ث / س الكالسيوم والمغنيسيوم) والمزيج. إضافة 1 مل إلى أطباق 35 ملم، و 2.5 مل إلى أطباق 60 ملم، أو 5 مل إلى الأطباق 100 ملم، يهز لتغطية السطوح بالتساوي، ومكان في 2٪ CO 2، 37 ° C الحاضنة حتى الطلاء خلية عضلية.
ملاحظة: إذا لم يتم استخدام الأطباق أو لوحات في اليوم المغلفة، فإنها يمكن أن تكون مختومة مع parafilm وتخزينها في 4 درجات مئوية خلال الليل (طلاء البطيء). الختم هو REQUIRED لمنع التبخر والتلوث. يمكن أن تظل لوحات المغلفة في 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى 1 في الاسبوع.
3. إزالة ماوس القلب والقسطرة
- نقع مقص وملقط في الايثانول 70٪ لمدة 30 دقيقة والسماح لهم الجافة.
- تزن الماوس إلى أقرب 0.1 جرام. تسجيل زنه الجسم، والضغط، والجنس، وتاريخ الميلاد.
- ضخ 200 ميكرولتر الهيبارين (100 وحدة دولية / الماوس) الملكية الفكرية 10 دقيقة قبل التخدير لمنع تخثر الدم في الشرايين التاجية. تخدير الفأر مع 200 ملغم / كغم من وزن الجسم من الكيتامين و 10 ملغم / كغم من وزن الجسم عن طريق الحقن من زيلازين الملكية الفكرية والانتظار لمدة 5-10 دقائق حتى يتوقف الماوس الاستجابة لالقرصات الذيل / اصبع القدم.
- تأمين الماوس في موقف ضعيف عن طريق تحديد بلطف الأرجل الأمامية وhindpaws على سطح العمل pinnable (أي الستايروفوم) على علبة جراحة الحيوان أو الجدول مقاعد البدلاء بالقرب من نظام الارواء.
- مسح الصدر والبطن مع الايثانول 70٪. جعل خط الوسط ط الجلدncision من منتصف البطن إلى الحجاب الحاجز مع مقص جراحي.
- قطع الحجاب الحاجز مع مقص جراحي آخر، والاستمرار على القص مع ملقط مسنن المنحني. قطع الثنائي وretroflect القفص الصدري لفضح القلب.
- رفع القلب قليلا باستخدام ملقط مسنن وارضحي المنحنية الدقيقة وتشريح القلب من تجويف الصدر أقرب ما يمكن إلى الظهرية الجدار الصدري.
- نقل القلب إلى طبق 100 ملم تحتوي على العازلة نضح الباردة. تقليم بعناية بعيدا عن الأنسجة الضامة مثل الرئتين والغدة الصعترية، والشعب الهوائية.
- تحديد الشريان الأورطي وفروعه في الجمجمة، التي خبأتها عادة عن طريق الغدة الصعترية وسادة من الدهون. قطع الشريان الأورطي أدناه أول فرع له 13، فهم جدار الشريان الأورطي، ورفع القلب، وينخفض بعض الشيء على لنضح مملوءة بسائل قنية الأبهر (1.0 مم OD الفولاذ المقاوم للصدأ قنية مع طرف والشقوق حادة / شقة 1 و 2 مم فوق غيض؛ أو 22 G التغذية قابلة لإعادة الاستخدام إبرة) باستخدام اثنين فائقة و غرامة غيضorceps.
ملاحظة: أ) السوائل نضح ينبغي أن يقطر خلال القسطرة القلبية لمنع فقاعات الغاز من الدخول إلى الشرايين التاجية؛ ب) الحفاظ على غيض من قنية فقط فوق الصمام الأبهري. - المشبك الشريان الأورطي إلى قنية وligate الشريان الأورطي إلى قنية مع 6-0 الحرير الجراحية. والقسطرة كله ينبغي أن تأخذ أقل من 120 ثانية.
