Summary
Se describe un método fiable para el aislamiento de cardiomiocitos de ratón adulto. Este protocolo se obtiene un resultado coherente para el cultivo de cardiomiocitos adultos funcionales a partir de una variedad de ratones modificados genéticamente.
Abstract
Los avances tecnológicos han hecho que los ratones modificados genéticamente, incluidos los ratones transgénicos y knockout de genes, una herramienta esencial en muchos campos de investigación. Cardiomiocitos adultos son ampliamente aceptados como un buen modelo para la fisiología celular cardiaca y la fisiopatología, así como para la intervención farmacéutica. Ratones genéticamente modificados se oponen a la necesidad de complicados procesos de infección de cardiomiocitos para generar el genotipo deseado, que son ineficientes debido a la diferenciación terminal de los cardiomiocitos. Aislamiento y cultivo de alta cantidad y calidad de los cardiomiocitos funcionales se beneficiarán de manera espectacular la investigación cardiovascular y proporcionar una herramienta importante para la señalización celular investigación transducción y desarrollo de fármacos. Aquí se describe un método bien establecido para el aislamiento de cardiomiocitos adultos de ratón que se pueden implementar con poco entrenamiento. El corazón de ratón se escinde y se canuló a un sistema de corazón aislado, perfundido a continuación, con un p-calcio libre y de altootassium tampón seguido por digestión con colagenasa tipo II en el modo de perfusión retrógrada de Langendorff. Este protocolo produce un resultado coherente para la recogida de los cardiomiocitos de ratón adulto funcionales de una variedad de ratones modificados genéticamente.
Introduction
Los cardiomiocitos no son proliferativa. Hay algunas líneas celulares de cardiomiocitos auriculares, como HL-1 y las células AT-1 derivadas de tumores de ratón auricular; Sin embargo, no hay ventriculares adultos líneas celulares de cardiomiocitos disponibles para la investigación. Cultivos celulares primarios de cardiomiocitos de ratón adulto proporcionan un poderoso modelo para la investigación del corazón en los niveles celulares y moleculares. Hasta la fecha, se han utilizado ampliamente para la bioquímica, fisiológica, farmacológica y la investigación 1. Además, el uso frecuente de ratones modificados genéticamente ha requerido métodos eficaces de aislamiento de cardiomiocitos. Cultivo puro permite condiciones libres de la interacción con otros órganos y la circulación sistémica, tales como a través de factores neurohormonales y similares a las hormonas endógenas 2,3. Sin embargo, el aislamiento exitoso de los cardiomiocitos puede ser un reto.
El protocolo introducimos en este documento se basa en nuestras experiencias con adultos cardiomyocyt rataES y el método descrito por O'Connell et al 4,5. Especialmente en 2007 5, se describen técnicas detalladas a partir de preparaciones de amortiguamiento a cultivo celular y ensayo funcional. Desde los miocitos del ratón son altamente susceptibles a la contractura en comparación con los cardiomiocitos de rata, los tampones o medios utilizados para la perfusión, la digestión, Ca 2 + la tolerancia, la galvanoplastia y la cultura en el protocolo de ratón se complementan con un inhibidor de acoplamiento excitación-contracción no específica, 2, 3-Butanedione monoxima (BDM) para inhibir su contracción espontánea, por lo tanto, la viabilidad y el rendimiento de los miocitos en forma de varilla mejorar significativamente. En el protocolo presentado aquí, los miocitos se separan en un tampón de alto contenido de potasio desde el corazón aislado por perfusión de Langendorff modificada con colagenasa tipo II. La colagenasa II rompe con eficacia por la matriz intercelular y de las células libera. La solución de perfusión también mantiene el metabolismo celular en un nivel bajo 6. En additiencendido, el sistema del corazón aislado de Harvard Apparatus utilizamos aquí está bien diseñado para la temperatura precisa y control de presión constante 7. Este enfoque proporciona preparaciones altamente reproducibles y poblaciones uniformes de solo tipo de células, que se puede utilizar en cultivo durante la noche para la medición de las proteínas de señalización o de cultivo de 2-3 días para los ensayos de hipertróficas cardíacos.