4. الإرواء القلب والهضم
- يروي القلب مع خالية من الكالسيوم العازلة نضح في معدل تدفق 4 مل / دقيقة حوالي 4-5 دقائق حتى تصبح النفايات السائلة واضحة، ثم التبديل إلى العازلة الهضم تحتوي على 50 ميكرومتر و CaCl 2 ويروي عن 3،5 حتي 20 دقيقة اعتمادا على سلالة الماوس، ضغط التروية والنشاط كولاجيناز. إن وجدت، وزيادة ضغط الشريان الأورطي إلى 70-80 ملم زئبقي عند هضم. عند الضرورة، يمكن تعميمها انزيم سائل الإرواء لعملية الهضم. عادة، سوف العازلة 300 U / مل انزيم هضم القلب في 10-12 دقيقة بمعدل تدفق 4 مل / دقيقة؛إذا الضغط على حمولة تلوية 70 ملم زئبقي، و300 U / مل يستغرق سوى دقيقة 3.5-5.5 بمعدل تدفق 4 مل / دقيقة.
- وقف الهضم عندما يصبح القلب شاحب قليلا ومترهلة. ينبغي أن يكون الاسفنجية عندما مقروص بلطف.
5. خلايا التفكك وإعادة الكالسيوم
- سحب الشريان الأورطي من قنية مع 70٪ ملقط غارقة الإيثانول ووضع القلب في العقيمة 60 ملم صحن يحتوي على 2.5 مل العازلة الهضم. الانتقال إلى الثقافة هود باستخدام إمدادات العقيمة، والبقاء تضع في اعتبارها تقنيات عقيمة لهذا وخطوات المتابعة.
- إزالة الشريان الأورطي، الأذينين، والأوعية الدموية الكبرى مع مقص جراحي غرامة. ندف بلطف البطين إلى 10-12 قطعة صغيرة مع اثنين من ملقط غرامة غيض.
- ماصة بلطف القطع القلب وخلايا صعودا وهبوطا ~ 10X مع ماصة نقل 10 مل ثم نقل إلى 15 مل أنبوب البولي بروبلين المخروطية. شطف الطبق مع 7.5 مل من محلول الكالسيوم أنا تحتوي على 12.5 ميكرومتر و CaCl 2 و نقلهذا في أنبوب، مما أدى إلى الحجم النهائي من 10 مل.
- ماصة بلطف تعليق الخلية صعودا وهبوطا باستخدام ماصة نقل غرامة طرف لتفريق قطعة كبيرة من أنسجة القلب.
- ثم الطرد المركزي لمدة 3 دقائق في 20 x ج لفصل خلايا صغيرة غير العضلية مثل الخلايا البطانية والخلايا الليفية.
- نضح قبالة طاف و resuspend بيليه خلية عضلية في 10 مل من محلول الكالسيوم أنا مع ملحق من 100 ميكرولتر من 200 ملي ATP (الرقم الهيدروجيني 7.2، حل الأسهم، فلتر تعقيم). ترك أنبوب في غطاء محرك السيارة لمدة 3-5 دقيقة.
- نقل مكررة مأخوذة 10 ميكرولتر لعدادة الكريات لحساب myocytes قضيب على شكل وجولة. حساب العدد الإجمالي للmyocytes وحساب النسبة المئوية من myocytes على شكل قضيب.
- أجهزة الطرد المركزي في myocytes لمدة 3 دقائق في 20 × ز. إزالة طاف و resuspend الكريات في 10 مل من الكالسيوم الحل الثاني يحتوي على 100 ميكرومتر و CaCl 2. تفريق myocytes مع نقل ماصة غرامة غيض من قبل pipettingصعودا وهبوطا.
- كرر الخطوة أعلاه (5.8) باستخدام محلول الكالسيوم الثالث (400 ميكرومتر و CaCl 2) والرابع (900 ميكرومتر و CaCl 2)، على التوالي.
- للثقافة الابتدائي الماوس خلية عضلية، resuspend الكرية خلية عضلية النهائي في 5 مل من تصفيح المتوسط. عد عدد من myocytes وحساب النسبة المئوية من myocytes على شكل قضيب.
6. خلية ثقافة
- ضبط تركيز myocytes على شكل قضيب إلى 25،000 على شكل قضيب myocytes / مل في أنبوب 50 مل. ماصة بلطف myocytes باستخدام ماصة 10 مل بتعليق بشكل جيد. تجنب الترسيب خلية في ماصة وأنبوب لضمان كثافة الخلية متساوية لكل طبق أو لوحة.
- بعد الشفط قبالة حل laminin طلاء، لوحة للmyocytes في تلك الأطباق أو لوحات. الشريحة بلطف الأطباق أو لوحات الأمام وثلاث إلى أربع مرات إلى الوراء وجنبا إلى جنب في مثل الصليب نمط على السطح من الثقافة هود.
- وضع الأطباق أو لوحات في CO 2٪2 حاضنة عند 37 درجة مئوية. احتضان لمدة 1-3 ساعة للسماح للمرفق خلية عضلية بمعدل حوالي 80٪.
- بعد التعلق، ونضح بلطف المتوسطة التي تحتوي على myocytes غير مرتبط والحطام الخلية. بلطف إضافة مستنبت على الجانبين من الأطباق أو لوحات. تنفيذ هذا التغيير متوسطة واحدا تلو الآخر. العودة فورا الأطباق أو لوحات الحاضنة.
- بعد O / N الثقافة وmyocytes يمكن تغييرها لنفس سيط وبدون BDM قبل دراسات إشارة الخلية على المدى القصير. الحفاظ على BDM في الثقافة على المدى الطويل لفحوصات الضخامي أو موت الخلايا المبرمج.
ملاحظة: BDM (2،3-butanedione monoxime) يمكن أن تمنع الميوسين-أتباز ومنع الانكماش. تثبيط لها من الانكماش القائم على الميوسين هو عكسها بسهولة. وتفيد التقارير أن BDM قد يكون لها بعض الآثار الجانبية المحتملة، مثل القيام بدور الفوسفاتيز غير محددة، وزيادة الكالسيوم من الإفراج ريال، وتغيير التركيز الخالي الكالسيوم وPROPE الكهربائية الخلويةrties، وذلك قبل العلاج، يجب إزالة BDM. علاوة على ذلك، في بعض الحالات، يمكن أن محددة الميوسين الثاني المانع Blebbistatin تكون بديلة لمنع المخدرات cardiomyocyte الانكماش 8،9. ومع ذلك، في قضايانا، BDM أفضل من Blebbistatin من أجل نوعية وكمية العضلية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
1. الناجحة عزل الكمي
وتستخدم معيارين لقياس نجاح العزلة: أولا، عدد العضلية معزولة، والثانية، ونسبة على شكل قضيب الكالسيوم متسامحة لتقريب myocytes غير متسامح. عموما هذا البروتوكول يستغرق حوالي 75-90 دقيقة من القلب إلى إزالة الطلاء خلية عضلية وغلة حوالي 1 مليون العضلية على شكل قضيب (70-90٪ من إجمالي myocytes المقطوع) من واحد قلب فأر بالغ. و يمكن أن يختلف مع الماوس وزن الجسم والسلالة. عادة، 0،7-1،0 مليون myocytes على شكل قضيب يمكن جمعها من ~ 25 ز C57BL/6J الماوس، 1،2-1٬600٬000 myocytes على شكل قضيب من ~ 35 غ أسود الماوس السويسرية، و0،7-1200000 myocytes على شكل قضيب يمكن يتم جمعها من ~ 30 ز نا / K-أتباز متخالف (α1 S / R) أو 10 ~ 22 ز القلب محددة NCX-KO الماوس 11. myocytes معزولة وعادة ما يكون على شكل قضيب متميزة مع نهايات مستطيلة واضحة عبر التصدعات،هو مبين في الشكل 1.
2. تحديد وظيفة الخلية
وقد أظهرت البيانات المتوفرة لدينا في السابق بوضوح أن المثقف العضلية الفئران حديثي الولادة، و 100 ميكرومتر ابائين يمكن تنشيط PI 3 الفسفرة AKT K-تعتمد وحمل تضخم 12. لمزيد من تأكيد هذه النتائج في العضلية الماوس الكبار، والكبار C57BL/6J العضلية الماوس مثقف وتعامل مع ابائين. أرقام 2 و 3 تبين بوضوح أن ابائين يمكن زيادة الفسفرة AKT بطريقة تعتمد على الجرعة وحمل [3 H]-يسين التأسيس خلال تخليق البروتين.
الشكل 1. العضلية على شكل قضيب عادي من الماوس السويسري الأسود بعد ليلة وضحاهاالثقافة. تم تصويرها Myocytes في إطار المرحلة المجهري التباين باستخدام برنامج الصور.