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Protocol
Todas las investigaciones con ratones se hizo de acuerdo a los procedimientos y directrices de los Institutos Nacionales de Salud, y los protocolos fueron aprobados por el Comité Institucional Cuidado de Animales y el Empleo de la Universidad de Toledo, Facultad de Medicina y Ciencias de la Vida.
1. Perfusión de preparación del sistema
- El día antes del aislamiento, llenar todo el sistema de perfusión (incluyendo depósitos) con una solución de detergente libre de residuos alcalina rápida. Deje que la solución penetre en el sistema durante unas horas o toda la noche.
- A la mañana siguiente, ajustar la temperatura del termociclador a 37 ° C y deje que la solución se caliente. Retire la solución de detergente y lave el sistema a fondo con agua destilada esterilizada. No se olvide de todas las ramas laterales.
- Llenar el sistema con tampón de perfusión a través de una bomba peristáltica constante y dibujar cualquier burbuja de aire fuera de la cámara de la aorta (trampa de burbujas) con una jeringa de montaje lateral para protegerel corazón de la oclusión coronaria. La velocidad de flujo de la bomba peristáltica se debe comprobar rutinariamente.
2. Preparación de Soluciones, Medios de cultivo, y Platos
- Tampón de perfusión: Hacer 500 ml de tampón de perfusión 1x antes de su uso. Este tampón libre de calcio contiene NaCl 113 mM, 4,7 mM de KCl, 0,6 mM KH 2 PO 4, 0,6 mM de Na 2 HPO 4, 1,2 mM de MgSO4, 10 mM de Na-HEPES, 12 mM de NaHCO3, 10 mM de KHCO3, 0,032 fenol mM de rojo, taurina 30 mM, 10 mM de BDM, y glucosa 5,5 mM. Ajustar el pH a 7,0 con HCl 2 M y se filtra a través de un filtro de 0,2 micras, se almacenan a 4 ° C.
Nota: a) La solución de perfusión debe prepararse en el mismo día cuando se utiliza. En algunos casos, es aceptable para almacenar la solución durante menos de 3 días a 4 ° C. b) Este tampón tiene una concentración elevada de potasio hasta 15,3 mM, que puede mantener a los cardiomiocitos de reposo, reducir ATP consumption y aumentar la Ca 2 +-capacidad tolerante. - Tampón de digestión (300 U / ml, 25-50 ml / corazón): preparar justo antes de la perfusión. Pesar 15,000 U de la actividad total de la colagenasa tipo II, se disuelven en 50 ml de tampón de perfusión en campana de cultivo. Añadir 25 l de CaCl2 100 mM (solución madre, filtra esterilizada) para hacer que la concentración final de calcio 50 mM. Calentar el tampón a 37 ° C cuando esté listo para el aislamiento. A diferencia de la tripsina, colagenasa funciona mejor en presencia de 50-100 mM Ca 2 +.
- Detener Buffer (50 ml / corazón): Operar en campana de cultivo. Mezclar 45 ml de tampón de perfusión con 5 ml estéril FBS.
- Ca 2 + solución I (12,5 mM Ca 2 +): Añadir 2,5 l de 100 mM CaCl2 a 20 ml de tampón de parada y mezclar.
- Ca 2 + solución II (100 mM Ca 2 +): Añadir 10 l de 100 mM CaCl 2 y 10 ml de tampón de parada y mezclar.
- Ca 2 + solución III (400 mM Ca 2 +): Añadir 40 l de 100 mM CaCl 2 y 10 ml de tampón de parada y mezclar.
- Ca 2 + solución IV (900 mM Ca 2 +): Añadir 90 l de 100 mM CaCl 2 y 10 ml de tampón de parada y mezclar.
- Plating medio (50 ml / corazón): Transferencia de 43 ml de MEM que contiene 2 mM de L-glutamina y 1,26 mM de CaCl2 en un tubo cónico de 50 ml estéril en campana de cultivo y añadir 5 ml de FBS, 1 ml de la solución madre BDM ( 500 mM, esterilizado por filtración), y 0,5 ml de penicilina / estreptomicina (10.000 U / ml). Mezclar y equilibrar durante 2-3 horas antes del aislamiento de miocitos en 2% de CO 2, 37 ° C incubadora con las tapas flojas. Justo antes de chapado de los miocitos, añadir 0,5 ml de 200 mM ATP (pH 7.2, solución madre, filtra esterilizada) en el medio.
- El medio de cultivo (50 ml / corazón): Transferencia 48 ml de MEM que contiene 2 mM de L-glutamina y 1,26 mM de CaCl2 en un tubo cónico de 50 ml estéril en campana de cultivo y añadir 1 ml de solución madre BDM (500 mM, filteR esterilizado), y 0,5 ml de penicilina / estreptomicina (10.000 U / ml). Mezclar y equilibrar en 2% de CO 2, 37 ° C incubadora antes del aislamiento de los miocitos. Antes de usar, añadir 0,5 ml de 100 mg / ml de BSA (esterilizado por filtración) en el medio.
Nota: El uso de un 2% de CO 2 incubadora facilita el mantenimiento del medio de cultivo a pH 6,9 a 7,0, lo que ayuda a los myoctyes mantienen su morfología en forma de barra de hasta 24 horas. - Laminina (1-2 mg / cm 2) platos o placas recubiertas con: Transferencia de 200 l de 1 mg / ml de laminina de ratón natural 20 ml de PBS esterilizado (w / o calcio y magnesio) y mezclar. Añadir 1 ml a los platos de 35 mm, 2,5 ml a 60 mm platos, o 5 ml de platos de 100 mm, agite para cubrir uniformemente la superficie, y el lugar en el 2% de CO2, 37 ° C incubadora hasta chapado miocitos.
Nota: Si los platos o placas no se utilizan en el día recubiertos, pueden ser selladas con Parafilm y se almacenan a 4 ° C durante la noche (Coating Lento). El sellado es requIRED para evitar la evaporación y la contaminación. Las placas recubiertas se pueden mantener a 4 ° C durante un máximo de 1 semana.
3. Eliminación del corazón del ratón y Canulación
- Remoje las tijeras y pinzas en etanol al 70% durante 30 minutos y dejar que se sequen.
- Pesar el ratón para 0,1 gramos. Registre su peso corporal, cepa, sexo y fecha de nacimiento.
- Inyectar 200 l de heparina (100 UI / ratón) ip 10 minutos antes de la anestesia para prevenir la coagulación de la sangre en las arterias coronarias. Anestesiar el ratón con 200 mg / kg de peso corporal de ketamina y 10 mg / kg de peso corporal de xilazina por inyección ip y esperar 5-10 minutos hasta que el ratón deja de responder a pellizcos cola / del dedo del pie.
- Asegure el ratón en la posición supina, fijando suavemente las patas delanteras y las patas traseras a una superficie de trabajo pinnable (es decir, la espuma de poliestireno) en una bandeja de cirugía animal o banco de mesa cerca del sistema de perfusión.
- Limpie el pecho y el abdomen con etanol al 70%. Hacer una i la piel en la línea mediancision desde mediados abdomen para el diafragma con una tijera quirúrgica.
- Cortar el diafragma con otra tijera quirúrgica y mantenga el esternón con pinzas dentadas curvadas. Cortar bilateral y retroflect caja torácica para exponer el corazón.
- Levantar el corazón ligeramente usando pinzas finas dentadas y atraumáticas curvadas y diseccionar el corazón fuera de la cavidad torácica lo más cerca posible a la pared torácica dorsal.
- Transferir el corazón a un plato de 100 mm que contiene tampón de perfusión fría. Con cuidado y quitar los tejidos conectivos, como los pulmones, el timo y los bronquios.
- Identificar la aorta y sus ramas craneales, que generalmente se oculta por el timo y la almohadilla de grasa. Cortar la aorta por debajo de su primera sucursal 13, agarre la pared aórtica, levantar el corazón, y un poco meterlo en la cánula aórtica lleno de líquido de perfusión (1,0 mm de diámetro exterior de la cánula de acero inoxidable con punta roma y muescas / apartamento 1 y 2 mm por encima la punta, o una aguja de alimentación reutilizable 22) utilizando dos ultrafino-tip forceps.
Nota: a) El líquido de perfusión debe gotear durante la canulación cardíaca para evitar las burbujas de gas entren en las arterias coronarias; b) Mantenga la punta de la cánula justo por encima de la válvula aórtica. - Abrazadera de la aorta a la cánula y se liga la aorta a la cánula con 6-0 seda quirúrgica. Toda la canalización debe tener menos de 120 seg.