الشكل 2. تفعيل AKT بواسطة ابائين في مثقف العضلية الكبار C57BL/6J الماوس. تعرضت Myocytes إلى 0-50 ميكرومتر ابائين لمدة 5 دقائق، ولست] ويعاير لفسفرته (سر 473) AKT (ف AKT) وAKT كتبها الغربية البقع. وكان كميا التنشيط كما فسفرته نسبة إلى إجمالي AKT (ن = 5-10). * P <0.05 مقابل السيطرة، ** P <0.01 مقابل السيطرة.
الرقم 3. Ouabaiن يحفز تخليق البروتين في مثقف العضلية الكبار C57BL/6J الماوس بعد الحرمان المصل 4 ساعة، تم علاج myocytes مع الشروط المشار إليها في وجود أو عدم وجود ابائين أو 100 نانومتر ET-1 (مراقبة إيجابية) مع [3 H] - يسين (1 μCi / مل) لمدة 12 ساعة. وقد عجلت لست] الخلوية مع 5٪ TCA ومعلق في 0.2 M NaOH/0.1٪ SDS، وكان يحسب النشاط الإشعاعي في عداد التلألؤ. تم حساب تخليق البروتين لكل عينة لCPM / ملغ من البروتين وتطبيع بالمقارنة مع السيطرة.
| الحل / العازلة | نضح العازلة | الهضم العازلة | وقف العازلة | كا 2 + الحل الأول | كا 2 + الحل الثاني | كا 2 + الحل الثالث | كا 2 + الحل الرابع |
| 113 | 113 | 113 | 113 | 113 | 113 | 113 | |
| بوكل، ملي | 4.7 | 4.7 | 4.7 | 4.7 | 4.7 | 4.7 | 4.7 |
| KH 2 PO 4، ملي | 0.6 | 0.6 | 0.6 | 0.6 | 0.6 | 0.6 | 0.6 |
| نا 2 هبو 4، ملي | 0.6 | 0.6 | 0.6 | 0.6 | 0.6 | 0.6 | 0.6 |
| MgSO4، ملي | 1.2 | 1.2 | 1.2 | 1.2 | 1.2 | 1.2 | 1.2 |
| نا HEPES، ملي | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 |
| NaHCO 3، مم | 12 | 12 | 12 | 12 | 12 | 12 | 12 |
| KHCO 3، ملي | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 |
| الفينول الأحمر، ميكرومتر | 32 | 32 | 32 | 32 | 32 | 32 | 32 |
| التورين، ملي | 30 | 30 | 30 | 30 | 30 | 30 | 30 |
| BDM، ملي | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 |
| الجلوكوز، ملي | 5.5 | 5.5 | 5.5 | 5.5 | 5.5 | 5.5 | 5.5 |
| FBS،٪ (ت / ت) | 0 | 0 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 |
| كولاجيناز الثاني، ملغ / مل | 0 | 1 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| و CaCl 2، ميكرومتر | 0 | 50 | 0 | 12.5 | 100 | 400 | 900 |
الجدول 1. حلول / مخازن للالعضلية الماوس الكبار العزلة.
| اسم | شركة | كتالوج # | إعداد | تخزين |
| مصل بقري جنيني (FBS) | أتلانتا Biolgoicals | S11550 | N / A | 25 مل مأخوذة في العقيمة 50 مل أنابيب في -20 درجة مئوية. |
| ألبومين المصل البقري (BSA) 100 ملغ / مل، 100X | سيغما | A7906 | 5 غ في 50 مل DIH 2 O، من خلال تصفية العقيمة 0.22 ميكرون حقنة معقمة وإلتر | 5 مل مأخوذة في العقيمة 15 مل أنابيب في -20 درجة مئوية. |
| و CaCl 2 100 ملم، 100X | سيغما | C4901 | 0.555 غرام في 50 مل DIH 2 O، وتصفية العقيمة من خلال مرشح 0.22 ميكرون معقمة المحاقن | 10 مل مأخوذة في العقيمة 15 مل أنابيب في درجة حرارة الغرفة. |
| Laminin 1 ملغ / مل، 100X | تقنيات الحياة | 23017-015 | N / A | 200 ميكرولتر مأخوذة في العقيمة 0.5 مل أنابيب microcentrifuge في -20 درجة مئوية. |