4. Corazón de perfusión y la digestión
- Perfusión el corazón con tampón de perfusión libre de calcio a un caudal de 4 ml / min 4-5 min hasta que los efluentes se aclaran, y luego cambiar a un tampón de digestión que contiene 50 mM de CaCl2 y perfundir durante 3,5 a 20 min dependiendo de la cepa de ratón, la presión de perfusión y la actividad de colagenasa. En su caso, aumentar la presión de la aorta hasta 70-80 mmHg durante la digestión. Cuando sea necesario, la enzima perfundido se puede recircular para la digestión. Típicamente, 300 tampón U / ml de enzima se digerir un corazón en 10-12 min a una velocidad de flujo de 4 ml / min;Si la aplicación de presión poscarga a 70 mmHg, 300 U / ml se llevarán a sólo 3.5 a 5.5 minutos a una velocidad de flujo de 4 ml / min.
- Detener la digestión cuando el corazón se vuelve un poco pálida y flácida. Debe ser esponjoso cuando se pellizca suavemente.
5. Las células de disociación y la reintroducción de calcio
- Tire de la aorta de la cánula con un 70% de etanol fórceps empapada y poner el corazón en un plato de 60 mm estéril que contiene 2,5 ml de tampón de digestión. Mover a la campana de cultivo usando suministros estériles, permaneciendo atentos a las técnicas estériles para esto y medidas de seguimiento.
- Retire aorta, aurículas y los grandes vasos con tijeras quirúrgicas finas. Burlarse suavemente el ventrículo hacia 10-12 pedazos pequeños con dos pinzas de punta fina.
- Pipetear suavemente las piezas del corazón y las células arriba y abajo ~ 10 veces con una pipeta de transferencia de 10 ml y luego se transfieren a un tubo cónico de polipropileno de 15 ml. Enjuague el recipiente con solución de 7,5 ml de calcio que contiene 12,5 mM CaCl2 y transferenciaesta en el tubo, lo que resulta en un volumen final de 10 ml.
- Pipetear suavemente la suspensión celular arriba y abajo con una pipeta de transferencia de punta fina para dispersar a los grandes trozos de tejido del corazón.
- Centrifugar a continuación durante 3 min a 20 xg para separar pequeñas células no miocitos, tales como células endoteliales y fibroblastos.
- Aspirar el sobrenadante y resuspender el sedimento de los miocitos en 10 ml de solución de calcio que con un suplemento de 100 l de ATP 200 mM (pH 7,2, solución madre, filtra esterilizada). Deje el tubo en la campana durante 3-5 minutos.
- Transferencia duplicar 10 alícuotas de un hemocitómetro contar miocitos y redondo en forma de barra. Calcular el número total de miocitos y calcular el porcentaje de miocitos en forma de varilla.
- Centrifugar los miocitos durante 3 min a 20 x g. Eliminar el sobrenadante y volver a suspender los sedimentos en 10 ml de solución de calcio II que contiene 100 mM de CaCl2. Dispersar los miocitos con la transferencia de pipeta de punta fina con la pipetaarriba y abajo.
- Repetir el paso anterior (5.8) utilizando solución de calcio III (400 mM de CaCl 2) y IV (900 mM de CaCl 2), respectivamente.
- Para el cultivo primario de miocitos ratón, resuspender el precipitado miocitos final en 5 ml de medio de baño. Contar el número total de miocitos y calcular el porcentaje de miocitos en forma de varilla.
6. Cultivo Celular
- Ajustar la concentración de los miocitos en forma de varilla a 25.000 en forma de varilla miocitos / ml en un tubo de 50 ml. Pipetear suavemente los miocitos con una pipeta de 10 ml de suspender bien. Evitar la sedimentación celular en la pipeta y el tubo para asegurar la densidad de células iguales para cada plato o plato.
- Después de aspirar fuera de la solución de revestimiento de la laminina, la placa de los miocitos en esos platos o placas. Deslice con cuidado los platos o placas adelante y hacia atrás y de lado a lado en un patrón de cruz tres a cuatro veces en la superficie de la campana de cultivo.
- Coloque los platos o placas en un CO 2%2 incubadora a 37 ° C. Incubar durante 1-3 horas para permitir la fijación de los miocitos a una velocidad de alrededor de 80%.
- Después de la unión, aspirar suavemente el medio que contenía miocitos solteras y restos celulares. Añadir suavemente medio de cultivo a los lados de los platos o placas. Lleve a cabo este cambio de medio, uno por uno. Inmediatamente devolver los platos o placas a la incubadora.
- Después de cultivo O / N, los miocitos se pueden cambiar para el mismo medio sin BDM antes de los estudios de la señalización celular a corto plazo. Mantenga la BDM en cultivo a largo plazo para los ensayos hipertróficas o apoptosis.
Nota: BDM (2,3-butanodiona monoxima) puede inhibir la miosina-ATPasa y evitar la contracción. Su inhibición de la contracción basado en la miosina es fácilmente reversible. Se informa que BDM puede tener algunos efectos secundarios potenciales, tales como actuar como una fosfatasa no específica, aumentando la liberación de calcio de los SR, y la alteración de la concentración de calcio libre y prope eléctrica celularrtes, por lo que antes del tratamiento, la BDM se debe quitar. Por otra parte, en algunos casos, un inhibidor específico Blebbistatin miosina II podría ser un medicamento alternativo para inhibir la contracción de los cardiomiocitos 8,9. Sin embargo, en nuestros casos, BDM es mejor que Blebbistatin por el bien de la calidad y cantidad de los cardiomiocitos.
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Representative Results
1. El éxito de cuantificación Aislamiento
Dos criterios se utilizan para cuantificar el éxito del aislamiento: en primer lugar, el número total de cardiomiocitos aislados, y en segundo lugar, la relación de los miocitos no tolerantes al calcio tolerantes a redondear con forma de bastón. Generalmente, este protocolo tiene alrededor de 75 a 90 min de la extirpación del corazón a la chapa de los miocitos y los rendimientos de alrededor de 1 millón de cardiomiocitos en forma de varilla (70-90% de los miocitos totales cosechadas) de un corazón de ratón adulto. Esto puede variar con el ratón el peso corporal y la tensión. Por lo general, 0,7 a 1,0 millones de miocitos en forma de bastón se pueden recoger de un ~ 25 g ratón C57BL/6J, desde 1,2 hasta 1,6 millones miocitos en forma de varilla de un ~ 35 g negro ratón Swiss, y 0,7-1.200.000 miocitos en forma de bastón puede ser recogido de un g de Na / K-ATPasa heterocigotos ~ 30 (α1 S / R) 10 o ~ 22 g cardiaca ratón NCX-KO específica 11. Miocitos aislados tienen normalmente una barra con forma distinta con extremos rectangulares y transparentes estrías cruzadas,se muestra en la Figura 1.
2. Función celular de identificación
Nuestros datos anteriores han demostrado claramente que, cultas cardiomiocitos de rata neonatal, 100 ouabain M puede activar PI 3 fosforilación Akt K-dependientes e inducir la hipertrofia 12. Para confirmar aún más estos resultados en cardiomiocitos de ratón adulto, cardiomiocitos C57BL/6J de ratón adulto se cultivaron y se trató con ouabaína. Las figuras 2 y 3 muestran claramente que la ouabaína puede aumentar la fosforilación de Akt en una manera dependiente de la dosis e inducir [3 H]-leucina incorporación durante la síntesis de proteínas.
Figura 1. Cardiomiocitos en forma de bastón normales de ratón Negro suizo después de una nochecultura. miocitos fueron fotografiados bajo un microscopio de contraste de fase, utilizando el software de fotos.
Figura 2. La activación de Akt por ouabaína en cultivos de cardiomiocitos adultos de ratón C57BL/6J. Los miocitos se expusieron a 0-50 ouabaína M durante 5 min, y los lisados se sometieron a ensayo para fosforilado (Ser 473) de Akt (P-Akt) y Akt por Western borrones. La activación se cuantificó como la relación de fosforilados a Akt total (n = 5-10). * P <0,05 frente a control, ** P <0,01 frente a control.