| 2،3-Butanedione monoxime (بي دي إم) 500 ملم، 50X | سيغما | B0753 | 1.01 غ في 20 مل BDM DIH 2 O، تعقيم الحل عن طريق الترشيح من خلال مرشح 0.22 ميكرون في غطاء محرك السيارة. | تخزين عند 4 درجات مئوية. |
| الأدينوزين ثلاثي الفوسفات-5'-ثنائي الصوديوم الملح (نا 2-ATP) 200 ملم، 100X | سيغما | A6419 | إضافة 5 مل DIH 2 Oحل 1 ز نا 2-ATP في 50 مل أنبوب الطرد المركزي، ثم استخدم 2 مول / لتر هيدروكسيد الصوديوم لضبط درجة الحموضة إلى 7.2 وجلب الحجم النهائي إلى 9 مل مع DIH 2 O. تعقيم الحل من خلال مرشح 0.22 ميكرون حقنة. | 0.5 مل مأخوذة في 1.5 مل أنابيب microcentrifuge العقيمة في -20 درجة مئوية. |
| كلوريد الصوديوم 3.77 M، 33.3x | سيغما | S7653 | 66 غ في 300 مل DIH 2 O | تخزين عند 4 درجات مئوية. |
| 470 ملي بوكل، 100X | فيشر العلمية | P217 | 3.5 غ في 100 مل DIH 2 O | تخزين عند 4 درجات مئوية. |
| KH 2 PO 4 60 ملي، 100X | سيغما | P5379 | 0.82 غ في 100 مل DIH 2 O | تخزين عند 4 درجات مئوية. |
| نا 2 هبو 4 60 ملي، 100X | سيغما | S0876 | 0.85 غ في 100 مل DIH 2 O | تخزين عند 4 درجات مئوية. |
| MgSO 4 120 ملم، 100X | سيغما | M-1880 | 3 غ في 100 مل DIH 2 O | تخزين عند 4 درجات مئوية. |
| HEPES 1 M، 100X | تقنيات الحياة | 15630-080 | N / A | تخزين عند 4 درجات مئوية. |
| NaHCO 3 600 ملم، 50X | سيغما | S6014 | 10.1 غرام في 200 مل DIH 2 O | تخزين عند 4 درجات مئوية. |
| KHCO 3 1 M، 100X | فيشر العلمية | P235 | 10.1 غرام في 100 مل DIH 2 O | تخزين عند 4 درجات مئوية. |
| الفينول الأحمر 3.2 ملم، 100X | سيغما | P5530 | 0.12 غ في 100 مل DIH 2 O | تخزين في درجة حرارة الغرفة. |
الجدول 2. الأسهم إعداد الحل والتخزين للماوس الكبار العضلية العزلة والثقافة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
للحصول على أفضل إعداد، الخطوات الأكثر أهمية هي: 1) ربط سرعان ما قلب الماوس إلى قنية بعد الاستئصال؛ 2) نضح القلب المناسبة. أيضا، لاحظ أن نوعية المياه ودرجة الحرارة التروية، ودرجة الحموضة من العازلة، والتعقيم، ونقاء الكيميائية، ونظيفة، وأنابيب وغرف غير الملوثة هي أيضا من العوامل الهامة. ينصح بشدة 18.2 mΩ البيولوجيا الجزيئية الصف H 2 O لإعداد العازلة. ينبغي تعديل درجة الحموضة من 200 ملي ATP محلول المخزون إلى 7.2، وهي خطوة غاب بسهولة.
فمن الضروري التعرف بسرعة على الشريان الأبهر وخفض أسفل أول فرع له كما يتضح من فلين 13. لكفاءة ربط المتابعة، وأوصى مناسب الحجم قنية الفولاذ المقاوم للصدأ مع الشقوق الصغيرة ومسننة عبر المشبك. بعد ربط، يجب غيض من قنية يكون فوق الصمام الأبهري من أجل مساعدة كولاجيناز التفاعل الكامل مع أنسجة القلب خلال الدورة التاجية. في بعض الأحيان، والعائد خلية كبيرة يبدو في البدايةولكن العديد من الخلايا هي جولة على شكل بعد خطوة التسامح الكالسيوم. تفسير واحد هو أن الدم متخثر في الأوعية قد لا تتم إزالة تماما من القلب، مما يؤدي إلى عدم كفاية الهضم. احتمال آخر هو أكثر الهضم من القلب. التعرض لفترات طويلة لكولاجيناز يقلل من خلية عضلية الكالسيوم التسامح 2. أثناء التفكك وإعادة الكالسيوم، فمن المهم أيضا للتعامل مع العضلية كما بلطف قدر ممكن للحفاظ على استمرارية خلية عضلية.