Figura 3. Ouabain estimula la síntesis de proteínas en cultivos de cardiomiocitos adultos C57BL/6J ratones Después de la privación de suero 4 horas, los miocitos se trataron con las condiciones indicadas en la presencia o ausencia de ouabain o 100 nM de ET-1 (control positivo) junto con [3 H]. - leucina (1 Ci / ml) durante 12 h. Los lisados celulares se precipitaron con TCA al 5% y se resuspendieron en 0,2 M NaOH/0.1% de SDS, y se contó la radiactividad en un contador de centelleo. Se calculó la síntesis de la proteína por muestra a cpm / mg de proteína y normalizada en comparación con el control.
| Solución / Buffer | Perfusión Buffer | Tampón de digestión | Tope | Ca 2 + solución I | Ca 2 + Solución II | Ca 2 + Solución III | Ca 2 + Solución IV |
| 113 | 113 | 113 | 113 | 113 | 113 | 113 | |
| KCl, mM | 4.7 | 4.7 | 4.7 | 4.7 | 4.7 | 4.7 | 4.7 |
| KH 2 PO 4, mM | 0.6 | 0.6 | 0.6 | 0.6 | 0.6 | 0.6 | 0.6 |
| Na 2 HPO 4, mM | 0.6 | 0.6 | 0.6 | 0.6 | 0.6 | 0.6 | 0.6 |
| MgSO4, se mM | 1.2 | 1.2 | 1.2 | 1.2 | 1.2 | 1.2 | 1.2 |
| Na-HEPES, mM | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 |
| NaHCO3 mM | 12 | 12 | 12 | 12 | 12 | 12 | 12 |
| KHCO3, mM | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 |
| El rojo fenol, M | 32 | 32 | 32 | 32 | 32 | 32 | 32 |
| La taurina, mM | 30 | 30 | 30 | 30 | 30 | 30 | 30 |
| BDM, mM | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 |
| Glucosa, mM | 5.5 | 5.5 | 5.5 | 5.5 | 5.5 | 5.5 | 5.5 |
| FBS,% (v / v) | 0 | 0 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 |
| La colagenasa II, mg / ml | 0 | 1 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| CaCl2, M | 0 | 50 | 0 | 12.5 | 100 | 400 | 900 |
Tabla 1. Soluciones / tampones para cardiomiocitos de ratón adulto aislamiento.
| Nombre | Empresa | De catálogo | Preparación | Almacenamiento |
| Suero fetal bovino (FBS) | Atlanta Biolgoicals | S11550 | N / A | 25 ml de alícuotas en tubos de 50 ml estériles a -20 ° C. |
| Albúmina de suero bovino (BSA) 100 mg / ml, 100x | Sigma | A7906 | 5 g en 50 ml DIH 2 O, filtra estéril a través de 0,22 micras jeringa estéril filter | 5 ml de alícuotas en tubos de 15 ml estériles a -20 ° C. |
| CaCl2 100 mM, 100x | Sigma | C4901 | 0,555 g en 50 ml DIH 2 O, y el filtro estéril a través de 0,22 micras filtro de jeringa estéril | 10 ml de alícuotas en tubos de 15 ml estériles a temperatura ambiente. |
| La laminina 1 mg / ml, 100x | Life technologies | 23017-015 | N / A | 200 alícuotas de 0,5 ml tubos de microcentrífuga estériles a -20 ° C. |
| 2,3-Butanedione monoxima (BDM) 500 mM, 50x | Sigma | B0753 | 1,01 g BDM en 20 ml diH 2 O, esterilizar la solución por filtración a través de 0,22 micras filtro de la campana. | almacenar a 4 ° C. |
| Sal disódica de adenosina-5'-trifosfato (Na 2-ATP) 200 mM, 100x | Sigma | A6419 | Añadir 5 ml diH 2 Opara disolver 1 g de Na 2-ATP en 50 ml tubo de centrífuga, a continuación, utilizar 2 mol / l de NaOH para ajustar el pH a 7,2 y llevar el volumen final a 9 ml con diH 2 O. esterilizar la solución por 0,22 micras filtro de jeringa. | Alícuotas de 0,5 ml en 1,5 ml tubos de microcentrífuga estériles a -20 ° C. |
| NaCl 3,77 M, 33.3x | Sigma | S7653 | 66 g en 300 ml diH 2 O | almacenar a 4 ° C. |
| KCl 470 mM, 100x | Fisher Scientific | P217 | 3,5 g en 100 ml de diH 2 O | almacenar a 4 ° C. |
| KH 2 PO 4 60 mM, 100x | Sigma | P5379 | 0,82 g en 100 ml de diH 2 O | almacenar a 4 ° C. |
| Na 2 HPO 4 60 mM, 100x | Sigma | S0876 | 0,85 g en 100 ml de diH 2 O | almacenar a 4 ° C. |
| MgSO4 120 mM, 100x | Sigma | M-1880 | 3 g en 100 ml de diH 2 O | almacenar a 4 ° C. |
| HEPES 1 M, 100x | Life technologies | 15630-080 | N / A | almacenar a 4 ° C. |
| NaHCO3 600 mM, 50x | Sigma | S6014 | 10,1 g en 200 ml diH 2 O | almacenar a 4 ° C. |
| KHCO3 1 M, 100x | Fisher Scientific | P235 | 10,1 g en 100 ml de diH 2 O | almacenar a 4 ° C. |
| Rojo de fenol 3,2 mM, 100x | Sigma | P5530 | 0,12 g en 100 ml de diH 2 O | almacenar a temperatura ambiente. |
Tabla 2. Stock preparación de la solución y el almacenamiento de los cardiomiocitos de ratón adulto aislamiento y cultivo.
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Discussion
Para la mejor preparación, los pasos más importantes son: 1) conectar rápidamente hasta el corazón del ratón a la cánula después de la escisión; 2) la perfusión del corazón apropiado. Además, tenga en cuenta que la calidad del agua, la temperatura de perfusión, el pH del tampón, la esterilización, la pureza química y limpia tubos y cámaras, no contaminados son también factores importantes. 18.2 mΩ biología molecular de grado H 2 O es muy recomendable para la preparación de buffer. El pH de la solución madre 200 mM de ATP se debe ajustar a 7,2, un paso que se pierde fácilmente.
Es esencial para identificar rápidamente la aorta y para cortar justo por debajo de su primera rama, como se muestra por Flynn 13. Para eficiente conexión, se recomienda una cánula de acero inoxidable de dimensiones adecuadas y con muescas y pequeña abrazadera transversal de sierra. Después de la ligación, la punta de la cánula debe estar por encima de la válvula aórtica con el fin de ayudar a la colagenasa interactuar plenamente con el tejido del corazón durante la circulación coronaria. A veces, el rendimiento celular parece grande inicialmentepero muchas células son después del paso de la tolerancia de calcio en forma de ronda. Una explicación es que la sangre coagulada en los vasos no se puede quitar completamente del corazón, que conduce a la digestión inadecuada. Otra posibilidad es sobre la digestión del corazón. La exposición prolongada a la colagenasa reduce miocitos calcio tolerancia 2. Durante la disociación y la reintroducción de calcio, también es importante manejar los cardiomiocitos tan suavemente como sea posible para mantener la viabilidad de los miocitos.
En resumen, la cultura de los cardiomiocitos adultos de ratones modificados genéticamente es una poderosa herramienta para la investigación cardiaca. Sin embargo, el trabajo futuro debe tener en cuenta la diferencia genética entre los humanos y los roedores al interpretar los resultados.
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Disclosures
Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por el Instituto Nacional del Corazón, los Pulmones y la Sangre de subvención HL-36573. Agradecemos al Sr. David Sowa para la edición de este manuscrito.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Isolated heart system for small rodent | Harvard Apparatus | IHSR-mouse 73-4019 | |
| Aortic Cannula, OD 1.0 mm | Harvard Apparatus | 73-2816 | |
| Dumont #4 Forceps | Fine science tools | 11294-00 | |
| Straight sharp serrated scissors | Fine science tools | 14070-12 | |
| Serrated Graefe forceps | Fine science tools | 11050-10 | |
| Curved, serrated Graefe forceps | Fine science tools | 11052-10 | |
| Straight Mini Serrefines clamps | Fine science tools | 18054-28 | |
| MEM | Gibco | 11575-032 | |
| Collagenase II | Worthington | 4176 | |
| Mucosal universal detergent | Sigma | Z637181 | Mucasol is a fast alkaline residue-free detergent. |
References
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