باختصار، ثقافة الكبار cardiomyocyte من الفئران المعدلة وراثيا هو أداة قوية للبحث في القلب. ومع ذلك، يجب العمل في المستقبل نأخذ في الاعتبار الفرق الجيني بين البشر والقوارض عند تفسير النتائج.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
يعلن الكتاب أنه ليس لديهم مصالح مالية المتنافسة.
Acknowledgments
وأيد هذا العمل من قبل القومي للقلب والرئة والدم المعهد منحة HL-36573. نشكر السيد ديفيد سوا لتحرير هذه المخطوطة.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Isolated heart system for small rodent | Harvard Apparatus | IHSR-mouse 73-4019 | |
| Aortic Cannula, OD 1.0 mm | Harvard Apparatus | 73-2816 | |
| Dumont #4 Forceps | Fine science tools | 11294-00 | |
| Straight sharp serrated scissors | Fine science tools | 14070-12 | |
| Serrated Graefe forceps | Fine science tools | 11050-10 | |
| Curved, serrated Graefe forceps | Fine science tools | 11052-10 | |
| Straight Mini Serrefines clamps | Fine science tools | 18054-28 | |
| MEM | Gibco | 11575-032 | |
| Collagenase II | Worthington | 4176 | |
| Mucosal universal detergent | Sigma | Z637181 | Mucasol is a fast alkaline residue-free detergent. |
References
- Louch, W. E., Sheehan, K. A., Wolska, B. M. Methods in cardiomyocyte isolation, culture, and gene transfer. J. Mol. Cell. 51, 288-298 (2011).
- Gross, D. R. Isolated heart preparations, problems, and pitfalls. In: Animal Models in Cardiovascular Research. Gross, D. R. , 3rd edition, Springer. 109-130 (2009).
- Schlüter, K. D., Piper, H. M. Isolation and culture of adult ventricular cardiomyocytes. Practical Methods in Cardiovascular Research. Dheim, S., Mohr, F. W., Delmar, M. , Springer. 557-567 (2005).
- O'Connell, T. D., Ni, Y. G., Lin, K. M., Han, H. P., Yan, Z. Isolation and culture of adult cardiac myocytes for signaling studies. AfCS research reports. 1 (5), 1-9 (2003).
- O'Connell, T. D., Rodrigo, M. C., Simpon, P. C. Isolation and culture of adult mouse cardiac myocytes. Methods in Molecular Biology. Vivanco, F. 35, Humana Press. 271-296 (2007).
- Nilolskaya, A., Sharma, V. Cell culture models and methods. Cardiac Electrophysiology Methods and Models. Sigg, D. C., Laizzo, P. S., Xiao, Y. F. , Springer. 213-235 (2010).
- Merx, M. W., Schrader, M. The working heart. Practical Methods in Cardiovascular Research. Dhein, S., Mohr, F. W., Delmar, M. , Springer-Verlag. Berlin Heidelberg, Germany. 173-189 (2005).
- Kabaeva, Z., Zhao, M., Michele, D. E. Blebbistatin extends culture life of adult mouse cardiac myocytes and allows efficient and stable transgene expression. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 294, 1667-1674 (2008).
- Lou, Q., Li, W., Efimov, I. R. The role of dynamic instability and wavelength in arrhythmia maintenance as revealed by panoramic imaging with blebbistatin vs. 2,3-butanedione monoxime. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 302, 262-269 (2012).
- Liu, C. X., et al. Reduction of Na/K-ATPase potentiates Marinobufagenin-induced cardiac dysfunction and myocyte apoptosis. J. Biol. Chem. 287 (20), 16390-16398 (2012).
- Bai, Y., et al. Different roles of the cardiac Na+/Ca2+-exchanger in ouabain-induced inotropy, cell signaling, and hypertrophy. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 304, 427-435 (2013).
- Liu, L. J., Zhao, X. C., Pierre, S. V., Askari, A. Association of PI3K-AKT signaling pathway with digitalis-induced hypertrophy of cardiac myocytes. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 293, 1489-1497 (2007).
- Flynn, J. M., Santana, L. F., Melov, S. Single Cell Transcriptional Profiling of Adult Mouse Cardiomyocytes. J. Vis. Exp. (58), (2011).
